СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОЗА В ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/68 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и патологической анатомии.

Известен способ выявления некроза в гистологических срезах окрашенных гематоксилином и эозином, основанный на выявлении изменений ядер клеток типа кариолиза, кариопикноза или кариорексиса; изменении цитоплазмы клеток, соответственно, по типу цитолиза или циторексиса; а также выявлении некротических изменений межуточной ткани, выражающихся в изменении окрашиваемости в виде базофилии, неясности структуры или полном распаде и разжижении, то есть процессов, приводящих к образованию некротического детрита (Абрикосов А.И. Струков А. И. Патологическая анатомия, Изд. 2-е. М. Медгиз, 1961). Недостатком способа является то, что он отражает структурный, а не функциональный аспект патологического процесса. В связи с этим в ряде случаев затруднительно только по одной этой окраске гистологических срезов отличать некроз от амилоидоза, гиалиноза или других патологических процессов, сопровождающихся снижением или полной утратой структуры ткани. Диагностика некроза обычно осуществляется путем исключения всех других возможных патологических процессов путем дополнительного исследования. Приходится производить окраску на амилоид, фибрин и пр.

Известен способ, выбранный в качестве прототипа, выявления омертвения структур ткани в гистологических срезах окрашенных по методу Ван-Гизона. Данная гистологическая окраска является наиболее популярной для выявления соединительной ткани, которая окрашивается в розово-кирпичные оттенки цвета. Некроз при этом окрашивается в желтый цвет. Однако все другие, кроме соединительной ткани, образования исследуемого препарата (мышечные и нервные волокна, эпителии, амилоид и пр.), также, окрашиваются в желтый цвет (Афанасьев Ю. И. Баланчук В.К. Ванников Л.Л. и др. /Основы гистологии и гистологической техники/. Под общей ред. Елисеева В.Г. -М. Медицина, 1967 г.). Кроме этого, недостатком способа является то, что очаг некроза и при применении данной окраски распознается не столько по цвету окраски, сколько по наличию изменений ядер и цитоплазмы клеток, а также межуточной ткани. Недостатком способа является и то, что окраска не стойкая, в связи с чем со временем гистологические препараты выцветают (Ромейс Б. Микроскопическая техника. Пер. с нем. М. Изд-во иностр. лит-ры, 1954.)
Задача предлагаемого способа заключается в повышении точности исследования и одномоментности идентификации некроза в гистологических срезах.

Поставленная задача осуществляется путем селективной окраски зоны некроза при помощи иммуногистохимической детекции ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина (АБГ) в гистологических срезах, накапливающегося в зонах омертвения ткани, с использованием первичных антител против данного белка в концентрации 8 10 мкг/мл. Данная концентрация белка является наиболее информативной и подобрана опытным путем.

Способ иммуногистохимической детекции АБГ в зонах некроза основан на следующем. Известно, что в зонах омертвения тех или иных структур ткани отмечается увеличение процессов протеолиза и накопление ингибиторов протеиназ, регулирующих активность протеаз. В отличие от некроза, при других патологических процессах, сопровождающихся снижением структурности ткани (гиалиноз, амилоидоз и др.) АБГ не накапливаются. Стало быть, иммуногистохимическая детекция АБГ в зонах сниженной структурности тканей будет маркером некроза. Учитывая абсолютную специфичность иммунопероксидазного способа выявления искомого белка, обнаружение некроза таким способом, оказывается селективным, однако диагностика зон некроза в гистологических срезах с помощью иммуногистохимической детекции АБГ ранее не проводилась.

Сущность предлагаемого способа иммуногистохимической диагностики некроза в гистологических срезах заключается в следующем.

1. Регидратация срезов и удаление из них остатков парафина. Основной задачей данного этапа является обезвоживание тканей и максимальное удаление из них парафина, так как минимальные остатки последнего приводят к повышению фонового окрашивания. Для этого срезы проводят через три порции о-ксилола, абсолютный спирт, спирт 70% и 56%-ный, а также забуференный физиологический раствор (ЗФР) по три минуты в каждой порции жидкости.

2. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют путем внесения на срез нескольких капель 3% перекиси водорода на 10 мин.

3. Блокирование неспецифической сорбции иммуноглобулинов достигается путем нанесения на срез сыворотки в разведении 1 20 на 30 мин.

4. Этап обработки гистологических срезов первичными антителами в концентрации 8 10 мкг/мл, разведенными в ЗФР с добавлением 3%-ного альбумина и 0,01% -ного азида натрия. Инкубация срезов осуществляется в течение 30 мин при 37^oC.

5.Инкубация гистологических срезов вторичными антителами в разведении 10 мкг/мл ЗФР в течение 30 мин.

