СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БАЛАНТИДИОЗА СВИНЕЙ Российский патент 1995 года по МПК A61B1/00 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторным методам исследований патогенных простейших и может быть использовано для гистологической (микроскопической) диагностики балантидиоза свиней.

У больных свиней балантидии проникают в ткани стенки толстых кишок. Для обнаружения их делают гистологические срезы, применяют специальные методы окраски.

Известен способ диагностики балантидиоза свиней, предусматривающий фиксацию кусочков кишечной стенки в жидкостях ценкер-формол, фиксаторе Карнуа, формалине и других с последующей заливкой в парафин или целлоидин и изучение их в качестве гистологических объектов (см. Лабораторные методы исследования патогенных простейших. М. Медгиз, 1957, с.260).

Недостатки этого способа заключаются в том, что указанные фиксаторы значительно уплотняют ткань кишечной стенки, в результате чего при окраске гистосрезов гематоксилин-эозином и другими красками плохо окрашиваются отдельные структурные элементы балантидий (оболочка, пищеварительные вакуоли и др. ).

Известен способ исследования микроструктуры балантидий на гистологических срезах, окрашенных железным гематоксилином по Гейденгайну (см. Ветеринарная лабораторная практика. М. Сельхозиздат, 1963, т. 2, с.279). При этом обработка кусочков тканей кишечной стенки с паразитами ведется по общим правилам гистологической техники. Двухмоментный способ окраски железным гематоксилином Гейденгайна основан на образовании железо-гематоксилинового лака. Для протравы используют 2-5% водный раствор сернокислых железо-амиачных ("железных") квасцов. Для приготовления краски растворяют 1 г гематоксилина в 10 мл 96^о спирта и добавляют 90 мл дистиллированной воды. Для дифференцировки пользуются квасцами более слабыми, чем для протравы.

Этот способ имеет следующие недостатки. Для протравы следует пользоваться исключительно свежими, не бывшими в употреблении и совершенно прозрачными растворами, иначе на препарате могут появиться неустранимые осадки. При окраске имеет значение зрелость гематоксилина, чем раствор старее, тем в силу накопления в нем высших окислов гематоксилина окраска дает все более черные тона, причем препараты дифференцируются с большим трудом. Старые растворы по сравнению с более свежими гораздо менее надежны в смысле возможной идентификации окрашиваемых элементов (см. Лабораторные методы исследования патогенных простейших. М. Медгиз, 1957. с.77-81).

Известен способ исследования балантидий путем подготовки гистологических срезов, которые фиксируют 10-20%-ным формалином и окрашивают гематоксилином и эозином (см. Ветеринарная лабораторная практика. М. Сельхозиздат, 1963, т. 1, с.263).

Однако этот способ достаточно сложен, занимает много времени и не всегда обеспечивает хорошее качество окраски балантидий. Так при окраске гематоксилин-эозином на предметном стекле удовлетворительные результаты получаются лишь при том условии, если гематоксилином не перекрашивают, в противном случае препараты будут грубые, с сильном закрашенными ядрами. Даже в случае контроля под микроскопом имеет место некоторое закрашивание межуточной ткани гематоксилином, которое при последующем наслаивании эозина приводит к фиолетовому фону. При окраске с дифференцировкой излишне длительная задержка срезов в солянокислом спирте ведет к полному извлечению краски. При этом способе требуется тщательное отмывание в воде от щелочи (в течение 20-30 мин и более до 24 ч), иначе срез плохо воспринимает эозин. При окраске с дифференцировкой следует обращать особое внимание на эозин так как трудно определить точную экспозицию ввиду того, что эозины весьма различны по своим красящим свойствам и потому к каждому из них надо приспособиться. При сильном перекрашивании эозином плохо помогает и дифференцировка спиртом. Окраска парафиновых срезов имеет также ряд недостатков, влияющих на четкость, контрастность препарата (см. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. Л. Медгиз, 1961, с.129-137).

