Способ индукции партеногенеза у растений Советский патент 1993 года по МПК A01H1/04 A01H1/02 

w

fe

Использование: биотехнология, цитоге- нетические исследования, сельское хозяйство, физиология растений. Сущность изобретения: партеногенез у растений индуцируют в результате обработки женских генеративных органов с мегагаметами витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гомеостаз в сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и функционирования. 14 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.

Изобретение относится к растениеводству и селекции сельскохозяйственных культур, в частности, к применению химических веществ для экспериментального индуцирования апомиктичного (партеноге- нетического) развития женских генеративных элементов In vivo, и может быть использовано в гетерозис ной селекции растений как этап для разработки методов ускоренного получения гомозиготных линий и аломиктичных диплоидных форм растений, закрепляющих эффект гетерозиса в первом гибридном поколении, а также в физиологии и генетике растений для изучения путей индукции и развития экспериментального апо- миксиса. явлений оплодотворения и эмбриогенеза, механизма активации мега- гамет.

Цель изобретения - расширение спектра (набора) универсально партеногенез-ин- дуцирующих веществ при увеличении выхода пэртеногенетических форм.

Поставленная цель достигается тем, что в способе индукции партеногенеза у растений, включающем кастрацию и изолирование соцветий или цветков до цветения, обработку в них. после начала цветения, женских генеративных органов с мегагаметами биологически активными веществами,, индуцирующими партеногенез, морфобио- логический контроль индукции, обработку осуществляют витальными дозами индуцирующего вещества, изменяющего кальциевый гомеостаз в. сторону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и

00

ю ю

Os 00

функционирования, например, поверхностно активного вещества типа детергента - этанола, а контроль осуществляют цитоэмб- риологически по сохранению витальности мегагамет и их активации к партеногенети- ческому развитию. В качестве индуцирующих веществ кроме поверхностно-активных веществ типа этанола, используют также вещества антиауксинового действия, например, рутин, кумарин, другие флавоноиды из монофенолов и М-дифенолов; вещества из переносчиков и каналоформеров, повышающие проницаемость мембран для ионов кальция, например, грамицидины, карбоксильные полиэфирные антибиотики типа А 23187, лазолоцида А, цитокинины типа 6- бензиламинопурина.-6-фураноаминопури- на, зеатина; переносчики химической энергии типа аденозинтрифосфорной кислоты; вещества, повышающие проницаемость мембран растительной клетки, деполяризующие их и понижающие мембранный потенциал, например, натриевая соль никотинамидадениндинуклеотида, глу- татион, рибофлавин, холекальциферол; вещества, в растворе диссоциирующие на свободные ионы кальция и любые анионы, например, хлорид кальция, нитрат кальция. Используемую в заявленном способе группу индуцирующих веществ органической или неорганической природы, необладающих токсическим действием на растение, ненарушающих жизнеспособности и функционирования мегагамет и объединенных физиологическим действием на кальциевый гомеостаз, приводящим к увеличению содержания свободных ионов кальция в цитозоле мегагамет, никогда не использовали в качестве действующих веществ в способах индукции партеногенеза у -растений; партеногенез индуцирующий эффект этих веществ не был известен, не был очевиден и не мог быть логическим путем выведен, исходя из структурных формул их молекул или известного физиологического действия их как веществ, действующих на кальциевый гомеостаз растительной клетки. Изменение кальциевого гомеостаза под действием этих веществ (но не влияние на партеногенез) было известно. Причем, известно, что в любой клетке, включая растительную, находящуюся в состоянии динамического равновесия с окружающей средой, концентрация свободных ионов кальция равна 10 Моль/л. а вне клетки - 10 3 Моль/л. В связи с этим введение кальция в клетку или высвобождение его из ком- партментов, т.е. повышение эндогенного содержания свободных ионов кальция, инициирует ряд биологических процессов. При

этом связь между повышением эндогенного содержания ионов кальция в цитозоле мегагамет и индукцией партеногенеза у растений оставалась до настоящего времени

неизвестной и неочевидной, хотя указанный в заявленном способе набор веществ функционально объединяется именно таким действием на кальциевый гомеостэз клетки. В силу всего вышеизложенного, предлагаео мое техническое решение неочевидно, обладает новизной и существенными отличиями.

