РАСТВОР АЛЬБУМИНА И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/38 A61K35/14 

Данное изобретение относится к терапевтически применимому, прошедшему вирусную инактивацию альбумину и к способу его получения.

Альбумин представляет собой белок плазмы с наибольшей массовой долей. Молекула альбумина может связываться со многими эндогенными и экзогенными веществами. Эта способность к связыванию является также основой одной из самых главных его функций: транспорта веществ, связанных с альбумином.

Благодаря этой способности к связыванию альбумин является также важным депо для широкого ряда соединений, таких как жирные кислоты с длинной цепью, билирубин, триптофан, тироксин или ионы металлов. Введенные фармакологически активные вещества, такие как варфарин, дигитоксин или напроксен, также связываются с альбумином и транспортируются.

Однако в этой связи определяющим является знание того, что только свободная фракция соответствующего фармакологически активного вещества, т.е. та, которая не связывается с альбумином, оказывает фармакологическое действие. Уменьшение доли, связанной с альбумином, увеличивает свободную фракцию и, таким образом, фармакологическую активность.

Коммерчески доступные препараты альбумина получают посредством модифицированного фракционирования по Кону (Cohn), способа, который обычно состоит из нескольких стадий фракционирования. В течение десятилетий применялась пастеризация (10 часов при 60°C) концентрата альбумина в качестве стадии инактивации вирусов. Чтобы избежать денатурации альбумина во время этой стадии, используют стабилизаторы. В соответствии с Европейской Фармакопеей в качестве стабилизатора используется каприлат натрия (октаноат натрия) или N-ацетилтриптофан или комбинация их обоих.

Чтобы получить прошедшие вирусную инактивацию препараты фактора VIII или другие белки плазмы, применяют так называемый метод SD, который описан, например, в ЕР-А-0131740. Это опубликованное описание включено сюда в виде ссылки.

По собственным исследованиям авторов известно, что способность к связыванию коммерчески доступного альбумина значительно снижена по сравнению с природным альбумином. Это объясняется тем фактом, что используемые при пастеризации стабилизаторы связываются с альбумином и, таким образом, занимают важные транспортировочные сайты, в результате чего связывающая способность снижается. Это означает, что пациенты, которые получают такие препараты альбумина, подвергаются воздействию значительно повышенной концентрации свободного активного вещества, т.е. вещества, не связанного с альбумином, когда вводят фармакологически активные вещества, что, естественно, означает повышенный риск усиления фармакологических эффектов у пациента.

Целью данного изобретения является получение препарата альбумина, у которого нет этого недостатка.

На фигуре 1 представлен профиль поглощения альбуминов из разных источников в ультрафиолетовом диапазоне в виде функции времени элюирования во время хроматографического разделения.

На фигуре 2 проиллюстрированы характеристики связывания альбуминов из разных источников в присутствии разных концентраций фенилбутазона.

На фигуре 3 проиллюстрированы характеристики связывания альбуминов из разных источников в присутствии разных концентраций варфарина.

Поставленной цели достигают с помощью терапевтически применимого, прошедшего вирусную инактивацию альбумина, обладающего повышенной способностью связывания в отношении веществ по сравнению с прошедшим вирусную инактивацию пастеризацией альбумином. В частности, альбумин по данному изобретению обладает способностью связывания, которая повышается, по меньшей мере, на 10% свыше способности альбумина, прошедшего вирусную инактивацию пастеризацией, обычно связывающей способностью, которая повышена на от 20 до 500%, в основном, связывающей способностью, которая повышена на от 100 до 500%. В отдельных случаях возможны даже более высокие значения, в зависимости от связываемого вещества.

Данные вещества, главным образом, представляют собой вещества, которые связываются и/или транспортируются природным альбумином, в частности, включая активные вещества с низкой молекулярной массой. В частности, вещества с низкой молекулярной массой являются органическими или неорганическими веществами, нуклеиновыми кислотами, полипептидами, которые обычно имеют молекулярную массу ≤ 10000 Да.

