СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ СИРЕНИ IN VITRO Российский патент 2012 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности цветоводству, и может быть использовано для оздоровления и микроразмножения растений сирени in vitro.

Известен способ микроразмножения сирени, включающий черенкование выращиваемых in vitro растений на одноузловые сегменты, посадку черенков на питательную среду для мультипликации, содержащую микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) [2], 1,5 концентрацию макроэлементов MS, 35 г/л сахарозы, 8 г/л Difco бакто-агара и 1 мг/л 2-изопентениладенина (2ip), получение пробирочных микрорастений, повторное их черенкование и высадку полученных регенерантов на среду укоренения с ауксинами (R.L.M.Pierik; H.H.M.Steegmans; A.A.Elias; O.T.J.Stiekema; A.J.van der Velde. Vegetative propagation of Syringa vulgaris L. in vitro. // Acta Hort., 226 (1988) 195-204.).

Недостатком данного способа размножения является то, что растения по окончанию этапа размножения получаются утолщенными и укороченными со скрученными листьями вдоль центральной жилки (витрифицированными) (Рисунок 1). Эти микропобеги плохо укореняются (Рисунок 2). Укорененные микрорастения такого качества неспособны адаптироваться к условиям ex vitro.

Технический результат изобретения заключается в повышении выхода нормально сформированных корнесобственных микрорастений, улучшении роста и развитии эксплантов при положительном влиянии оптимальных концентраций минеральных и органических компонентов питательной среды, регуляторов роста растений и антибиотиков.

Сущность изобретения заключается в том, что одноузловые сегменты выращиваемых in vitro растений помещают на среду для мультипликации, содержащую макро-, микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) или или Кворина-Лепорье (1977) (QL) (Quorin M. & Lepoivre P., Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. // Acta Hort., 78 (1977) 437-442) или Вуди Плант Медиум (WPM) (Lloyd G. & McCown В., Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by shoot tip culture. // Comb. Proc. Int. Plant Prop.Soc, 30 (1980) 421-427) или Драйвер и Куниюки (DKW) (Driver J.A., Kuniyuki A.H., In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. // Hort. Science, 19 (4), August (1984).), 30-40 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина (Z) и/или 0,5-1,5 мг/л кинетина (kin) и антибиотики (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). Культивирование проводят на светокультуральных стеллажах при освещении белыми люминесцентными лампами общей интенсивностью 2000-4000 люкс при 16-часовом фотопериоде и температуре 21-25°C. Полученные пробирочные микрорастения повторно черенкуют на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Одноузловые сегменты повторно выращиваются на среде мультипликации, а апикальные высаживают на среду укоренения. Она содержит ½ макроэлементов, полные микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи MS, 10-30 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, перечисленные выше антибиотики, 0,1 мг/л ИМК, а также 0,01 мг/л НУК или 0,1 мг/л ИУК.

Добавление сахарозы в питательные среды в концентрациях более 40 г/л снижает интенсивность роста растений и приводит к их витрификации. Добавление в питательные среды регуляторов роста и антибиотиков в предложенных концентрациях наиболее оптимально подходят для роста эксплантов и не оказывают токсического воздействия и эффекта угнетения культуры.

Предлагаемый способ клонального микроразмножения сирени реализуется следующим образом:

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, pH 5,6-5,8. После этого растворяется навеска агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 ати (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В остывшую до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста и антибиотиков. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам.

Все манипуляции с растительным материалом производится в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в сосудах составляет 15-25 штук.

2. Размножение растительного материала проводят на средах мультипликации, приготовленных по прописи MS или QL или WPM или DKW, дополненных сахарозой (30-40 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), БАП и/или зеатином (0,2-2,0 мг/л) или кинетином (0,5-1,5 мг/л) и антибиотиками (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). При этом наиболее оптимальными минеральными композициями являются MS и QL. Для цитокининов наиболее удачны концентрации 0,2-1,0 мг/л как для БАП, так и для зеатина, для кинетина - 0,9-1,1 мг/л, а для антибиотиков - пенициллин (50-100 мг/л) и/или ампициллин (50-100 мг/л) и/или цефотаксим (50-200 мг/л) и/или тикарциллин (10-50 мг/л) и/или стрептомицин (5-50 мг/л) и/или тетрациклин (10-100 мг/л) и/или ванкомицин (1-15 мг/л).

3. Полученные микропобеги черенкуются на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Серединные сегменты повторно переносятся на среды мультипликации. Апикальные части высаживают на среду укоренения. В качестве среды для укоренения используется редуцированная до ½ по макросолям среда MS, дополненная сахарозой (10-30 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), антибиотиками (перечень и концентрации указаны в п.2).

Эффективность укоренения оценивается долей укорененных хорошо сформированных микрорастений от числа всех эксплантов, выраженной в процентах.

В таблицах 1-3 представлены результаты исследований по влиянию на укореняемость микропобегов условий предшествующего этапа культивирования, а именно: концентрация цитокининов (БАЛ, зеатин и кинетин), минеральный состав питательной среды (MS, QL, WPM и DKW), наличие антибиотиков в среде. В качестве контрольного варианта использовались среда и концентрация цитокинина (2-изопентениладенин), описанные в прототипе.

