СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ДИПЛОИДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР Российский патент 1995 года по МПК A01H1/04 A01N43/40 A01N61/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к генетике и селекции растений, и может быть использовано для получения гомозиготных диплоидов, возникающих в результате индуцированного нерегулярного апомиксиса.

Нерегулярный апомиксис природное явление, заключающееся в развитии зародыша из яйцеклетки или другой клетки зародышевого мешка при отсутствии опыления. Такой тип апомиксиса, встречающийся в природе довольно редко (1 ˙10^-6), называется партеногенез или апогамия. В последние годы многими исследователями изыскиваются способы для индуцирования нерегулярного апомиксиса у важнейших сельскохозяйственных культур для решения селекционных программ.

Известен способ получения гомозиготных диплоидов мягкой пшеницы, включающий идентификацию гаплоидных и диплоидных апомиктов по окраске колеоптиля и числу хромосом, кастрацию цветков внутривидовых гибридов пшеницы, их опыление пыльцой того же вида, обработанной 0,2-0,4%-ным водным раствором колхицина в течение 18 ч и при температуре воздуха 20^оС в колосьях, срезанных на стадии одноядерной и двухядерной пыльцы [1]
Недостатком известного способа является длительный и трудоемкий путь для широкого внедрения в селекционном процессе ввиду необходимоcти пpедваpительного пpиготовления инактивиpованной пыльцы, необходимой для опыления. К тому же не вся пыльца инактивируется, что приводит к завязыванию гибридных зародышей, и тем самым затягивает и усложняет отбор. Способ используется не на всех генотипах, а только с маркерными рецессивными признаками.

Известен способ получения гаплоидов и гомозиготных диплоидов, включающий обработку растений во время между мейозом и цветением апомиктическим и стерилизующим агентом на основе производных из ряда 4-оксо (тио) никотинатов или 4-оксо (тио) циридазинов в количестве 0,03-11 кг на 1 га [5]
Данный способ предусматривает получение генетически устойчивых гаплоидных и диплоидных зерен, используемых далее в селекции, как источников чистых гомозиготных линий.

Однако применение данного способа нецелесообразно по экологическим соображениям. Предусматриваемое по патенту разбрызгивание химических реагентов загрязняет воздух и землю не обеспечивает получения гомозиготных диплоидов с высокой достоверностью, так как не вся пыльца стерилизуется и завязываются гибридные зародыши, что приводит к проведению дополнительных трудоемких операций по определению истинных гомозиготных диплоидов, так как в результате способа образуются формы различной плоидности и гибриды.

Целью изобретения является повышение частоты образования гомозиготных диплоидов и выхода хозяйственно ценных генотипов растений.

Это достигается тем, что в качестве апомиктического агента используется водный раствор смеси фитогормонов гиббереллина и цитокинина в количестве 0,01-4 мл на одно растение, при этом суммарная концентрация водного раствора смеси фитогормонов колеблется в интервале 230-694 мкмоль, соотношение фитогормонов составляет 1:0,75-1,03 при этом обработку ведут на стадии зрелого зародышевого мешка.

Отличительными признаками способа являются использование в качестве апомиктического агента водного раствора смеси фитогормонов гиббереллина и цитокинина в указанном соотношении, концентрация применяемого раствора, расходы его на один цветок и фаза развития зародышевого мешка.

Совокупность существенных признаков обеспечивает более простой и быстрый процесс получения гомозиготных диплоидов сельскохозяйственных культур.

Предлагаемый способ основан на гормональном индуцировании митотического деления и удвоения числа хромосом в партеногенетически развивающейся яйцеклетке, что приводит к получению абсолютно гомозиготных диплоидов.

Применение фитогормонов в сельском хозяйстве известно для различных целей, так, например, известен способ повышения урожайности фруктов на деревьях или других вегетативных форм косточковых плодовых культур обработкой несущих плодов на ветвях во время развития плода 0,01-2%-ным водным раствором смеси фитогормонов, содержащих от 10 до 500 ppm гиббереллина, от 10 до 250 ppm ауксина и от 10 до 1000 ppm замещенной мочевины формулы R'N HCO NHR².

Повышение урожайности в данном случае достигается за счет увеличения количества плодов и размера плодов и ягод [2]
Известен способ обработки 0,0002-0,4%-ного водного раствора смеси фитогормонов (гиббереллина и холина) для регулирования роста различных растений [3] обработкой цветков раствором смеси гиббереллина и кинетина добиваются ускорения периода цветения хризантем [4]
Способ может быть использован на самоопылителях, строгих перекрестниках, раздельнодомных и раздельнополых видах растений, относящихся к классам однодольных и двудольных растений, например ячмень, кукуруза, облепиха, гречиха, капуста, при этом оптимальная концентрация водного раствора фитогормонов и соотношение гиббереллина и цитокинина меняются.

Так, например, наилучших результатов при получении гомозиготных диплоидов гречихи, ячменя и капусты можно получить при обработке раствором фитогормонов концентрацией 230-303 мкмоль на 1 л при соотношении гиббереллина и цитокинина, равном 1:0,75-1,03 соответственно.

При получении гомозиготных диплоидов облепихи и кукурузы целесообразно применять раствор фитогормонов концентрацией 303-694 мкмоль на 1 л при соотношении гиббереллина и цитокинина, равном 1:0,75-1 соответственно.

В качестве гиббереллина применяют промышленные марки продукта типа гиббереллин А₄, А₃, А₇.

В качестве цитокининов применяют промышленные марки веществ типа зеатин, зеатин рибозид, кинетин, 6-БАП (6-бензил-аминопурин).

