СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/84 

Изобретение относится к области медицины и может найти применение в медицинской практике для ускоренной диагностики дисбактериоза кишечника.

В настоящее время дисбактериозами кишечника поражено более 90% населения России, что стало национальной проблемой здравоохранения. Насущной задачей является "совершенствование диагностики дисбактериозов при различных патологических состояниях, с особым вниманием к разработке не только традиционных микробиологических, биохимических, клинических методов, но и простых экспрессных, экономичных и унифицированных методов" [Резолюция Всероссийской научно-практической конференции "Дисбактериозы и эубиотики" // Журнал микробиологии. - 1996, - №5, - с.124-125].

Известен ряд способов диагностики дисбактериоза кишечника.

Широко применяется бактериологический количественно-качественный метод Хенеля в различных модификациях. Метод позволяет непосредственно, путем посева на питательные среды определить состав микробного биоценоза и количество микробов каждого из выделенных видов. В России применяется расширенное бактериологическое исследование фекалий классическим способом с определением количества микробов выделенных видов и биологических свойств кишечной палочки [Эпштейн-Литвак Р.В., Вильшанская Ф.Л. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника. Методические рекомендации. М., - 1977. - 20 с].

Однако данный метод требует больших трудозатрат высококвалифицированного персонала, значительных средств на приобретение оборудования, набора питательных сред, реактивов, электрической и тепловой энергии, а также длительного времени на проведение исследования - не менее 7-10 дней. Согласно общепринятым рекомендациям число изучаемых показателей достигает 12-15 [Грачева Н.М., Гончарова Г.И., Аваков А.А. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Метод, рекомендации. - М., 1986].

Интерпретация результатов данного способа диагностики дисбактериоза может представлять определенные сложности ввиду того, что

1. Влажность фекалий различна (по общепринятой методике она не измеряется и поправка конечного результата с учетом влажности не производится) и, следовательно, результаты анализа жидких и плотных фекалий могут быть сравнимы между собой и с показателями нормы только условно, с неизвестной мерой неточности, ошибки. Например, в случае острых кишечных инфекций, когда фекалии жидкие с примесью слизи и крови, ошибка, очевидно, может быть очень большой.

2. Сам процесс разведения фекалий содержит в себе большую вероятность неточности, степень ее зависит от лаборанта-исполнителя и структуры фекальной массы, в свою очередь зависящей от характера питания, мощности переваривающих механизмов желудочно-кишечного тракта, регулярности стула. Например, не переваренная растительная клетчатка, занимающая иногда значительный объем и служащая матрицей для развития нормальной сахаролитической флоры, из исследования исключается.

3. Отождествление количества колониеобразующих единиц (КОЕ), обнаруженных на чашке с твердой питательной средой в 12-м разведении с цифрой 10 в 12-й степени, также не вполне корректно и основано на предположении, что в каждом последующем разведении остается точно одна десятая часть микробов.

Близким по методике, но суженным по спектру, является способ определения кишечного дисбиоза по дефициту бифидобактерий и обнаружению тканевого белка в кале, указывающего на возможное повреждение клеточных элементов кишечной стенки [Дорофейчук В.Г. и др. Ключевые тесты для определения кишечного дисбактериоза: Пристендовый листок ВДНХ СССР. - М., 1991]. Бактериологический компонент способа также трудоемок и дорог. Визуальная оценка степени просветления жидкости после осаждения растворимого белка не позволяет объективно оценить и стандартизировать результаты.

Остальные методы диагностики являются косвенными. Основанием для них служит изменение многих свойств микрофлоры кишечника при дисбактериозе (свойства адгезии, образование ферментов и витаминов, метаболизм, антагонизм и локализация в кишечнике).

Известен способ выявления дисбактериоза путем точного количественного определения летучих жирных кислот (ЛЖК) в фекалиях [Дубинин А.В., Ляховицкий Ю.И., Ардатская М.Д., Бабин В.Н. Исследование профиля летучих жирных кислот в кале при синдроме раздраженной толстой кишки. // Спорные, противоречивые и нерешенные вопросы в гастроэнтерологии. Обоснование клинического использования препарата нормазе. Труды конференции 20-22 мая 1993. Смоленск - Москва, 1993. - С.93-96]. Летучие жирные кислоты являются специфическим метаболитом нормальной сахаролитической, преимущественно анаэробной микрофлоры кишечника. Их количество адекватно отражает количество лактобактерий и бифидобактерий в пробе кала. Для реализации способа требуется уникальное дорогостоящее оборудование.

