СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕИНФИЦИРОВАННОЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/16 

Изобретение относится к комбинированным способам получения неинфицированной плазмы крови.

Плазма крови используется в медицине для многочисленных показаний. Соответственно велико ее клиническое значение. Плазму крови получают путем отделения клеток крови от цельной крови доноров. Для того, чтобы можно было избежать заражения пациента патогенными компонентами донорской плазмы, такими как вирусы гепатита и ВИЧ, она не должна содержать интактных вирусов. Поэтому до сих пор можно было использовать плазму лишь отдельных доноров, которые по данным длительных наблюдений считались здоровыми, в том плане, что они не являлись носителями вирусов. Смешение (Poolen объединение) плазмы нескольких доноров было исключено.

Недостатком такого метода являются огромные затраты на приготовление отдельных препаратов. Существующий уровень техники не позволяет организовать получения таких препаратов непрерывным способом. Результатом этого является недостаток, заключающийся в том, что лишь с помощью непомерно больших, едва ли оправданных затрат, можно получать стандартизированные препараты плазмы. Так, в частности, вследствие единичных приготовлений содержание белка в донорской фракции меняется от случая к случаю. Поэтому при использовании плазмы, полученной путем разового приготовления, следует учитывать фактическое содержание белка в соответствующей партии.

В принципе возможно инактивировать вирусы с помощью химических добавок. Однако в этом случае возникает серьезная проблема, связанная с удалением использовавшегося для инактивации инфекционных компонентов средства. В соответствии с разработанным Нью-Йоркским Центром крови способом для инактивирования вирусов используют поверхностно-активные вещества. Серьезная проблема в этом случае связана с необходимостью удаления после инактивации вирусов поверхностно-активных веществ из плазмы. Горовицем было предложено удалять поверхностно-активные вещества из обработанных ими препаратов методом гидрофобной хроматографии с использованием обратнофазных материалов.

В европейском патенте А-0 239 859 описан способ очистки плазмы крови путем экстракции природными растительными маслами, например соевым маслом.

Цель изобретения создание непрерывного способа получения неинфекционной плазмы крови. Одной из возникающих при этом проблем является проблема разработки надежного способа удаления используемых для инактивации вирусов поверхностно-активных веществ. Кроме того, желательно, чтобы такой способ давал возможность непосредственно получать препараты плазмы с стандартизированным содержанием белка.

Известен способ удаления поверхностно-активных веществ из плазмы крови путем гидрофобной обратнофазной хроматографии с использованием силикагелевой матрицы с октадециловым покрытием (европейский патент А-0 366 946).

При этом возникает другая техническая проблема, заключающаяся в том, что в процессе экстракции незначительная часть покрытия использующихся при обратнофазной хроматографии силикатных носителей разрушается. При этом лишенные покрытия частицы силиката активируют имеющиеся в плазме крови факторы свертывания, следствием чего является нежелательное разрушение последних.

Решением всех этих технических проблем в соответствии с настоящим изобретением является комбинированный способ получения неинфекционной плазмы крови, по которому плазму обрабатывают неионогенными поверхностно-активными веществами, перед отделением липидного слоя добавляют биологически совместимые липиды, отделяют липидную фазу и удаляют неионогенное поверхностно-активное вещество путем твердофазной экстракции на гидрофобных материалах.

При этом в качестве плазмы крови можно использовать как свежеприготовленные препараты, так и замороженные при низких температурах фракции. В последнем случае замороженную фракцию оттаивают на водяной бане. После достижения определенной температуры (25^оС) плазму (при желании) фильтруют и контролируют рН раствора. Процесс оттаивания проводят в течение примерно 1-2 ч, рН раствора 7,0-7,4.

После этого обработанную таким образом плазму крови обрабатывают смесью неионогенных поверхностно-активных веществ и воды при 20-40, предпочтительно 30^оС. В качестве неионогенных поверхностно-активных веществ можно использовать, в частности, три-N-бутилфосфат (TNPB) и/или тритон Х-100. Целесообразно выдержать эту смесь в течение некоторого времени при легком перемешивании при повышенной температуре. Перед центрифугированием липидную фракцию обогащают биологически совместными липидами, например растительными маслами, например соевым и/или касторовым маслом. После этого липидную фракцию удаляют путем центрифугирования. Можно также отделить липидную фракцию от плазмы крови путем фильтрации через гидрофобный фильтр. По варианту осуществления предлагаемого способа к ней при этом добавляют примерно 10% растительного масла. После центрифугирования разделяют липидный слой и слой плазмы с помощью сифона или непрерывно работающей центрифуги с автоматическим разделением фаз.

Слой плазмы собирают, а липидный слой отбрасывают. После этого следует стадия фильтрации (не являющаяся обязательной), а остаточное количество неионогенного поверхностно-активного вещества удаляется из плазмы с помощью твердофазной экстракции. В качестве гидрофобного материала для твердофазной экстракции используют материал, применяющийся в обратнофазной хроматографии. В этой связи в первую очередь следует упомянуть носители с покрытием из С-18, которые используются также в высокопроизводительной жидкостной хроматографии. В качестве материала носителя можно использовать, в частности, силикагель, имеющий тот недостаток, что при отсутствии покрытия он вызывает активацию имеющихся в плазме крови факторов, что приводит к их разрушению. Этого нежелательного эффекта можно избежать за счет использования подходящих органических носителей, таких как сефакрил, супероза (фирма Pharmacia) или фрактогель ^(R) TSK (E. Merck). По варианту осуществления твердофазную экстракцию можно осуществлять в форме хроматографии. Соотношение между объемом неподвижного слоя и объемом обрабатываемой плазмы составляет 1:6-1:20, наиболее предпочтительно 1:10.