Использование вышеупомянутых веществ в качестве универсально партеноге5 неэ-индуцирующих в составе смеси, воздействие которой по указанному способу приводит к активации мегагамет и индукции партеногенеза у растений при сохранении их витальности, расширяет

0 спектр (набор) веществ, использовавшихся до настоящего времени для индукции партеногенеза, увеличивает выход партеноге- нетических форм. Ранее известно использование вышеупомянутых веществ

5 только в качестве активаторов или ингибиторов роста растений,антибиотиков, фиксаторов, стерилизаторов, макросолей при минеральной подкормке вегетирующих растений, поверхностно-активных веществ и

0 т.п., но не в качестве универсально партеио- генез-индуцирующих веществ.

На чертеже дана зависимость выхода партеногенетических форм в процентном выражении (на оси Y) от концентрации эта5 нола. используемого в заявленном способе в качестве индуцирующего вещества, в процентном выражении (на оси X).

Способ осуществляется следующим образом. До начала цветения на стадии еще

0 незрелых зародышевых мешков кастрируют соцветия или цветки, удаляя пыльники до их растрескивания и высыпания из них пыльцы; изолируют кастрированные соцветия или цветки, например, пергаментными изо5 ляторами для предотвращения случайного попадания любой пыльцы на их женские генеративные органы; после начала цветения их обрабатывают индуцирующим веществом, например, вводят раствор одного из

0 вышеуказанного набора индуцирующих веществ (например, этанола). Наиболее оптимальным является способ введения, при котором индуцирующее вещество вводится в центральную ось соцветия или цветка, чем

5 достигается эффект снижения расхода вещества и оптимальной доставки его к месту непосредственного действия, т.е. к мегага- метам. В качестве растворителя используют любое вещество, не обладающее токсическим действием на растение, например, воду. Концентрацию индуцирующего вещества берут витальную, причем его витальность и индуцирующий эффект контролируют ци- тоэмбриологически по сохранению жизнеспособности мегагамет и эффекту активации их к пэртеногенетическому развитию (например, к пролиферации и т.п.).

П р и м е р 1. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале кукурузы сложного гибрида Коллективный-147ТВ.

Женские соцветия (початки) кукурузы с однополыми женскими цветками изолировали за 3...5 дней до начала цветения (до выметывания первых нитей рылец) на стадии незрелого зародышевого мешка перга- ментными изоляторами, чтобы предотвратить последующее случайное опыление завязей.

На 2...7 сутки после начала цветения проводили иньекцию партеногенез-инду- цирующего вещества - этанола как одного из наиболее доступных веществ, изменяющих кальциевый гомеостаз клетки, в виде водного раствора в концентрации 1...50% в объеме 2 мл на одно соцветие с помощью шприца-дозатора комбинированного ШДК- 5 в центральную ось початка.

Верхний предел концентраций 50% брали, исходя из того, что этанол в этой концентрации используют в цитологии как фиксирующее вещество, т.е. воздействие этанолом данной концентрации приводит к летальному исходу для растения (Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Колос. 1980. - С. 70-76).

Идентификацию витальности мегагамет и индукции партеногенеза у них на ранних стадиях развития производили по цитоэмбриологическим маркерным признакам индуцированного партеногенетическо- го развития яйцеклеток и вторичных ядер центральных клеток зародышевых мешков. Для этого на 3...10 сутки после иньекции раствора этилового спирта фиксировали в фиксаторе Чемберлена часть завязей с обработанных початков. Состав фиксатора Чемберлена: 90 частей этанола 70%-ного; 5 частей ледяной уксусной кислоты; 5 частей 40%-ного формальдегида. Препараты зародышевых мешков готовили по ускоренной методике, включающей окраску 2%-ным ацетокармином. вычленение семяпочек макроиглами, мацерацию их комплексом ферментов из зобной железы виноградной улитки (цитазой). вычленение зародышевых мешков микропрепаровальными иглами и приготовление глицерин-желатиновых препаратов. Из каждого соцветия початка

цитоэмбриологически изучено в среднем по 30 семяпочек.