Для целей терапевтического применения, указанного выше, альбумин по данному изобретению может быть в виде жидкого раствора или в твердом состоянии, в частности в лиофилизированном виде.

Альбумин по данному изобретению может быть также получен способом, который характеризуется сочетанием следующих стадий:

(а) проведение обработки первого водного раствора альбумина для инактивации вирусов методом SD путем контактирования с реагентами SD при температуре ниже 45°C;

(b) удаление, по меньшей мере существенное, реагентов SD масляной экстракцией с последующей хроматографией гидрофобного взаимодействия, причем гидрофобный матрикс, в частности матрикс, с которым могут, необязательно, связываться гидрофобные группы, используется для указанной хроматографии при условии, что указанные группы являются алифатическими группами из более чем 24 атомов углерода, с получением второго раствора альбумина, к которому

(с) необязательно добавляют один или несколько стабилизаторов, выбранных из группы сахаров, аминокислот и сахарных спиртов, при условии, что в качестве указанного катализатора не используют индольных стабилизаторов и С₆-С₁₀ жирных кислот, после чего

(d) указанный второй раствор альбумина, к которому, необязательно, добавлен стабилизатор, подвергают окончательной упаковке и стерилизующему фильтрованию, и которым, необязательно, заполняют конечные контейнеры.

Термин «индольный стабилизатор» должен включать все стабилизаторы, которые имеют индольный скелет, такой как N-ацетилтриптофан.

Метод SD (=растворитель/детергент) для инактивации вирусов был известен из ЕР-А-0131740. В этом описании также упоминается альбумин среди других белков.

Действительно, из ЕР-А-0366946 известно, что реагенты SD могут быть удалены с помощью растительных масел, например соевого масла, с последующей хроматографией гидрофобного взаимодействия. Таким образом, поскольку он перекрывает способ по ЕР-А-0366946, способ по пункту 8 должен рассматриваться как аналогичный способ получения альбумина по данному изобретению в одном из аспектов. Однако для хроматографии в вышеприведенном патенте предлагается матрикс, например матрикс из двуокиси кремния, с которым связаны гидрофобные боковые цепи, т.е. разветвленные или неразветвленные С₆-С₂₄ алкильные цепи.

Неожиданно было обнаружено, что использование гидрофобного матрикса вместо матрикса, который несет С18 алкильные цепи, например, в виде боковых цепей, приводит к более высокой связывающей способности в отношении адсорбции детергентов. Соответственно, не нужны дополнительные гидрофобные группы для связывания с матриксом, используемым в соответствии с данным изобретением. Поэтому данное изобретение относится также к способу, при котором используют такой матрикс.

Инактивация вирусов преимущественно осуществляется при температуре в интервале от 25 до 40°С.

При предпочтительном осуществлении способа по данному изобретению инактивация вируса осуществляется в течение срока в интервале от 4 до 6 часов.

В качестве стабилизатора могут быть использованы глицин, глутамат, аргинин или лизин или их комбинации.

Касторовое масло очень хорошо подходит для масляной экстракции.

Было обнаружено особое преимущество эффекта очистки, если в качестве указанного гидрофобного матрикса используют полистиролдивинилбензольный полимер или полимер на основе метакрилата.

Гидрофобные матрицы в соответствии с данным изобретением могут нести разветвленные или линейные алифатические группы из более чем 24 атомов углерода.

В зависимости от применяемого исходного материала может быть необходима стадия истощения активности так называемого прекалликреинового активатора (ПКА). Известно, что ПКА вызывает падение давления крови после введения содержащих ПКА препаратов путем высвобождения вазоактивного вещества брадикинина из кининогена с высокой молекулярной массой (КВМВ).

ПКА обычно инактивируют во время пастеризации белковых препаратов. Так как тепловая обработка, посредством которой ПКА, по меньшей мере, частично инактивируется, как известно из предшествующего опыта, является неблагоприятной для альбумина, получаемого в соответствии с данным изобретением, по причинам, названным выше, ПКА может быть удален специальными средствами, если необходимо. Эти средства включают инкубацию с активированным углем с последующим фильтрованием, предпочтительно с помощью погруженных фильтров, или прямым фильтрованием через фильтры, содержащие активированный уголь.

