СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ МУТАГЕННОГО ФАКТОРА В ПРОБЕ Российский патент 1995 года по МПК C12N15/01 G01N37/00 

Изобретение относится к экспериментальной генетике и медицине и может быть использовано для оценки окружающей среды с точки зрения ее мутагенной опасности.

Известен способ определения наличия мутагенного фактора в пробе, представляющий собой раствор предполагаемого мутагена. Согласно известному способу в закрытых сосудах (стаканчиках, пробирках и т.п.) скрещивают самок Drosophila melanogaster генотипа y⁺⁺/y⁺⁺ и самцов генотипа +wsn³/Y. Обеспечивают контакт кладки яиц с исследуемым раствором путем его внесения в закрытый сосуд с кладкой. Сосуд с кладкой, а затем с вылупившимися личинками, содержащий внесенный в него раствор, выдерживают закрытым до завершения стадии личиночного развития. Затем у самок первого поколения по мере их вылета регистрируют соматический мозаицизм (появление yellow (y) или singled (sn³) макрохет нотума). По полученным результатам оценивают наличие или отсутствие мутагенной активности у исследуемого фактора [1]
Недостатком известного способа является невозможность определения летучих или седементирующихся из воздуха факторов, которые могут находиться в окружающей среде.

Цель изобретения обеспечение возможности выявления в пробе летучих и седементирующихся факторов.

Для этого в способе определения наличия мутагенного фактора в пробе, включающем скрещивание в закрытом сосуде самок y⁺⁺/y⁺⁺ и самцов +wsn³/Y Drosophila melanogaster, обеспечение контакта фактора с кладкой яиц и затем с личинками в период их развития, регистрацию у самок первого поколения мутантных y и sn³ макрохет нотума и определение по результатам регистрации наличия или отсутствия мутагенного фактора в пробе, отличительной особенностью является то, что контакт кладки с фактором осуществляют путем помещения пробы и сосуда с кладкой в один общий замкнутый объем, при этом сосуд открывают и оставляют открытым до завершения периода личиночного развития.

Установлено, что при выдерживании открытых сосудов с кладкой яиц и затем с вылупившимися из них личинками в помещениях, в которых находятся материалы, выделяющие в окружающую среду летучие компоненты, или в запыленных цехах химических производств, бывают случаи, когда у вылетевших затем самок первого поколения проявляется соматический мозаицизм мутантные y либо sn макрохеты нотума. Выдерживание закрытых ватным тампоном сосудов с кладкой яиц в этих же помещениях к подобным результатам не приводит.

Исследования показали, что ряд материалов выделяют в окружающую среду летучие мутагенные факторы, наличие которых можно обнаружить по соответствующим мутациям макрохет нотума у самок Drosophila melanogaster первого поколения, вылетевших из личинок, выдержанных в открытых сосудах в одном общем замкнутом объеме с пробой того материала, который является источником летучего или осаждающегося из воздуха мутагенного фактора.

П р и м е р 1. Определяли наличие мутагенных веществ в древесно-волокнистых плитах, изготовленных с использованием составов, которые предположительно образуют при термической обработке вещества, обладающие мутагенным действием. Плиту помещали в замкнутый объем (камеру). В этом же объеме размещали открытые пробирки диаметром 30 мм, содержащие по 15 мл стандартной питательной среды, на которой находилась кладка яиц, полученная накануне от скрещивания 10 виргинных самок Drosophila melanogaster генотипа y⁺⁺/y⁺⁺ и 4-5 самцов этого вида генотипа +wsn³/Y. Открытые пробирки выдерживали в одном замкнутом объеме с испытуемой древесно-волокнистой плитой до завершения периода личиночного развития.