Выход партеногенетических форм кукурузы, индуцированных к развитию действи- 5 ем водного раствора этилового спирта в сравнении с прототипом, приведен в табл. 1. Выход партеногенетических форм выражали отношением числа индуцированных к партеногенетическому (апомиктичному)

0 развитию завязей к числу проанализированных завязей початка.

Из данных табл. 1 следует, что выход партеногенетических форм в заявленном способе превышает таковой в прототипе по

5 совокупности вариантов обработки в 13 раз (2,48%/0,19%), а по вариантам с максимальным выходом апомиктичных форм - в 35 раз (10.52%/0,30%).

Интервал оптимальных концентраций

0 индуцирующего вещества этанола в заявленном способе определяли по результатам графического анализа (фиг.). Причем, оптимальными концентрациями этанола считали те, которые давали выход партеногенетиче5 ских форм выше максимального показателя такового по прототипу, т.е. выше 0,46% по сорту Jinquang-13 (указано на фиг. горизонтальной прерывистой линией). Это интервал оптимальных концентраций этанола - 1,100 47.00%.

Таким образом, использование заявленного способа в случае, когда в качестве индуцирующего вещества берут этанол, как одно из веществ, изменяющих кальциевый

5 гомеостаз мегагамет. эффективно для кукурузы гибрида Коллективный-1.47 ТВ.

П р и м е р 2. Экспериментальное доказательство осуществимости способа проводили на материале кукурузы сложных

0 гибридов Коллективный-147ТВ, ВИР-42 и гомозиготной мужскостерильной линии ЮВ-24 ТС в соответствии с описанием способа, данным в примере 1.

В качестве индуцирующих использовали ряд биологически активных веществ, иэ5 меняющих кальциевый гомеостаэ, указанных в пунктах 2..,7 формулы изобретения.

Результаты испытания приведены в табл. 2.

0 Таким образом, использованный в примере специфический набор биологически активных веществ расширяет спектр универсально партеногенез-индуцирующих веществ у растений. Причем в табл. 2

5 приведены только те концентрации веществ, при воздействии которыми наблюдали максимальный эффект индукции партеногенеза. Проблему наиболее экономичного выхода на оптимальные параметры

концентраций решали следующим образом: брали максимальную из витальных для растения доз и расширяли интервал концентраций индуцирующего вещества в сторону уменьшения на 3...4 порядка, испытывая при этом внутри интервала 5...7 уровней концентрации. Контроль витальности и индукции партеногенеза вели по цитоэмбрио- логичёским признакам.

Результаты испытания свидетельствуют о том, что все из апробированных веществ превосходят прототип по выходу партеногенетических форм в 9...120 раз (4.17...55.17% против 0,46% по прототипу).

Таким образом, осуществление заявленного способа в случае использования ряда веществ, указанных в п.п. 1...7 формулы изобретения, в отношении индукции и выхода партеногенеза эффективно для трех селекционных форм кукурузы.

Аналогичные результаты, подтверждающие расширение спектра и универсальность таким образом специфически подобранных индуцирующих веществ, получены для просэ посевного и томата.

Формула изобретения 1. Способ индукции партеногенеза у растений, включающий кастрацию, изолирование соцветий или цветков до начала цветения, обработку г, них после начала цветения женсчих генеративных органов с ме- гагаметами биологически активными веществами, индуцирующими партеногенез, и последующий морфобиологический контроль индукции, отличающийся тем. что, с целью увеличения выхода партеногенетических форм м расширения спектра универсально лартеногенез-инду- цирующих веществ, обработку осуществляют витальными дозами индуцирующего вещестоа, изменяющего кальциевый гоме- остаз в стооону увеличения содержания свободных ионов кальция в мегагаметах при сохранении их витальности и функционирования, а контроль осуществляют цитоэмб- риологически по сохранению витальности мегагамет и их активации к пэртеногенети- ческому развитию.

действия.

тем, что в качестве индуцирующего вещества используют переносчики химической энергии.

мг/л мг/л мг/л 5000 мг/л 200 сг/л

3000 мг/л

пурин

Jinquang-13

Калл. TD Ш-2А ТС DMP-1 2

Колл. U7 ТО Ш-2« ТС Колл. ТС

ЮВ-24 ТС Колл. ТВ

Таблица 1

.