Способ культивирования островковых клеток поджелудочной железы Советский патент 1983 года по МПК C12N5/00 

00 30

Изобретение относится к медицинской промышленности « касается способа культивирования островковых клеток поджелудочной железы, исполь зуемых для получения инсулина. Известен способ культивирования ocTpOBKOBbik клеток поджелудочной же зы путем инкубирования их в питател ной смеси, содержащей среду 199 и 10%-ную сыворотку .крупного рогатого скота ij . Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода клеток. Цель изобретения - повышение выхода клеток. Указанная цель достигается тем, что согласно способу культивировани островковых клеток поджелудочной же лезы путем инкубирования их в питательной смеси суспензию клеток пре варительно обрабатывают средой 199, содержащей 50% бычьей сыворотки, и инкубируют в питательной смеси, содержащей среду 199, 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина, бычь сыворотку в соотношении 1:1:0,5 и 300-500 мг% глюкозы. Способ осуществляют следующим образомо Выделенные островки суспендируют в среде 199, содержащей 50% бычьей сыворотки и оставляют для свободног оседания на 10-15 мин, после чего надосалочную : жидкость с неосевшими клетками осторожно удаляют. К остро кам добавляют 2-3 мл ростовой питательной смеси и помещают в культура ные флаконы емкостью 250 или 500 мл При помощи медленного ручного вращения добиваются равномерного распр деления .островков на внутренней поверхности культурального флакона В течение 20-30 мин дают островкам закрепиться на поверхности стекла. Затем осторожно вносят 2-3.мл росто вой питательной смеси и помещают в устройство для культивирования во вращакяцихся флаконах. В течение ISIS ч .культивирование ведется при ко натной температуре. За это время завершается окончательное прикрепле ние выделенных островков к внутренней поверхности культурального флакона. Потом питательную среду с неприкрепившимися островками и отдель ными клетками удаляют, добавляют в флаконы порцию ростовой питательной смеси и культивируют при 37°С. Пример 1. Выделенные с соблюдением условий асептики полжелудочные железы помещают в стерильную колбу с охлажденным до 4 с растворо Хенкса. В боксе железы переносят в стерильную чашку Петри и удаляют капсулу и крупные кровеносные сосуды. Затем их измельчают ножницами на кусочки 1-2 мм. Перекладывают измельченную ткань в стерильную колбу и промывают раствором Хенкса до отхождения прозрачных промывных вод После промывания раствор Хенкса сливают, а в колбу вносят 3-5 мл рабочего pactBOpa коллагеназы (0,1% в 0,3%-ном растворе трипсина). Раствбр фермента наливают с таким расче том, чтобы измельченная ткань была покрыта слоем жидкости толщиной в 15-20 мм. В колбу опускают стерильный магнит, закрывают стерильной резиновой пробкой и ставят колбу на магнитную мешалку для перемешивания. Скорость перемешивания должна быть такой. Чтобы над магнитом о.бразовывалась небольшая воронка, а в колбе не происходило образт5вание пены. Первую порцию клеток, отделившихся от кусочков ткани через 15-20 мин, не используют В дальнейшем через каждые 5 мин производят слив жидкости с взвешенными в ней клетками в флаконы емкостью 250 мл с добавлением 50-70 мл среды 199 с 50% сыворотки (для инактивации протеолитических ферментов). Флаконы хранят в льду иЛи при 4°С. К оставшейся ткани вновь добавляют раствор фермента и ставят на магнитную мешалку для ее дальнейшей дезагрегации. Такую процедуру повторяют несколько раз до полного расщепления тканевых фрагментов с, По мере заполнения флаконов прс1изводят центрифугирование в течение 10 мин при 600-700 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспеядируют пипетированием в 2-3 мл среды 199, содержащей 50% бычьей сыворотки с Доводят объем -ЭТОЙ среды до 150 мл, затем легким перемешиванием распределяют клетки во всем объеме среды и оставляют для свободного осаждения на 15-20 мин. В течение этого промежутка времени периодически при помощи пипетки на 1 мл делают забор среды для контроля за осаждением конгломератов островковых клеток. Для этого каплю среды помещают на предметное стекло и смотрят под микроскопом при увеличении 8x10. Когда в пробах среды, взятых на различных уровнях, не выявляются конгломераты островковых клеток, надосадочную жидкость р взвешенными в ней одиночными клетками осторожно сливают,. При посеве клеток, полученных из надосадочной жидкости, получаются культуры, состоящие из 8090% фибробластов и 10-15% островковых клеток. К осевшим островкам добавляют 1,5-2 мл ростовой питательной смеси, содержащей 40% среды 199, 40% 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина и 20% бычьей сыворот1СИ. Ресуспендируют островки при помощи пипетирования, а затем путем медленного ручного вращения равномер но распределяют их на внутренней поверхности культурального флакона. В течение 20-30 мин дают островкам закрепиться на поверхности стеклао Затем осторожно вносят 2-3 мл ростовой питательной смеси. Флаконы плот но закрывают стерильными резиновыми пробками, так как поступающий воздух может изменить рН среды в мелочную сторону. Оптимальная рН среды - 7,27,4. Пробирки или флаконы с панкреатическими островками помещают в ро лер. В течение 16-18 ч культивирование ведется при комнатной температуре и скорости вращения флаконов 0,5 об/мин. За это времяжизнеспособные островки окончательно прикре пляются к поверхности стекла. Потом культуральную среду с неприкрепивши мися клетками осторожно сливают, а в-флаконы добавляют порцию свежей ростовой среды. Ее объем должен составлять 1/50 ч.от объема роллерног флакона. Культивирование ведется пр 37°С и скорости вращения флаконов в пределах 0,5-1 об/мин. Сравнительная оценка эффективнос ти способов культивирования островковых клеток из поджелудочных желез морских свинок в средах различного состава приведена в табл. 1 Пример 2. Для получения культуры островковых клеток из поджелудочных желез эмбрионов человека используют человеческие плодики 1626 недельного возраста, полученные при самопроизвольных абортах. Извлеченные в асептических уело.ВИЯХ поджелудочные железы переносят в стерильную чашу Петри на марлю, смоченную pacTi opoM Хенкса. Удаляют капсулу, соединительную ткань, крупные кровеносные сосуды. Затем их рзмельчают на кусочки размером 11,5 мм„ Перекладывают измельченну1о ткань в стерильную колбу и промывают нескол1усо раз раствором Хенкса до от хождения прозрачных промывных вод После промывания раствор Хенкса еливают, а в колбу вносят 2-гЗ млрабочего раствора коллагеназы (0,1% в 0,3%-ном растворе трипсина). Ткань диспергируют вручную при комнатной температуре, причем каждый раз после заливки рабочего раствора фермента ткань пипетируют, а затем энергично перемешивают в течение 3-5 . Посл перемешивания колбу ставят в слегка наклонном положении для осаждения остатков ткани. Надосадочную жид;кость с взвешенными клетками сливают во флаконы емкостью 50-100 мл, содержащих 20-30 мл среды 199 с 50% бычьей .сыворотки (для нейтрализации протеолитических ферментов). Такие процедуры производят несколько раз до полного расслоения островковой ткани. При этом соответственно уменьшают количество рабочего раствора фермента, добавляемого к остаткам ткани. Центрифугирование производят в течение 10 мин при 600-700 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в питательной среде, содержащей 50% бычьей сыворотки. Переносят суспензию островковых клеток в флакон емкостью 20 мл и до.водят объем среды до 10-15 мл. Оставляют для свободного осаждения на 1015 мин. Время от времени, пипеткой на 1 мл делают забор среды для контроля за ходом осаждения. Для этого каплю среды помещают на предметное стекло и смотрят под микроскопом при увеличении 8x10. Когда в пробах, взятых с раз.пичных уровней, не выявляются конгломераты островковых клеток, Надосадочную жидкость, содержащую одиночные клетки, удаляют, а к осадку добавляют 0,3-0,5 мл ростовой питательной смеси. Путем медленного ручного вращения добиваются равномер ного распределения островков по внутренней поверхности культурального флакона В течение 15-20 мин дают островкам закрепиться на поверхности стекла. Затем осторожно вносят 0,3-0,5 мл ростовой питательной смеси и помещают в роллер. В течение 16-18 ч культивирование ведется при комнатной температуре и скорости вращения флаконов U,5 об/мин. В течение этого времени завершается прикрепление жизнеспособных островков к поверхности стекла. Затем культуральную среду с неприкрепившимися клетками удаляют, а в флаконы добавляют порцию свежей ростовой питательной среды. Ее объем должен составлять 1/20 ч. от объема роллерного флакона. Культивирование ведется при 37°С и скорости вращения флаконов в пределах 0,5-1 об/мин. Сравнительная оценка эффективности способов культивирования остров-. ковых клеток из поджелудочных желез эмбрионов человека в средах различного состава приведена в табл. 2. Сравнительные, данные по вьз;ходу леток и йнсулинпродуцируквдей актив- . ости (ИРИ) культур приведены соотетственно в табл. 3 и 4. Данные цитологического анализа культур показывают, что при выращивании клеток фиброблаеты полностью элю иниpyютcя через 1,5-2 дня после засева. Использование изобретения позвояет повысить выход клеток, их митоическую активность и инсулинредуциующую активность.

