ГЕПТАПЕПТИД С АДАПТОГЕННОЙ И АНКСИОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2001 года по МПК A61K38/00 A61P43/00 

Изобретение относится к области физиологии и может найти применение в медицине. Известен гептапептид (бета-казоморфин-7) формулы I Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile (I) (Brante V., Teschemacher H., Henschen A., Lottspeich F. Novel opioid peptides derived from casein (beta-casomorphins) I. Isolation from bovine casein peptone. Hoppe Scylers Z. Physiol. Chem., 1979, Sep., 360(9); 1211-6) [1].

Однако адаптогенная и анксиолитическая активность данного известного гептапептида не описана.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является выявление новых полезных свойств у известного соединения.

Указанный технический результат достигается тем, что выявлены адаптогенная и анксиолитическая активность у известного гептапептида формулы I.

Для выявления новых свойств гептапептида формулы I были выполнены эксперименты на детенышах нелинейных белых крыс обоих полов. Водный раствор пептида вводили внутрибрюшинно из расчета 2 мл/кг веса в дозе 1 мг/кг. Контрольные животные получали эквивалентные объемы воды. Первую инъекцию делали в конце первых суток после рождения и далее ежедневно в течение 13 дней.

Поведенческое тестирование проводилось в "открытом поле" (круглая арена диаметром 80 см) в двух модификациях: в течение 2 минут при свете красной лампы (возраст 21 день) и в течение 5 минут (возраст 35 и 49 дней). В последнем случае освещение на протяжении 180 сек было ярким, затем 60 сек красным, затем вновь ярким. Кроме того, у крыс определялись латентные периоды спуска с высоты и выхода из укрытия в центр поля.

Начиная с 51 по 53 дни жизни проводилось обучение животных с пищевым подкреплением в т. н. сложном лабиринте. Лабиринт имел пять разветвлений, проходя которые крыса могла двигаться в правильном (к подкреплению) либо ошибочном направлении. Ежедневно производилось по 5 посадок в лабиринт; максимальная длительность посадки 3 мин.

В возрасте 63 дня животные декапитировались, после чего проводился спектрофлюориметрический анализ содержания серотонина в мозжечке, стволе и коре больших полушарий.

Полученные результаты подвергались статистическому анализу с использованием различных непараметрических критериев. Таким образом, экспериментально впервые был разработан новый способ влияния на адаптивные возможности экспериментальных животных и снижения их избыточной тревожности с применением известного гептапептида: бета-казоморфина-7. Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1.

Через 21 день после рождения обнаружено, что у животных, получавших бета-казоморфин-7 (гептапептид общей формулы I), уровень горизонтальной двигательной активности в открытом поле стабильно выше, чем в контроле. Отличие достоверно на 2- й минуте тестирования, а также по сумме 2 минут регистрации (таблица 1), и в равной мере выражено у самцов и самок. Кроме того, в группе, получавшей гептапептид, достоверно повышены количество отходов от стенки арены (на 50%) и, только у самцов, вертикальная двигательная активность (на 45 %). Эти факты свидетельствуют об анксиолитическом (уменьшающем тревожность) действии препарата, ослаблении выраженности пассивно-оборонительной мотивации. Детеныши, получавшие в раннем постнатальном периоде бета-казоморфин-7, более активно обследуют новую обстановку, быстрее и легче к ней адаптируются.

Пример 2.

Повторное тестирование в "открытом поле" позволило доказать стабильный характер наблюдаемых поведенческих изменений. В возрасте 35 дней у крыс опытной группы остается повышенным уровень горизонтальной активности. Эффект наиболее выражен на 4-й минуте тестирования, когда смена яркого света на красный стимулирует исследовательскую деятельность животных (таблица 2). Повышение горизонтальной активности значимо и по сумме 3-5 минут наблюдений. Количество отходов от стенки арены достоверно увеличено у самок (на 60% по отношению к контролю).

Пример 3.

В возрасте 49 дней повышенный уровень горизонтальной активности выявляется на 3-5-й минутах тестирования; эффект наиболее выражен на 3-й минуте регистрации (таблица 3). Количество отходов от стенки арены в этот период выше контроля почти вдвое (в основном за счет самок). Значимо увеличена в опытной группе вертикальная активность (при этом у самцов превышение над контролем равно 130%).