6. Обработка срезов комплексом авидин-пероксидаза в концентрации 25 мкг/мл в течение 30 мин.

7. Проявление пероксидазной активности 3,3-диаминобензидина тетрахлоридом (ДАБ) в ЗФР в соотношении 500 мкг ДАБ на 1 мл ЗФР. К свежеприготовленному раствору прибавляют 0,03%-ную перекись водорода и срезы инкубируют с субстратом в течение 10 мин. Реакцию останавливают погружением срезов в дистиллированную воду. В дальнейшем срезы докрашивают гематоксилином в течение 3 мин для дифференцировки ядер клеток, проводят по спиртам восходящей концентрации и трем порциям о-ксилола, заключают в бальзам.

При проведении иммуногистохимической реакции используют "положительный контроль", то есть срезы аналогичной исследуемой ткани с заведомо позитивной реакцией. В качестве своеобразного контроля возможно приготовление микропрепаратов аналогичной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином, а также по методу Ван-Гизона. Кроме "положительного контроля", применяют "отрицательный контроль", то есть срезы аналогичной исследуемой ткани, в которых при проведении иммунопероксидазной реакции опущены 4 или 5 этапы ее с целью обнаружения возможного фонового окрашивания. Другими словами, применяют тест на качество забивки эндогенной пероксидазы.

В результате реакции получают отчетливую яркую окраску зоны некроза, достигающую интенсивно коричневого цвета. Предлагаемый способ позволяет одномоментно селективно идентифицировать очаг некроза в гистологических срезах, что обеспечивает высокоспецифичную качественную диагностику целого ряда патологических процессов, сопровождающихся развитием местного омертвения тканей, например, злокачественных опухолей, инфаркта миокарда, мозга, а также других локализаций; воспалительных процессов разной этиологии и др. При этом необходимость дифференцировать некроз от близких процессов путем дополнительных исследований, более адекватно судить о генезе заболеваний, составлять их прогноз и применять более индивидуальную терапию.

Пример 1. Иммуногистохимическая детекция ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина (АБГ) в очаге некроза ткани рака молочной железы. Фрагменты операционного материала рака молочной железы фиксируют 15% водным нейтральным растворителем формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающейся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 мин, две порции 70% и 80% этанола по 6 ч в каждой; три порции 96% этанола по 6 ч в каждой; абсолютный спирт 30 мин; абсолютный спирт-ксилол в равных соотношениях в течение 2 ч; ксилол-парафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 ч; три порции парафина при температуре 58^oC по одному часу в каждой. Последняя порция парафина отличается от первых двух тем, что на 500 г его внесено 30 г пчелиного воска. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе, наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5 8 мкм готовят с помощью микротома. Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 мин в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при 37^oC в течение трех ч. Обезвоживание гистологических срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола (абсолютный, 96% 70% и 56%) по три минуты в каждой. Далее срезы переводят на 5 мин в 0,05 М раствор ЗФР pH 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы (этот и последующие этапы реакции проводят в чашках Петри) осуществляют свежим 3% раствором перекиси водорода. Длительность этапа 10 мин. ЗФР 5 мин. Далее выдерживают срезы под каплей 5% раствора лошадиного сывороточного альбумина (50 мг альбумина в 1 мл ЗФР). После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг среза. На последний наносят каплю афинно очищенных кроличьих антител против АБГ в концентрации 8 мкг/мл ЗФР. Раствор антител содержит в себе 3% альбумина и 0,01% азида натрия. Инкубацию срезов проводят в течение 30 мин при 37^oC в чашках Петри с созданием условий влажной камеры, для чего на дно чашки укладывают фильтровальную бумагу смоченную ЗФР. Две порции ЗФР по 5 мин в каждой, после чего раствор ЗФР меняют на свежий. Инкубируют гистологические срезы во вторичных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЗФР в течение 30 мин. ЗФР 5 мин. Обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 мин. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЗФР. 5 мин ЗФР. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03% растворе субстрата в течение 10 мин. Раствор получают смешивая непосредственно перед применением 1 мг ДАБ с 2 мл ЗФР и 0,2 мл 0,3% перекиси водорода. Реакцию останавливают споласкиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Учитывая, что полученные темно-коричневые преципиталы ДАБ не растворимы в воде, спирте, ксилоле, осуществляют окраску ядер клеток гематоксилином Майера в течение 3 мин. Далее срезы проводят через свежие спирты восходящей концентрации (56% 70% 96% и абсолютный этанол) и три порции о-ксилола путем тщательного споласкивания в каждой порции жидкости, затем срезы заключают в бальзам.

