СПОСОБ ОКРАСКИ ХРЯЩЕВОЙ И КОСТНОЙ ТКАНИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологической технике, и может быть использовано при приготовлении гистологических препаратов.

Известен способ окраски гематоксилин-эозином на предметном стекле, суть которого заключается в том, что срезы извлекают на предметное стекло, наливают несколько капель гематоксилина, окрашивают, промывают в воде и повторно окрашивают раствором эозина с последующей промывкой в дистиллированной воде, обезвоживанием и заключением в бальзам.

Гематоксилин в сочетании с эозином не обеспечивает достаточно хорошей окраски хрящевого матрикса. В зоне замещения (например, в ростковой зоне кости) остатки хрящевого матрикса оказываются почти не окрашенными.

Известен также способ окрашивания кислых мукополисахаридов альциановым синим, основанный на том, что окраску осуществляют в течение 10-30 с, в 0,1% -ном растворе альцианового синего в 3%-ной уксусной кислоте, промывают в дистиллированной воде, затем окрашивают гемалуином Эрлиха в течение 5-10 мин, дифференцируют в 1%-ном растворе спирта и т.д.

Окрашивание только альциановым синим не позволяет выделить тонкие границы взаимоотношений субстанций хряща и кости.

Целью изобретения является дифференцировка тонких границ взаимоотношений субстанций хряща и кости за счет сочетенного воздействия поэтапного окрашивания.

Цель достигается тем, что в известном способе окрашивания, включающем воздействие красителя на гистосрез, новым является то, что после воздействия гематоксилином окрашивание гистосреза осуществляют 0,1% альциановым синим, приготовленным на ацетатном буфере с рН 4,4 в течение 20-45 мин при 37^оС в термостате и последующей докраской эозином при комнатной температуре.

Сравнительный анализ с прототипом показал, что поэтапное окрашивание клеточных и тканевых структур на гистологических срезах позволило определить тонкие границы взаимоотношений хряща и кости и раскрыть закономерность формирования скелетной основы тела человека и животных и позволяет сделать вывод о соответствии критерию "новизна". Изучение других технических решений в данной области показало, что в этих решениях отсутствовали сведения о возможности получения сравнительно-гистологического характера тонких границ взаимоотношений хряща и кости на одном гистологическом препарате.

При этом эозин кислый краситель красит цитоплазму клеток и в меньшей степени различные неклеточные образования; гематоксилин основной краситель окрашивает ядра клеток; альциановый синий окрашивает хрящевой матрикс (содержащий мукополисахариды как сульфати- рованные, так и карбоксилированные) в сине-зеленый цвет.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует критерию "существенные отличия".

Способ осуществляется следующим образом: Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды. Окрашивают гематоксилином 1-3 мин. Промывают в проточной воде 10-15 мин. Окрашивают в растворе альцианового синего при рН 4,4 от 20 до 45 мин (в зависимости от толщины и свежести ткани среза) в термостате при 37^оС. Например, гистопрепарат бедренной кости плода человека 10 недель толщиной 5 мк окрашивают гематоксилином 2,5 мин, альциановым синим 20 мин, эозином 2,5 мин; гистопрепарат бедренной кости лягушки (B.Bombina) взрослого животного толщиной 6 мк, окрашивают гематоксилином 2,5 мин, альциановым синим 45 мин, эозином 2,5 мин.

Приготовление ацетатного буфера с рН 4,4: к 126 мл 0,1 н р-ра уксусной кислоты прибавляют 74 мл 0,1 н р-ра уксуснокислого Na. рН буфера проверяют по потенциометру и доводят до рН 4,4 приготовленными растворами. В 100 мл этого буфера растворяют 100 мг альцианового синего. Приготовленный раствор имеет концентрацию 0,1% Обезвоживают в абсолютном спирте 30 с. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде. Окрашивают в 0,1% водном растворе эозина 3 мин. Спиртовая проводка (обезвоживание). При проводке по спиртам 70^о и 80^о рекомендуется добавить несколько капель уксусной кислоты:
70^о и 80^о спирты быстро;
96^о спирт 1 мин;
100^о спирт 2 мин
Срезы просветляют (ксилол чистый 2-3 мин) и заключают в бальзам.

Результат. Окрашивание в синий цвет ядра хрящевой матрикс (содержащий мукополисахариды как сульфатированные, так и карбоксилированные) в сине-зеленый цвет, а цитоплазма клеток и костная ткань в розовый цвет.