Известен способ диагностики дисбактериоза путем определения уровня водорода в выдыхаемом воздухе с помощью газового хроматографа, либо электрохимическим методом [Логинов А.С., Лорие А.Ю. и др. Диагностические возможности нового диагностического теста при заболеваниях кишечника - определения водорода в выдыхаемом воздухе // Тер. архив. - 1991. - №2 - С.74-76]. Способ основан на том, что единственным источником водорода в выдыхаемом воздухе является микрофлора желудочно-кишечного тракта. В случае повышенного содержания водорода натощак диагностируется микробное обсеменение желудка, при нагрузке лактулозой определяется скорость продвижения химуса по кишечнику (по времени подъема уровня водорода) и количество сахаролитической флоры в толстом кишечнике (по выраженности этого подъема).

Оба эти способа достаточно оперативны, но требуют наличия чрезвычайно дорогостоящей и редкой аппаратуры, давая приблизительные, неточные результаты. Кроме того, при значительном количестве микрофлоры в тонком кишечнике интерпретация результатов становится сложной и неоднозначной.

О состоянии кишечного биоценоза судят также по уровню других метаболитов кишечной микрофлоры: индикана, п-крезола и фенола в моче, метана в выдыхаемом воздухе, аммиака в крови, кале или в выдыхаемом воздухе [Тамм А.О. и др. Метаболиты кишечной микрофлоры в диагностике дисбиоза кишечника. // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - Т32, №3. - С.191-195]. Данные методы дают удовлетворительные результаты только при выраженном дисбалансе кишечной микрофлоры, также дороги и технологически сложны.

Известен также косвенный метод выявления дисбактериоза кишечника при помощи определения антагонистической активности (методом нанесения перпендикулярных штрихов) индикаторных микроорганизмов, выделенных из фекалий [Завгородняя Е.Ф. и др. Антагонистическая активность кишечной аутофлоры как косвенный метод выявления дисбактериоза кишечника. // Врачебное дело. - 1981. - №6. - С.113-116]. Длительность и трудоемкость исследования являются его недостатком - метод позволяет получить результат на четвертые сутки.

Предложено для экспресс-диагностики дисбактериоза кишечника определять количество нуклеазоположительных факультативно-анаэробных микроорганизмов, так как способность образовывать ферменты экзонуклеазы (ДНКаза, РНКаза) связана с патогенностью и вирулентностью микробов. У больных с дисбактериозами обсемененность испражнений нуклеазоположительными микроорганизмами в 71% случаев превышала допустимый уровень 2% (в среднем 51±5%), аналогичный показатель у 99% здоровых составил от 0 до 2% [Поликарпов Н.А., Викторов А.Н., Зубков М.Н. Обсемененность испражнений нуклеазоположительными бактериями как один из показателей дисбактериоза кишечника. //Лаб. дело. - 1990. - №1. - С.46-48]. Данное исследование продолжается не менее двух суток и требует применения специальных питательных сред с нуклеинатом натрия и ДНК, что является его недостатком.

Известен метод диагностики дисбактериоза по повышению уровня кишечных ферментов - энтерокиназы и щелочной фосфатазы, определяемых на фотоэлектроколориметре [Смирнова Т.В., Шамшонкова Т.П., Чебыкина Н.В. Косвенный метод выявления дисбактериоза кишечника. // Врачебное дело. - 1978. - №6. - С.90-92]. Метод доступен для практических лабораторий, но не дает возможности определить степень дисбактериоза и не может быть использован у новорожденных из-за незрелости их ферментных систем. Кроме того, достоверность метода (совпадение гиперферментоза и наличия дисбактериоза) не превышает 35-60%.

Более точен способ экспресс-диагностики дисбактериоза путем обнаружения β-аспаргилглицина в фекалиях методом высоковольтного электрофореза на бумаге [Чахава О.В., Рубан С.З., Шустрова Н.М.,. Юрьева Э.А. Экспрессная диагностика дисбактериоза путем β-аспаргилглицина в фекалиях в эксперименте. // Журн. микробиологии. - 1985. - №8. - С.15-18]. Однако для реализации этого метода необходима сложная дорогостоящая аппаратура и реактивы. Кроме того, метод разработан в эксперименте на животных, данные по определению (β-аспаргилглицина у людей отсутствуют.