7-8 7 5-6 0,3+0,08 0,4±0,09 0,6+0,08

9:0:1 - 90% среды 199,10% сыворотки,(прототип) ;

3:1:1 - 60% среды 199,20% гидролизата лактальбумина (ГЛА), 20% СЫВОРОТКИ/

1:1:0,5 - 40% среды 199, 40% ГЛА, 20% сыворотки;

«4( С

1:1:0,5:0,,5 - 40% среды, 199,40% ГЛА, 20% сыворотки 300-500 мг % глюкозы (соотноцюние ингредиентов по предлагаемому способу).

3-3,5 1,4+0,1

Т а б ли ц а

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ путем инкубирования их в питательной смеси, о т личaющийciя тем, что, с целью повышения выхода клеток, суспензию клеток предварительно обрабатывают средой 199, содержащей 50% бычьей сыворотки, и инкубируют в питательной смеси, содержащей среду 199, 0,5%-ный раствор гидролиэата лактальбумина, бычью сыворотку в соотношении 1:1:0,5 и 300-500 мг% глюкозы, ., (Л CZ

Время, необходимое для формирования клеточного слоя дни Митотйческий 6+1,3 7+1,4 индекс, %

способу,

Таблица 345

Таблица 4 9:0:1 - 90% среды 199, 10% сыворотки (прототип); 3:1:1 - 60% среды 199, 20% ГЛА , 20% сыворотки; 1:1:0,5 - 40% среды 199, 40% ГЛА, 20% cывopoтки 1:1:0,5:0,, 40% среды 199, 40% ГЛА, 20% сыворотки, 300-500 мг % глюкозы (соотношение ингредиентов по предлагаемому 17±1,8 9+1,3