Полученные результаты читают под разными увеличениями светового микроскопа по наличию золотисто-коричневого окрашивания изучаемого белка в опытных микропрепаратах и "положительном контроле", при отсутствии окраски в "отрицательном контроле". Использование способа показало, что зоны некроза опухолевой ткани окрашены в коричневый цвет, за счет чего участки некроза четко отличимы от сохранной ткани, имеющей желто-серый цвет. Селективная окраска некроза в раке позволяет четче судить о темпах роста опухоли и о более благоприятном ее течении. Полученные данные позволяют составить более благоприятный прогноз и назначить рациональнее терапию заболевания благодаря повышению точности и одномоментности диагностики.

Пример 2. Иммуногистохимическая детекция АБГ в зоне инфаркта миокарда. Фрагменты сердечной мышцы фиксируют 15% водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающейся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 мин, две порции 70% и 80% этанола по 6 ч в каждой; три порции 96% этанола по 6 ч в каждой; абсолютный спирт 30 мин; абсолютный спирт-ксилол в равных соотношениях в течение 2 ч; ксилол-парафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 ч; три порции парафина при температуре 58^oC по одному часу в каждой. Последняя порция парафина отличается от первых двух тем, что на 500 г его внесено 30 г пчелиного воска. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе, наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5 8 мкм готовят с помощью микротома. Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 мин в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при 37^oC в течение 3 ч. Обезвоживание срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола (абсолютный, 96% 70% и 56%) по три минуты в каждой. Далее срезы переводят на 5 мин в 0,05 М раствор ЗФР pH 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы (этот и последующие этапы реакции проводят в чашках Петри) осуществляют свежим раствором 3% перекиси водорода. Длительность этапа 10 мин. ЗФР 5 мин. Далее выдерживают срезы под каплей 5% раствора лошадиного сывороточного альбумина (50 мг альбумина в 1 мл ФР). После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг срезов. На последние наносят каплю афинно очищенных кроличьих первичных антител против АБГ в концентрации 8 мкг/мл ЗФР. Раствор антител включает в себе 3% альбумина и 0,01% азида натрия. Инкубацию срезов осуществляют в течение 30 мин при 37^oC в чашках Петри с созданием условий влажной камеры (на дно чашки укладывают фильтровальную бумагу смоченную ЗФР). Две порции ЗФР по 5 мин в каждой, после чего раствор ЗФР меняют на свежий. Инкубируют гистологические срезы во вторичных биотинилированных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЗФР в течение 30 мин. ЗФР 5 мин. Обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 мин. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЗФР. 5 мин ЗФР. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03% растворе субстрата в течение 10 мин. Раствор получают смешивая непосредственно перед применением 1 мг ДАБ с 2 мл ЗФР и 0,2 мл 0,3% перекиси водорода. Реакцию останавливают споласкиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Учитывая, что полученные коричневые преципиталы ДАБ нерастворимы в воде, спирте и ксилоле, осуществляют окраску ядер клеток гематоксилином Майера в течение 3 мин. Далее срезы проводят через свежие спирты восходящей концентрации (56% 70% 96% и абсолютный этанол) и три порции о-ксилола путем тщательного споласкивания в каждой жидкости, затем срезы заключают в бальзам.

При исследовании готовых микропрепаратов отмечается четкое окрашивание очагов ишемического некроза сердечной мышцы в зоне инфаркта миокарда. Очаг некроза имеет коричневый цвет, а остальные ткани желто-серую окраску. Селективная идентичность зоны некроза повышает точность диагностики и позволяет осуществлять ее одномоментно. Благодаря способу легко отличить зону некроза от очагов дистрофии миокарда различной природы, либо острой коронарной недостаточности с очагами повреждения в миокарде. Полученные результаты позволяют качественно с высокой спецификой диагностировать инфаркт миокарда, являющийся одним из самых частых патологических процессов, приводящих к инвалидизации и даже смерти лиц трудоспособного и пожилого возраста.

Использование: в области медицины, а именно в иммунологии и патологической анатомии. Сущность изобретения: проводят окраску очагов некроза в гистологических срезах. После чего осуществляют селективное выявление ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина (АБГ), накапливающегося в очаге омертвения ткани, путем иммуногистохимической детекции данного белка с использованием первичных антител против АБГ в концентрации 8 - 10 мкг/мл. Способ позволяет повысить точность определения некроза в гистологических срезах исследуемой ткани.

Способ диагностики некроза в гистологических срезах, основанный на окраске очагов некроза в гистологических срезах, отличающийся тем, что осуществляют селективное выявление ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ), накапливающегося в очаге омертвения ткани путем иммуногистохимической детекции данного белка с использованием первичных антител против АБГ в концентрации 8 10 мкг/мл.