Кроме того, для удаления ПКА очень подходят ионообменные смолы, такие как катионные или анионные ионообменные смолы. Это может быть осуществлено путем контактирования альбуминосодержащего раствора с матриксом в колонках или с помощью процессов с периодической загрузкой, известных специалистам в данной области. Альтернативно, можно использовать декстрансульфатные или гепариновые матрицы для снижения содержания ПКА.

В полученных содержащих альбумин растворах количество ПКА снижено и больше не определяется в оптимальном случае. В соответствии с современным состоянием в данной области ПКА идентичен активированному фактору (коагуляции) XII (ФХIIa), который образуется из его проферментной формы (ФХII). Это может происходить на поверхностях путем автокатализа или посредством ферментативного действия, например, калликреина. Соответственно, истощение ФХII (профермент), являющегося предшественником ПКА, также рекомендуется, но не обязательно необходимо. Однако, чтобы предотвратить возобновленное образование ПКА из проферментной формы, последнюю также можно удалить ионообменной хроматографией. Истощение ФХII может быть выполнено по желанию, чтобы сделать возможным долговременное хранение альбумина в жидком состоянии. Это также важно после оттаивания раствора альбумина, который может храниться в замороженном состоянии. Соответственно, раствор альбумина может быть глубоко заморожен после заполнения им конечных контейнеров, но он может быть также охлажден в жидком или лиофилизированном состоянии и храниться при температуре до 40°C.

Таким образом, чтобы удалить ПКА или вещества предшественников ПКА, любую активность активатора прекалликреина (ПКА), которая может присутствовать до или после стадий (а), (b) или (с), можно удалить известным способом, в частности, когда раствор альбумина:

А) приводят в контакт с активированным углем с последующим удалением активированного угля из раствора альбумина; или

В) подвергают ионообменной хроматографии.

Стадию (А) осуществляют при концентрации альбумина от 1 до 25 мас.%, главным образом от 5 до 10 мас.%.

Стадию (В) выполняют, в частности, при концентрации альбумина от 5 до 10 мас.%.

При дополнительном воплощении способа по данному изобретению ионообменное вещество является анионообменным веществом, и раствор альбумина забуферен ацетатом натрия в интервале от 100 до 150 ммоль/л, и рН находится в интервале от 5,0 до 6,0, главным образом < 5,5.

Кроме того, описан способ, который отличается тем, что указанное ионообменное вещество является катионообменным веществом, и раствор альбумина забуферен ацетатом натрия в интервале от 20 до 30 ммоль/л, и значение рН находится в интервале от 4,8 до 6,0, главным образом в интервале от 4,8 до 5,2.

Данное изобретение, кроме того, относится к раствору альбумина, который можно получить способом по данному изобретению. Этот способ можно применять в отношении растворов альбумина, полученных из разных источников, например из плазмы крови или сыворотки, из содержащих альбумин фракций фракционирования плазмы, из альбумина, выделенного из супернатанта культуры после рекомбинантного получения, или из трансгенно полученного альбумина, или из среды, содержащей альбумин, такой как молоко.

Предпочтительное воплощение данного изобретения дополнительно описано с помощью следующего примера.

Пример

К 1000 г водного раствора альбумина, полученного методом Кона (после диафильтрации/ультрафильтрации) и имеющего содержание белка примерно 23%, добавляют тритон Х-100 и три-н-бутилфосфат (ТНБФ) до концентрации, равной 1%, каждого. Затем раствор альбумина перемешивают при 30°C в течение 4 часов.

Чтобы удалить реагенты SD, сначала добавляют при перемешивании касторовое масло до концентрации, равной 5%, в то время как раствор доводят до температуры в интервале от 20 до 25°C. Затем смесь перемешивают в течение 30 минут. После перемешивания смесь оставляют стоять в течение 60 минут с образованием тяжелой водной и легкой фазы. Тяжелую фазу отделяют и фильтруют через фильтр, имеющий мембраны с размером пор < 1 мкм и < 0,45 мкм. Легкая фаза (масляная фаза) содержит ТНБП и ее отбрасывают.