Целью изобретения является упрощение способа и повышение точности диагностики балантидиоза.

Указанная цель достигается тем, что в способе диагностики путем исследования балантидий в гистологических срезах, при котором препарат окрашивают гематоксилином и эозином, в существующей схеме окрашивания на стадии окраски эозином применяют раствор Люголя и эозина в соотношении 1:1 в течение 1 мин и для уплотнения среза последовательно проводят через спирты восходящей концентрации, перебрасывая срезы каждый раз на 25-30 с через спирт 70, 80, 96 и 100^о концентрации.

Это позволяет получить четкий контрастный препарат. При этом ресницы вегетативных форм и двуконтурная оболочка цист, пищеварительные вакуоли и ядра паразитов окрашиваются в темно-синий или бледно-синий цвет, хорошо различимы, в их цитоплазме эритроциты, лейкоциты и клетки эпителия кишечника окрашиваются в бледно-розовый цвет. Полученный четкий контрастный препарат позволяет судить о паразитизме балантидий.

Сопоставительный анализ предлагаемого решения с прототипом показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что на стадии окраски эозином применяют одновременно раствор Люголя и эозина в соотношении 1:1 в течение 1 мин и тем, что для уплотнения среза его последовательно проводят в течение 25-30 с через 70, 80, 96 и 100^о спирты. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "новизна".

Анализ известных технических решений в данной области науки позволяет сделать заключение, что известно техническое решение, предусматривающее окраску бактерий в срезах с применением раствора Люголя по методу Грам-Вейгерта. Однако в предлагаемом способе окраска проводится с применением раствора Люголя и эозина в соотношении 1:1. Применение гематоксилина и раствора Люголя и эозина (1:1) для окраски проявляет новое, не известное свойство, обусловливающее достижение положительного эффекта. Заявляемый способ менее трудоемок и прост, сокращается процедура окраски, поскольку не применяется фильтровальная бумага и анилиновое масло с целью дифференцировки структуры паразитов в гистосрезе. Способ обеспечивает четкое выявление ресничек, оболочки, ядра, а также крахмальных, гликогеновых зерен и поглощенных балантидиями лейкоцитов, эритроцитов, клеток эпителия кишечника, что является критерием их паразитизма.

Таким образом, хотя отличительные признаки изобретения известны, однако оно по сравнению с известными в данной области науки решениями характеризуется новой совокупностью признаков, проявляющих новое свойство четкое контрастное окрашивание балантидий, что позволяет повысить точность диагностики балантидиоза. Это позволяет сделать вывод, что предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "существенные отличия".

Предлагаемый способ реализуется следующим образом. Вырезают кусочки из стенки толстых кишок размером 0,3-0,5 см, их фиксируют в 8-10% водном растворе нейтрального формалина (можно в 70-80^о этиловом спирте). Промывают в проточной воде (под краном раковины) в течение 1-2 ч. Обезвоживание, обезжиривание и уплотнение кусочков кишечника проводят в спиртах восходящей крепости (70, 80, 96, 100^о) в течение 6 ч, потом в спирт-эфире (100^о спирт + эфир пополам) в течение 2 ч. Заливку кусочков из стенки кишечника проводят в жидкий (2% ) раствор целлоидина на 24 ч, потом в густой (10%) раствор целлоидина на 1-2 дня. Далее кусочки, пропитанные растворами целлоидина, помещают в чашки Петри, заливают свежей порцией густого целлоидина (10%), чтобы над кусочками был слой целлоидина толщиной 1 см, покрывают крышкой, но не совсем плотно, чтобы спирт и эфир в 10% растворе целлоидина постепенно испарился в течение суток. Потом с помощью лезвия безопасной бритвы в чашке Петри вырезают уплотненные в целлоидине кусочки и наклеивают их сухие обезжиренные березовые кубики (блоки), с которыми с помощью санного микротома и микротомного ножа готовят срезы толщиной 6-8 микрон и проводят окраску гематоксилин-иод-эозином.