Известен также способ диагностики кишечного дисбактериоза и кишечной инфекции путем определения антиинтерфероновой активности у колоний энтеробактерий в посеве фекалий на питательном агаре с препаратом человеческого лейкоцитарного интерферона [Патент РФ 2088938]. Способ позволяет установить степень, частоту встречаемости нового патологического свойства микрофлоры кишечника, приобретаемого ею при углублении дисбиотических сдвигов при дисбактериозе и, в особенности, при кишечных инфекциях, на основании этого судят об их наличии. Готовность результата на третий день. Способ для своего осуществления также требует значительных затрат труда квалифицированного персонала, бактериологического лабораторного оборудования, сред и реактивов.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения степени тяжести дисбактериоза кишечника у детей путем определения β-литической активности копрофильтратов фотонефелометрическим методом [Патент РФ 2027996], который доступен для выполнения в лабораториях городских больниц и позволяет определить степень дисбиоза.

К недостаткам метода можно отнести то, что он также достаточно трудоемок и дорог, так как включает пробоподготовку (растирание кала в ступке с кварцевым песком, отстаивание, центрифугирование), подготовку агаровой культуры сенной палочки, затем инкубирование и трехкратное определение оптической плотности растворов на фотоэлектроколориметре. Выдача ответа производится на второй день.

Трудоемкость, затратность и длительность выполнения делают метод неприемлемым для скрининга населения.

В основу изобретения положена задача создания способа первичной диагностики дисбактериоза кишечника, позволяющего сократить время исследования при снижении затрат.

Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики дисбактериоза кишечника, включающем исследование фекалий, по результатам которого судят о наличии дисбактериоза, согласно изобретению исследование осуществляют измерением рН фекалий, и при его значении более 6,8 судят о наличии дисбактериоза.

При этом измерение рН фекалий осуществляют прямым электрохимическим методом с помощью рН-метра.

Бифидобактерии и лактобациллы "закисляют" в процессе своего развития ту среду, на которой развиваются, вне зависимости от ее природы (молочная или углеводная), поэтому кислая реакция среды является их неотъемлемым родовым признаком, а следовательно, при достаточном развитии анаэробной флоры в толстом кишечнике (что является обязательным признаком эубиоза) реакция фекалий должна быть кислой. Следовательно, измерение показателя рН (кислой или щелочной реакции) фекалий позволяет определить наличие дисбактериоза, так как уровень рН неизбежно отражает степень развития в толстом кишечника человека анаэробной флоры, которая в норме составляет более 90% от всей микробной флоры толстого кишечника и посредством своих кислых метаболитов определяющим образом влияет на реакцию внутрикишечной среды.

На фиг.1 представлена зависимость концентрации бифидобактерий в фекалиях и рН фекалий;

на фиг.2 представлена зависимость концентрации лактобацилл в фекалиях и рН фекалий;

на фиг.3. представлена зависимость рН фекалий от концентрации в кале бифидум- и лактобактерий, выраженной в log КОЕ/мл.

Для построения графиков (фиг.1-фиг.3) проведено 219 развернутых микробиологических анализов кала на дисбактериоз и измерений рН фекалий.

Возраст обследованных колебался от 3-х месяцев до 70 лет. Среди них были здоровые лица, придерживающиеся общепринятого рациона, и вегетарианцы, дети и взрослые с дисбактериозами кишечника различной этиологии, с разными формами кишечных дисфункций, в том числе больные острыми кишечными инфекциями и реконвалесценты ОКИ. Статистическая обработка материала и построение графиков выполнены с помощью компьютерной программы Statistica-5.

Как видно из данных графиков (фиг.1 и фиг.2), количество анаэробов (лактобактерий и бифидобактерий) начинает увеличиваться при снижении рН фекалий менее 6,8, то есть "закислении" просвета толстого кишечника.

Концентрация эшерихий в кале практически не менялась при изменении фекальной рН.

В графике (фиг.3) по оси абсцисс в одном масштабе от 0 до 14 даны рН фекалий и десятичный логарифм из концентрации анаэробных бактерий в фекалиях, а по оси ординат - порядковый номер обследованных, которому на графике соответствуют три точки: 1) значения рН в порядке возрастания, образующие одну непрерывную неровную линию, 2) значение log КОЕ/мл бифидум, 3) значение log КОЕ/мл лактобацилл. Усредненные количества 2) и 3) сведены в логарифмические графики бифидум- и лактобацилл.