Чтобы отделить тритон X-100, фильтрованный раствор пропускают через колонку твердофазного экстрагирования. Полистиролдивинилбензольный полимер (амберхром CG 161, Amberchrome CG 161) без гидрофобных боковых цепей используют в качестве гидрофобной матрицы. Воду для инъекций используют для очистки колонки, этот процесс контролируют измерением ультрафиолетового поглощения при 280 нм. После использования колонку регенерируют.

В качестве стабилизаторов можно добавлять следующее: глицин, глутамат, аргинин, мальтозу, сорбит или смеси этих веществ.

Полученный раствор доводят до рН 7,0 и содержание белка доводят до 200 г/л, а содержание натрия до 80 ммоль/л Na⁺. Затем раствор подвергают стерилизующему фильтрованию через мембранный фильтр, имеющий размер пор ≤ 0,2 мкм.

Стерильным профильтрованным раствором заполняют стерильные апирогенные ПВХ пакеты в асептических условиях и пакеты снабжают этикеткой.

Пакеты с этикетками подвергают глубокому замораживанию при температуре < -60°C, так что температура в пакетах достигает < -30°C. При этой температуре(≤ -30°C) пакеты хранят.

Очищение от прекалликреина

Когда нужно очистить от ПКА, можно использовать следующие варианты метода:

а) Раствор альбумина, имеющий концентрацию белка от 1 до 25 мас.%, главным образом от 5 до 10 мас.%, перемешивают в течение одного часа с 3-10 мас.%, главным образом, 5 мас.%, активированного угля при рН 5. Затем активированный уголь отфильтровывают.

b) Раствор альбумина, имеющий концентрацию белка от 5 до 10 мас.%, подвергают ионообменной хроматографии (DEAE-сефароза, Q-сефароза) при рН 5-6, главным образом < 5,5, в системе, забуференной 100-150 мМ ацетатом натрия. Благодаря высокой ионной силе в фильтрате получают раствор альбумина без ПКА.

с) Раствор альбумина, имеющий концентрацию белка от 5 до 10 мас.%, подвергают ионообменной хроматографии (SP Toyopearl, СМ-сефароза) при рН 5-6, предпочтительно 4,8-5,2, в системе, забуференной 20-30 ммоль/л ацетатом натрия. В фильтрате получают раствор альбумина без ПКА.

Окончательное изготовление препарата

Полученные растворы доводят до рН 7,0, и содержание белка доводят до 200 г/л, а содержание натрия до 80 ммоль/л Na⁺. Затем раствор подвергают стерильному фильтрованию через мембранный фильтр, имеющий размер пор < 0,2 мкм.

Стерильными профильтрованными растворами заполняют стерильные апирогенные ПВХ пакеты в асептических условиях и пакеты снабжают этикеткой.

Пакеты с этикетками подвергают глубокому замораживанию при температуре < -60°C, так что температура в пакетах достигает < -30°C. При этой температуре (≤ -30°C) пакеты хранят.

Количественное определение связывания веществ разными препаратами альбумина

Прямым методом определения свойств связывания веществ альбумином является хроматография исключения по размеру (SEC) по Hummel and Dreyer (Biochim. Biophys. Acta 1962; 63: 530-532).

Таким образом, колонку для SEC уравновешивают буферным раствором, содержащим связывающий лиганд (например, фенилбутазон или варфарин). Непрерывно контролируют поглощение в ультрафиолетовой области. Белок наносят на колонку и элюируют буфером для уравновешивания. Связанный лиганд элюируется вместе с альбумином, тогда как несвязанный лиганд, который меньше в большинстве случаев, элюируется, соответственно, позднее. Абсорбция связанного лиганда в большинстве случаев мешает абсорбции альбумина и возможных сопутствующих веществ, таких как стабилизаторы. Чем позднее вызывается элюирование «отрицательного» или так называемого «пустого» пика при уменьшении лиганда в последующем буфере, который занимает большую часть площади поверхности, тем большее связывание ранее элюированного альбумина происходит. Koizumi et al. (Biomed. Chromatogr. 1998; 12: 203-210) использовали этот метод в слегка модифицированном виде, чтобы оценить способность связывания веществ с альбумином или их аффинности, например, путем добавления повышающихся количеств лиганда к постоянным концентрациям альбумина в отдельных циклах, причем связывающую способность можно было установить в виде отношений альбумина к веществу.