После твердофазной экстракции при необходимости осуществляют контроль рН, рН раствора устанавливают равным 7,0-7,4. Затем следует стерильная фильтрация, после чего плазму крови при желании подвергают сублимационной сушке в присутствии обычных лиофилизирующих вспомогательных добавок, например лизина или глицина.

Предлагаемый способ позволяет отказаться от обычной обработки единичных партий плазмы. Его можно осуществлять в промышленных масштабах. В частности, благодаря ему становится возможным непрерывное осуществление. Другое преимущество заявляемого способа состоит в том, что благодаря возможности непрерывного осуществления условия проведения процесса можно выбрать таким образом, чтобы содержание белка в конечном продукте было одинаковым или по крайней мере очень близким. Это облегчает работу с препаратами плазмы крови в клинике, в частности при многократном приеме, так как отпадает проблема изменения содержания белка, имеющая место в случае единичных препаратов.

П р и м е р. 20 л плазмы крови (80 х 250 мл) оттаивают на водяной бане при 25^оС в течение 1,5 ч. При желании фракцию после оттаивания фильтруют через сетчатый фильтр или фильтрующие патроны (например, фирмы Pal, 100 мкм). Затем плазму заливают в 50-литровый реактор из нержавеющей стали при 30^оС. Для перемешивания используют пропеллерную мешалку. Измеряют рН оттаявшей плазмы и с помощью 0,5 н соляной кислоты, устанавливают его значение равным 7,0-7,4.

Готовят смесь TNBP, тритона Х-100 и дистиллированной воды. Указанные компоненты берут в следующем соотношении: TNBP:тритон Х-100:дистиллированная вода 0,5-2:0,5-2:2-4. При данной загрузке по наиболее предпочтительному варианту осуществления берут 200 мл TNBP 200 мл тритона Х-100 и 800 мл дистиллированной воды. Смесь также нагревают до ≈30^оС. После этого смесь неионогенных поверхностно-активных веществ добавляют к плазме. Смесь осторожно перемешивают при 30^оС и через 4 ч центрифугируют плазму. Центрифугирование проводят при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение часа при 12^оС. Для увеличения объема липидной фазы к реакционной смеси перед центрифугированием добавляют примерно 10 об. соевого или касторового масла. После центрифугирования разделяют липидный и плазменный слои. Разделение может быть осуществлено с помощью сифона или путем фильтрации через гидрофобный фильтрующий материал, например через фильтр Zetaplus DEL (фирма Cuho), который может быть микронизирован. Слои, содержащие плазмы, собирают и фильтруют через инертную по отношению к балкам фильтрующую мембрану (например, фирмы Pal, диаметр пор 3-5 мкм). В результате получают 19 л плазмы.

Полученную плазму обрабатывают адсорбентом Prep C-18 (фирма Waters) или Pro RPC 5/5 (фирма Pharmacia). Для обработки 19 л плазмы суспендируют 1,2 кг в 2,4 л воды. Хроматографию проводят на колонке диаметром 15 см. Скорость протока составляет 300 мл/мин. Элюат контролируют УФ-прибором. Выходящую из колонки фракцию, содержащую плазму, собирают и при необходимости устанавливают ее рН равным 7,0-7,4 с помощью 0,5 н едкого натра.

Полученную плазму стерилизуют, для чего пропускают ее через мембранный фильтр (0,22 мкм) и высушивают методом сублимационной сушки, после чего фасуют в склянки емкостью 250 мл.

Известен комбинированный способ получения неинфицированной плазмы крови, отличающийся тем, что плазму обрабатывают неионогенными поверхностно-активными веществами, перед отделением липидного слоя добавляют к ней биологически совместимые липиды, отделяют липидную фазу и удаляют неионогенные поверхностно-активные вещества путем твердофазной экстракции на гидрофобных материалах. 14 з.п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕИНФИЦИРОВАННОЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ путем обработки плазмы неионогенными поверхностно-активными веществами, отличающийся тем, что перед отделением липидного слоя добавляют к ней биологически совместимые липиды, отделяют липидную фазу и удаляют неионогенные поверхностно-активные вещества с помощью твердофазной экстракции на гидрофобных материалах. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что замороженную при низкой температуре плазму крови медленно оттаивают при 20 30^oС. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH плазмы устанавливают равным 7,0 7,4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неиногенных поверхностно-активных веществ используют три-N-битилфосфат (TNBP) и/или тритон X-100. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют водную смесь TNBP и тритона X-100. 6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что TNBP, тритон X-100 и воду в смеси берут в соотношении (0,5 2) (2 4). 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что липидную фазу отделяют путем центрифугирования. 8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что липидную фазу удаляют путем фильтрации через гидрофобный фильтрующий материал. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество липидов составляет около 10 об. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что твердофазную экстракцию проводят на материалах, использующихся для обратнофазной хроматографии. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют дериватизированные октадецилом материалы для обратнофазной хроматографии. 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что твердофазную экстракцию проводят путем С 18-обратнофазной хроматографии. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что после твердофазной экстракции, контроля при необходимости pH и установления его значения равным 7,0 7,4 проводят стерилизацию путем фильтрации. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что плазму крови высушивают методом сублимационной сушки. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобный фильтрующий материал микронизируют.