Таблица 1 Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от концентраций фитогормонов, применяемых на этапе мультипликации (при использовании среды MS) Среда укоре
нения Среда мультипликации Прото
тип Z
0,5 мг/л БАП
0,2 мг/л Z
0,2 мг/л; БАП
0,5 мг/л Z
0,5 мг/л;
БАП
0,2 мг/л БАП
1,0 мг/л БАП
2,0 мг/л Z
1,0 мг/л Z
2,0 мг/л kin
0,5 мг/л kin
1 мг/л kin
1,5 мг/л Примроуз R 10* 45 60 43 63 50 60 37 95 79 53 57 39 R20* 51 43 40 72 30 63 42 95 77 50 63 43 R30* 47 45 39 57 35 60 40 90 81 46 53 30 Богдан Хмельницкий R10 54 75 40 90 50 80 61 84 74 54 81 28 R20 51 95 35 93 95 85 57 97 79 62 92 30 R30 62 80 35 89 70 82 63 94 83 63 76 35 Надежда R10 48 65 50 65 88 73 64 93 83 61 60 58 R20 48 70 50 62 92 76 71 87 85 67 64 61 R30 45 70 45 70 87 74 59 78 79 67 68 66 * - где R - редуцированная по макросолям до ½ среда MS, цифровой индекс после R означает концентрацию сахарозы в среде в граммах на 1 литр (Здесь и далее)

Таблица 2 Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на различных питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды Среда укоренения Минеральный состав среды на этапе мультипликации MS QL WPM DKW Цитокинин (концентрация 1 мг/л) Z БАП Kin Z БАП Kin Z БАП Kin Z БАП Kin R10 95 60 57 90 90 65 80 75 69 89 67 65 R20 95 63 63 97 93 71 79 73 70 92 72 64 R30 90 60 53 95 95 70 75 77 68 94 70 65 Результаты представлены на примере сорта Примроуз.

Таблица 3 Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды и наличия антибиотика, применяемых на этапе мультипликации Среда укоренения Среда мультипликации MS; Z 1,0 мг/л MS; Z 1,0 мг/л; CEF QL; Z 1,0 мг/л; QL; Z 1,0 мг/л; CEF R10 75 80 80 85 R20 70 75 68 81 R30 80 95 84 100 Результаты представлены на примере сорта Президент Греви. Статистически достоверные различия отсутствуют в вариантах питательных сред, где цевотаксим содержится в концентрациях от 50 до 150 мг/л.

При добавлении индивидуальных антибиотиков в среду культивирования в следующих концентрациях: ванкомицин 1-15 мг/л и/или цефотаксим 50-150 мг/л и/или тикарциллин 10-50 мг/л и/или пенициллин 50-100 мг/л и/или ампициллин 50-100 мг/л и/или стрептомицин 5-50 мг/л и/или тетрациклин 10-100 мг/л - статистически достоверных различий не выявлено (данные не представлены).

Добавление НУК или ИУК в заявленных концентрациях не вызывало статистически достоверных различий процента укоренения (данные не представлены).

Использование перечисленных концентраций фитогормонов позволяют увеличить эффективность укоренения микропобегов сирени в культуре in vitro относительно прототипа до 2 раз.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Способ включает культивирование одноузловых сегментов на среде мультипликации, содержащей макро-, микроэлементы, хелат железа, витамины по прописи Murashige & Skoog (MS) или Quorin & Lepoivre, или Woody Plant Medium, или Driver & Kuniyuki, 30-40 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламинопурина и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина, или 0,5-1,5 мг/л кинетина и антибиотики (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л), и/или цефотаксим (50-1000 мг/л), и/или тикарциллин (10-500 мг/л), и/или стрептомицин (5-500 мг/л), и/или тетрациклин (10-1000 мг/л), и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). Полученные пробирочные микрорастения повторно черенкуют на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Одноузловые сегменты повторно выращивают на среде мультипликации, а апикальные высаживают на среду укоренения. Она содержит 1/2 макроэлементов, полные микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи MS, 10-30 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, перечисленные выше антибиотики, 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты, а также 0,01 мг/л α-нафтилуксусной кислоты или 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты. Культивирование проводят на светокультуральных стеллажах при освещении белыми люминесцентными лампами общей интенсивностью 2000-4000 люкс с 16-часовым фотопериодом и температурой 21-25°С. Изобретение позволяет повысить выход нормально сформированных корнесобственных микрорастений, улучшить рост и развитие эксплантов. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

1. Способ клонального микроразмножения сирени in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений на одноузловые сегменты, высадку их на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы, хелат железа, витамины, сахарозу, агар-агар и цитокинины, получение микропобегов, их черенкование и укоренение на среде, содержащей ауксины, отличающийся тем, что высадку одноузловых сегментов осуществляют на питательную среду Quorin & Lepoivre или Woody Plant Medium, или Driver & Kuniyuki с добавлением 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламиноурина, и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина, и/или 0,5-1,5 мг/л кинетина, 50-1000 мг/л антибиотика из группы β-лактамных антибиотиков, и/или 5-500 мг/л антибиотика из группы аминогликозидов, и/или 10-1000 мг/л антибиотика из группы тетрациклинов, и/или 1-100 мг/л антибиотика из группы циклических гликопептидов, а укоренение осуществляют на среде, содержащей 1/2 концентрации микросолей по прописи Murashige & Skoog с добавлением 50-1000 мг/л антибиотика из группы β-лактамных антибиотиков, и/или 5-500 мг/л антибиотика из группы аминогликозидов, и/или 10-1000 мг/л антибиотика из группы тетрациклинов, и/или 1-100 мг/л антибиотика из группы циклических гликопептидов, 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,01 мг/л α-нафтилуксусной кислоты или 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду в качестве антибиотика группы β-лактамных антибиотиков добавляют пенициллин, или ампициллин, или цефотаксим, или тикарциллин, в качестве антибиотика из группы аминогликозидов - стрептомицин, в качестве антибиотика из группы тетрациклинов - тетрациклин, в качестве антибиотика из группы циклических гликопептидов - ванкомицин.