Выявлена достоверная (р = 0,000026) отрицательная корреляция рН и концентрации лактобактерий, коэффициент корреляции r равен - 0,28. Эта зависимость отчетливо видна на графике (фиг.3) на участке рН менее 7,0. Направление, противоположное графикам анаэробов, здесь имеет график 1), то есть график рН, который составлен из всех зафиксированных в данном эксперименте значений рН, расположенных в порядке возрастания. Однако выявленная отрицательная корреляция рН и концентрации бифидумбактерий, которая отчетливо видна на представленном графике, оказалась недостаточно достоверной для 95% вероятности (р = 0,08, коэффициент корреляции r = - 0,12).

Таким образом, максимальные количества анаэробных бактерий (бифидум- и лактобацилл) развиваются в толстом кишечнике при рН менее 6,8. В частности, при рН менее 6,8 у 65% обследованных отмечена 1 степень дисбактериоза или его отсутствие. При рН фекалий более 6,8 в 75% случаев зарегистрирован дисбактериоз 2, 3 и 4 степени. Возбудители кишечных инфекций, в частности шигеллы Флекснера и Зонне (всего 14 культур), выделялись только при рН выше 7,17. Условно-патогенная флора (УПФ) выделялась в фекалиях с кислой реакцией в 40% случаев, из них только в 14% случаев выделялись два - три вида УПФ. При рН более 6,8 УПФ выделялась у 60% больных, в том числе у 40% - в микробных и кандида-микробных ассоциациях из 2, 3, 4, и даже 5 составляющих.

При дальнейшем нарастании щелочной реакции фекалий достоверного нарастания частоты и выраженности дисбактериоза нами не выявлено.

Способ осуществляют следующим образом: измерительный и термокомпенсирующий электроды рН-метра одновременно погружаются в пробу фекалий на время, необходимое для измерения, то есть для стабилизации результатов на экране или шкале прибора. Для прибора "рН-pro" фирмы Trans-mstruments (Сингапур) это время составляет 1 минуту. Для исследования выбирается менее других подвергавшийся воздействию атмосферного кислорода проксимальный участок (фрагмент) фекальной массы, то есть далее других отстоявший от ануса и выделившийся при дефекации последним, наиболее рыхлый и/или пластичный. Измерение проводится сразу после дефекации, в крайнем случае - не более двух часов после дефекации, в момент доставки пробы фекалий в бактериологическую лабораторию.

При выявлении рН менее 6,8 диагностируется дисбактериоз кишечника 1 степени (незначительный) или эубиоз (кроме случаев неспецифического язвенного колита, леченного пролонгированными сульфаниламидами).

При определении рН более 6,8 с вероятностью 75% диагностируется выраженный дисбактериоз 2-3 или 4 степени.

Таким образом, заявляемый способ является простым, не требующим лабораторных условий и участия квалифицированного персонала, позволяет осуществить первичную экспресс-диагностику на дому у больного или обследуемого с профилактической целью, при максимальном снижении затрат и сокращении времени исследования до 1-2 минут.

Несомненно, является необходимым установление физиологической нормы рН, характерной для здорового гомеостаза человека, которая могла бы быть применена для оперативного и дешевого скрининга при диспансеризации и первичном обследовании больных. Исходя не только из самочувствия, но и из микробиологических показателей мы утверждаем, что нормальной для человека рН фекалий является кислая, а именно - 5,5-6,8, что положено в основу заявляемого способа.

Изобретение относится к области медицины. В способе проводят исследование фекалий, по результатам которого судят о наличии дисбактериоза. Исследование осуществляют измерением рН фекалий, и при его значении более 6,8 судят о наличии дисбактериоза толстого кишечника. При этом измерение рН фекалий осуществляют прямым электрохимическим методом с помощью рН-метра. Бифидобактерии и лактобациллы "закисляют" в процессе своего развития ту среду, на которой развиваются, вне зависимости от ее природы (молочная или углеводная). Способ позволяет осуществить экспресс-диагностику дисбактериоза толстого кишечника, прост в исполнении. 3 ил.

Способ диагностики дисбактериоза толстого кишечника, включающий исследование фекалий, отличающийся тем, что исследование осуществляют прямым электрохимическим методом с помощью рН-метра и при значении рН более 6,8 - диагностируют наличие 2-й, 3-й или 4-й стадии дисбактериоза.