У животных, получавших пептид, в примерах 2 и 3 уменьшены (p = 0.10-0.12) латентные периоды спуска с высоты и выхода из укрытия, что также является показателем снижения уровня тревожности. Значимости данная тенденция достигает у самок в случае выхода из укрытия, у самцов - в случае теста спуска с высоты.

Таким образом, выявлены адаптогенная анксиолитическая направленность и стабильность изменений поведения, вызываемых хронической инъекцией бета-казоморфина-7 новорожденным крысам. Особое значение имеет тот факт, что введение пептида осуществлялось в количествах (1 мг/кг с интервалом в сутки), сравнимых с теми, которые детеныши млекопитающих (в том числе и человека) получают с молоком матери.

Поведенческие изменения, зарегистрированные у самцов и самок, отчасти имеют зависимую от пола специфику. Для самцов более характерно увеличение вертикальной двигательной активности, для самок - отходов от стенки арены. Однако в целом изменения однонаправлены, и, если даже не достигают значимого уровня, имеют вид достаточно четких тенденций (p = 0.06-0.20).

Пример 4.

При трехдневном обучении в лабиринте (возраст 51-53 дня) выявлено, что у животных, получавших бета-казоморфин-7, происходит достоверное ускорение выработки двигательного навыка. Показано (табл. 4), что в 1-й день обучения крысы, получавшие пептид, значимо быстрее выходят из стартового отсека и совершают меньшее количество ошибок. Во 2-й день сокращено не только время выхода из стартового отсека, но и время выполнения реакции. Уменьшение количества ошибок по сравнению с контролем достигает наибольшего уровня достоверности. На 3-й день отличия между контрольной и опытной группами практически исчезают, поскольку контрольные животные быстро "доучиваются" до максимально возможного уровня.

Как известно, в случае обучения с пищевым подкреплением избыточная тревожность крыс препятствует выработке навыка. Следовательно, улучшение обучения у животных, получавших бета-казоморфин-7, также является свидетельством анксиолитических и адаптогенных эффектов хронического введения пептида. Описанные результаты совпадают с полученными ранее в работах на взрослых крысах (при изучении эффектов однократного введения бета-казоморфина-7).

Пример 5.

В возрасте 63 дня у животных определялось содержание серотонина в различных отделах головного мозга. Показано, что в стволе, где расположена основная масса серотонинергических нейронов, концентрация медиатора в группе с введением пептида значимо не меняется. Вместе с тем в мозжечке выявлено достоверное понижение уровня серотонина по сравнению с контролем (с 0.53 до 0.42 мкг/г). Одновременно наблюдается незначимое, но достаточно выраженное повышение содержания медиатора в коре больших полушарий (с 0.57 до 0.65 мкг/г; p = 0.09). В целом же происходит достоверное изменение баланса в содержании серотонина между передним и задним мозгом. Следует отметить определенное сходство такого эффекта с действием ряда антидепрессантов, которые, ослабляя распад и обратный захват серотонина в высших отделах центральной нервной системы, снимают избыточную тревожность пациентов.

Таким образом, исходя из полученных результатов, хронически вводимый в раннем постнатальном периоде бета-казоморфин-7 вызывает отставленные как поведенческие, так и нейрохимические изменения, причем первые зарегистрированы через 1-6 недель, а вторые - через 7 недель после прекращения инъекций пептида. Обнаруженные эффекты носят анксиолитическую направленность, снижая тревожность и повышая адаптивные возможности центральной нервной системы.

Изобретение относится к области фармакологии, медицины и биологии. Впервые для фрагмента белка молока (гептапептида Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile) обнаружено наличие отставленного анксиолитического действия на детенышей млекопитающих, что подтверждается поведенческими и нейрохимическими тестами, проводимыми через 1-7 недель после прекращения введения пептида. Средство позволяет снизить тревожность и повысить адаптивные возможности центральной нервной системы. 4 табл.

Применение гептапептида формулы I
Tyr - Pro - Phe - Pro - Gly - Pro - Ile
в качестве средства с адаптогенной и анксиолитической активностью.