После начала окукливания (на 5 сутки от начала опыта) пробирки извлекали из замкнутого объема, закрывали ватными пробками и оставляли до начала вылета взрослых особей первого поколения. По мере вылета (на 9-10-й дни от начала опыта) просматривали всех вылетевших самок под бинокулярным стереоскопическим микроскопом МБС-9 в падающем свете и регистрировали число мутантных макрохет нотума: y (yellow желтое тело и макрохеты) и sn³ (singled извитые макрохеты). Рассчитывали частоту мозаицизма, по которой судили о мутагенной активности летучих компонентов, выделяющихся в окружающую среду из древесно-волокнистой плиты. Обследовано 10 партий плит по 10 образцов в каждой партии, полученных по одной технологии, но с использованием разных химических составов. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о том, что в плитах партий 5 и 9 присутствуют летучие компоненты, оказывающие мутагенное действие, о чем свидетельствует высокая частота мозаицизма. В контроле (пробирки с кладкой яиц и затем с развивающимися личинками в течение всего опыта были закрыты) мутагенные летучие вещества не были зафиксированы.

П р и м е р 2. С применением предлагаемого способа обследованы помещения химической лаборатории, в которой проводился синтез или работа с применением биологически активных соединений, в том числе обладающих мутагенным действием. Помещения были обследованы в рабочие и в выходные дни. Параллельно обследованы помещения лабораторий, в которых работа с биологически активными соединениями не проводится. Результаты, приведенные в табл. 2, показывают, что в нерабочие дни уровень летучих веществ с мутагенной активностью в воздухе помещений снижается (частота мозаицизма снижается с 3 до 2%). Данные табл. 2 показывают также, что в воздухе помещений лабораторий, в которых не проводятся работы с химическими соединениями, содержание веществ, обладающих мутагенной активностью, в рабочие и в выходные дни находится практически на одном и том же уровне (частота мозаицизма около 2%). Различия статистически значимы.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять наличие летучих соединений с мутагенной активностью, достоверно различать их уровень в воздушной среде помещений в дни с разным уровнем их нагрузки и выявлять их в материалах, подозреваемых на их наличие в них.

П р и м е р 3. Стаканчики с открытыми пробками, содержащие развивающиеся культуры Drosophila melanogaster (0-48 ч), были помещены в замкнутый объем (эксикатор) и экспонированы к табачному дыму, содержащем газовую фазу и дымовые частицы (смолу). Часть культур экспонировали к выдыхаемому курильщиком дыму коммерческих сигарет с обычным фильтром, часть к дыму таких же сигарет без фильтра и часть к дыму сигарет с экспериментальным фильтром, пропитанным специальным раствором. Использование закрытой камеры (эксикатора) позволяло поддерживать постоянную концентрацию испытуемого дыма.

Результаты показали, что экспериментальный фильтр более эффективно, чем обычный, задерживает соединения, вызывающие соматические мутации и рекомбинации у Drosophila meianogaster (см. табл. 3).

Использование открытых культур позволило определить в газовой среде не только летучие вещества табачного дыма, но и частицы смолки, которые не проникают через ватный тампон, если стаканчик с культурой дрозофил закрыт им.

П р и м е р 4. Открытые стаканчики с развивающейся культурой (0-48 ч) выдерживали 4 дня в штамповочном цехе резинового производства. Результаты представлены в табл. 4.

Использование: изобретение относится к экспериментальной генетике и медицине и может быть использовано для оценки окружающей среды с точки зрения ее мутагенной опасности. Сущность изобретения: в закрытом сосуде скрещивают самок y⁺⁺y⁺⁺ и самцов +WSn³/V Drosophila melanogaster, затем обеспечивают контакт исследуемого фактора с кладкой яиц и с образовавшимися из них личинками в период развития. У самок первого поколения регистрируют мутантные y и Sn³ макрохеты, а по результатам регистрации определяют наличие или отсутствие мутагенного летучего фактора в пробе. 4 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ МУТАГЕННОГО ФАКТОРА В ПРОБЕ, включающий скрещивание в закрытом сосуде самок y⁺⁺/y⁺⁺ и самцов +WSn³/y Drosophila melanogaster, обеспечение контакта фактора с кладкой яиц и затем с личинками в период из развития, регистрацию у самок первого поколения мутантных y и Sn³ макрохет нотума и определение по результатам регистрации наличия или отсутствия мутагенного фактора в пробе, отличающийся тем, что контакт кладки с фактором осуществляют путем помещения пробы и сосуда с кладкой в один общий замкнутый объем, при этом сосуд открывают и оставляют открытым до завершения периода личиночного развития.