П р и м е р 1. Способ осуществляют следующим образом. Рано утром у соцветий растений, от которых желательно получить гомозиготные диплоиды, удаляют отцветшие цветы и бутоны, оставляя только те, которые распустятся в день обработки. Из начинающих раскрываться бутонов удаляют пыльники, контролируют чистоту кастрации с помощью лупы и изолируют с помощью различных известных изоляторов.

На подготовленные таким образом цветки в стадии зрелого зародышевого мешка наносят с помощью микропипетки 10 мкл водного раствора смеси гиббереллина и кинетина при молярном соотношении 1:0,75-1,03 суммарной концентрации 230-694 мкмоль на 1 л. Обработанные растения притеняют, а соцветия изолируют пергаментными изоляторами. На обработанных соцветиях удаляют вновь нарастающие бутоны.

В зависимости от вида растения, от концентрации и соотношения используемых фитогормонов частота проявления индуцированного нерегулярного апомиксиса колеблется от 10 до 30% (табл. 1). Результаты подтверждают возможность использования водного раствора смеси гиббереллина и цитокинина при молярном соотношении 1:0,75-1,03 суммарной концентрацией 230-694 мкмоль на 1 л.

П р и м е р 2. На цветки растений, подготовленные, как описано в примере 1, наносят с помощью микропипетки 10 мкл водного раствора гиббереллина и зеатина при молярном соотношении 1:0,81-1 суммарной концентрации 280-626 мкмоль на 1 л. Как видно из результатов опыта (табл. 2), при замене кинетина на зеатин частота проявления индуцированного нерегулярного апомиксиса почти не изменяется и составляет от 23 до 27 как и при использовании кинетина (табл. 1).

П р и м е р 3. На цветки растений, подготовленные, как описано в примере 1, наносят с помощью микропипетки 10 мкл водного раствора гиббереллина и 6-бензил-аминопурина (6-БАП) при молярном соотношении, равном 1:0,77, суммарной концентрации 300-600 мкмоль на 1 л. Данные табл. 3 дают основание полагать, что при замене кинетина на 6-БАП частота проявления индуцированного нерегулярного апомиксиса несколько снижается, так при обработке гиббереллином в смеси с кинетином частота составляет 26-28% (табл. 1), а при обработке гиббереллином в смеси с 6-БАП составляет 15-21% Однако выход гомозиготных диплоидов в этом случае достаточно высок.

Результаты опытов, приведенные в примерах 1, 2 и 3, дают основания считать, что для индуцирования нерегулярного апомиксиса пригоден любой цитокинин.

П р и м е р 4. На цветки гречихи, подготовленные, как описано в примере 1, наносят с помощью микропипетки 10 мкл водного раствора гиббереллина и кинетина в различных концентрациях и в смеси. В качестве контроля служит обработка водой, а также обработка цветков гречихи водным раствором индивидуального фитогормона.

Как видно из результатов опыта (табл. 4), индуцированный нерегулярный апомиксис зависит от концентрации фитогормона и сочетания фитогормонов. Применение смеси гиббереллина и кинетина в суммарной концентрации 285 мкмоль на 1 л в соотношении 1:1,03 дает высокий выход гомозиготных диплоидов, а в сравнении с лучшим результатом раздельного применения фитогормонов имеется существенная разница.

Из семян, полученных согласно изобретению, были выращены растения, пыльцу которых проанализировали на фертильность реакций окраски раствором йода в калии йодистом. Фертильные пыльцевые зерна окрашиваются полностью, а стерильные не окрашиваются совсем или окрашиваются частично. Данные представлены в табл. 5.

Как следует из представленных данных, у линий, полученных данным способом, повышается фертильность практически до 100%
Кроме того у гречихи, обладающей самонесовместимостью, в результате индуцирования нерегулярного апомиксиса наблюдалась высокая степень самосовместимости, что повлияло как один из факторов на повышение урожайности (табл. 6). Кроме того, линии отличаются как от исходной формы, так и между собой по массе 1000 шт. семян, по пленчатости и другим показателям.

Линии растений, полученные в результате индуцирования нерегулярного апомиксиса, отличаются повышенной устойчивостью к заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды.

Применение данного способа позволяет получать чистые гомозиготные линии за 1-2 года, преодолевать стерильность у межвидовых гибридов, снижать затраты на получение чистых линий, сокращать сроки и повышать эффективность создания новых сортов.

Использование: биотехнология, сельское хозяйство, селекционно-генетические исследования. Сущность изобретения: гомозиготные диплоиды получают путем кастрации цветков, обработки их аломиктическим агентом, представляющим собой водный раствор смеси гиббереллина и цитокинина, и дальнейшего выращивания растений. 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГОМОЗИГОТНЫХ ДИПЛОИДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР, включающий кастрацию цветков, обработку их апомиктическим агентом и последующее выращивание растений из образующихся семян, отличающийся тем, что, с целью повышения частоты образования гомозиготных диплоидов и выхода хозяйственно ценных генотипов растений, в качестве апомиктического агента используют водный раствор смеси гиббереллина и цитокинина при молярном соотношении 1 0,75 1,03 соответственно с суммарной концентрацией веществ 230 694 мкМ на 1 л, при этом обработку ведут на стадии зрелого зародышевого мешка с нормой расхода 0,01 4 мл на одно растение. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обработки цветков гречихи, ячменя и капусты применяют водный раствор гиббереллина и цитокинина концентрацией 230 303 мкМ на 1 л. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для обработки цветков облепихи и кукурузы применяют водный раствор гиббереллина и цитокинина концентрацией 303 694 мкМ на 1 л при соотношении гиббереллина и цитокинина 1 0,75 1 соответственно.