П р и м е ч а н и е. Выбор временного интервала окраски гистосреза обусловлен тем, что меньше 20 мин не окрашивается срез, больше 45 мин структура среза перекрашивается. А помещение препарата в термостат интенсифицирует процесс окраски. Выбор концентрации красителя обусловлен необходимостью выявления следовых количеств альцианофилии (глюкозамингликанов, которыми богата структура хряща).

П р и м е р 1. Гистопрепарат бедренной кости большой синицы, фиксатор формалин 10%-ный, нейтральный, окрашивание: гематоксилином 3 мин, альциановым синим 45 мин, эозином 3 мин; 6 мк срез.

П р и м е р 2. Гистопрепарат плода человека 10 недель, фиксатор тот же; окрашивание: гематоксилином 2,5 мин, альциановым синим 20 мин, эозином 3 мин; 5 мк срез.

П р и м е р 3. Гистопрепарат плода человека 10 недель, фиксатор Карнуа, окрашивание: гематоксилином 2,5 мин, альциановым синим 20 мин, эозином 2,5 мин; 5 мк срез.

П р и м е р 4. Гистопрепарат бедренной кости лягушки (B.Bombina) взрослого животного, толщиной 6 мк срез, окрашивали гематоксилином 2,5 мин, альциановым синим 45 мин, эозином 2,5 мин.

П р и м е р 5. Гистопрепарат б/к домового робья, формалин 10%-ный; окрашивание: гематоксилином 3 мин, альциановым синим 45 мин, эозином 2,5 мин; толщина среза 6 мк.

П р и м е р 6. Гистосрез б/к 8-суточного куриного эмбриона, фиксатор -80^о спирт, 6 мк срез, окрашивание: гематоксилин 2,5 мин, альциановый синий 45 мин; эозин 3 мин.

П р и м е р 7. Гистопрепарат б/к 19-суточного зародыша курицы, затравленной свинцом 12 ч; фиксатор 6% и 10% нейтральный формалин, окрашивание: гематоксилином 2,5 мин, альциановым синим 45 мин; эозином 3 мин.

П р и м е р 8. Гистопрепарат б/к взрослой зеленой ящерицы, фиксатор 10% нейтральный формалин; 5 мк срез толщиной, окрашивание: гематоксилином 3 мин, альциановым синим 45 мин, эозином 2,5 мин.

П р и м е р 9. Гистопрепарат б/к 3 мес. крысы, фиксатор ФСУ, 5 мк толщ. среза. окрашивание: гематоксилином 2,5 мин, альциановым синим 20 мин, эозином 3 мин.

П р и м е р 10. Гистопрепарат б/к эмбриона морской свинки 3 мес. фиксатор ФСУ, толщина среза 6 мк, окрашивание: гематоксилином 3 мин, альциановым синим 30 мин, эозином 3 мин.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет:
Выявить топографию тонких границ взаимоотношений субстанций хряща и кости на одном гистопрепарате, т.е. видна картина замены хряща костью в ростковой зоне кости.

Повысить качество окраски ядер, цитоплазмы клеток исследуемых тканей.

Дает возможность в общих чертах (визуально) по интенсивности окрашивания судить о большей или меньшей функцио- нальной активности хрящевых и остеогенных клеток (с большей или меньшем содержании глюкозамингликанов).

Использование: в медицине, а именно в гистологической технике, и может применяться при приготовлении гистологических препаратов. Сущность изобретения: после воздействия гематоксилином на гисторез окрашивание осуществляют 0,1% -ным альциановым синим, приготовленным на ацетатном буфере с pH 4,4 в течение 20-45 мин при комнатной температуре. Способ позволяет дифференцировать тонкие границы взаимоотношений хряща и кости за счет сочетанного воздействия поэтапного окрашивания.

СПОСОБ ОКРАСКИ ХРЯЩЕВОЙ И КОСТНОЙ ТКАНИ путем воздействия красителями на гистологический срез, промывку в дистиллированной воде, обезвоживание, просветление и заключение в бальзам, отличающийся тем, что дополнительно поэтапно осуществляют докрашивание 0,1%-ным альциановым синим, приготовленным на буфере с рН 4,4 в течение 20 45 мин при 37^oС в термостате и эозином, при этом докрашивание эозином осуществляют при комнатной температуре.