Заливка в парафин. Заливку кусочков из стенки кишечника проводят в гомогенизированный расплавленный (при температуре 50-55^оС) парафин. Вначале кусочки переносят в баночку со 100^о спиртом пополам с хлороформом на 1 ч (обезвоживание и обезжиривание), потом в чистый хлороформ на 30 мин, далее в расплавленный (при температуре 40^оС) смесь хлороформа с парафином (поровну) и ставят в термостат на 1 ч. Далее из смеси хлороформа с парафином кусочки поочередно перекладывают в две чашечки с расплавленным парафином, ставят в термостат и при температуре 54-55^оС выдерживают 1,5-2 ч (чтобы не погубить балантидии, время пребывания кусочков в термостате можно сократить наполовину).

После чего кусочки из чашек с расплавленным парафином вынимают с помощью анатомического пинцета, перекладывают их в картоновые (лучше в свинцовые) формочки и быстро охлаждают, погружая в воду.

Когда парафин вместе с кусочками затвердеет, формочки разрушают, а из парафинового блока лезвием бритвы вырезают кусочки кишечника и наклеивают их с помощью расплавленного парафина на березовые кубики. В дальнейшем с помощью санного микротома и микротомного ножа получают гистосрезы толщиной 6-8 мк и окрашивают гематоксилин-иод-эозином.

Для уплотнения срезы помещают в спирт 96^о на 2 мин. Затем срезы помещают в воду на 2 мин. Окрашивают гематоксилином квасцовым в течение 3 мин. После этого срезы помещают в воду на 3 мин. Быстро ополаскивают соляно-кислым спиртом (70^о), затем быстро ополаскивают водой. Для нейтрализации соляной кислоты споласкивают слабым раствором нашатырного спирта (до посинения среза). После этого хорошо промывают в воде и окрашивают раствором йод-эозина (1:1) в течение 2 мин. Промывают в воде 2 мин. Для уплотнения срезы проводят через спирты 70, 80, 96 и 100^о концентрации, по 30 сут в каждой. Далее карбол-ксилол в течение 1 мин до просветления, потом ксилол в течение 30 с. Затем заключение в канадский или пихтовый бальзам, покрытие гистосреза покровным стеклом, микроскопирование.

В результате осуществления способа реснички, оболочки, ядра, вегетативных форм и цист балантидий окрашиваются в темно-синий цвет, пищеварительные вакуоли в бледно-синеватый цвет, протоплазма балантидий в бледно-розовый цвет, а лейкоциты, эритроциты, клетки эпителия слизистой оболочки, поглощенные балантидиями, окрашиваются в бледно-красный цвет. Это позволяет установить точный диагноз на балантидиоз свиней и отдифференцировать сходные желудочно-кишечные заболевания свиней.

Использование: в ветеринарии. Сущность изобретения: способ диагностики балантидиоза свиней путем приготовления гистологического среза, фиксации препарата, заливки препарата в парафин или целлоидин, окрашивания гематоксилином, дифференцировки, нейтрализации, окрашивания раствором йод-эозина в соотношении 1 : 1 в течение 1 мин и для уплотнения среза проведение в течение 25 - 30 с последовательно через спирт 70-, 80-, 96-, 100%-ной концентрации.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БАЛАНТИДИОЗА СВИНЕЙ путем выявления балантидий в гистологических срезах, включающий фиксацию препарата, заливку в парафин или целлоидин, окраску гематоксилином и эозином, дифференцировку, нейтрализацию, уплотнение и просветление среза, микроскопию препарата, отличающийся тем, что окраску эозином осуществляют после дифференцировки и нейтрализации путем его смешивания с раствором Люголя в соотношении 1 1 и обработки этой смесью в течение 1 мин, а уплотнение осуществляют путем экспозиции срезов последовательно в растворах этилового спирта 70-, 80-, 96- и 100%-ной концентрации по 25 30 с.