Для этих оценок использовали колонку Biosep-SEC-s 4000, 300 x 4,6 мм микрон (Phenomenenx) на установке для ВЭЖХ Shimadzu. Расход буфера составлял 0,35 мл/мин, причем колонку уравновешивали 50 мМ калийфосфатным буфером, рН 7,4. Концентрация белка составляла 50 мкМ, объем инжекции составлял 80 мкл. Фенилбутазон контролировали при 263 нм, а варфарин при 308 нм. Области линейной абсорбции определяли заранее.

Использовали альбумин, который описан в этом изобретении (1), а также два промышленно получаемые (стабилизированные) препараты альбумина (2, 3). Они были 20% растворами альбумина.

На фигуре 1 представлено наложение четырех разных хроматограмм, колонка, уравновешенная в 50 мкМ фенилбутазоне (в фосфатном буфере). При времени удержания, равном 11 минутам, альбумин элюировался первым, причем пик показывает величину абсорбции белка и величину абсорбции связанного вещества. При 14,5 мин обычно обнаруживают пик N-ацетилтриптофана (стабилизатор) в случае коммерческого альбумина. После 18,5 мин появляется «пустой» пик в виде «отрицательного» представления абсорбции относительно уровня уравновешивающего буфера, включающего вещество. Чем выше (в отрицательном смысле) этот пик или больше площадь пика, тем больше вещества было связано с ранее элюированным альбумином.

На фигуре 2 представлено поглощение в ультрафиолетовом диапазоне растворов с тремя концентрациями фенилбутазона, связанного с альбумином (после вычитания пика буфера). Таким образом, два коммерчески доступных альбумина (содержащих каприлат и N-ацетилтриптофан) и альбумин, получаемый способом, описанным в данном изобретении, подвергали хроматографии и сравнивали степень связывания. Для сравнимых молярных концентраций фенилбутазона по отношению к альбумину четко обнаружено, что пики значительно больше по высоте и площади в случае нового альбумина. Это также сохраняется для второго примера, а именно варфарина, как показано на фигуре 3.

Эти результаты подчеркивают, что коммерческий альбумин хуже альбумина, описанного здесь, по свойству связывания.

Сравнение способности к связыванию колонок RP-18 по сравнению с полистиролдивинилбензольными полимерами (амберхром 161 М).

Система для испытания: объем колонки 44 мл.

Скорость потока: 4 мл/мин

Колонку загружают 1% раствором тритона Х-100. Содержание тритона Х в элюате определяют после каждого объема колонки с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Если тритон можно было обнаружить в элюате, возможности геля исчерпывались полностью.

Результат:

Гель RP-18 связывает 140 мг тритона Х-100/мл геля, и гель амберхрома связывает 160 мг тритона Х-100/мл геля.

Изобретение относится к терапевтически применимому, прошедшему вирусную инактивацию альбумину и к способу его получения. Способ получения альбумина отличается комбинацией из следующих стадий: (а) проведение обработки первого водного раствора альбумина для инактивации вирусов методом SD (растворитель/детергент) путем контактирования с реагентами SD при температуре ниже 45°С; (b) удаление реагентов SD масляной экстракцией с последующей хроматографией гидрофобного взаимодействия, причем гидрофобный матрикс, в частности матрикс, с которым могут, необязательно, связываться гидрофобные группы, используется для указанной хроматографии при условии, что указанные группы являются алифатическими группами из более чем 24 атомов углерода, с получением второго раствора альбумина, к которому (с) необязательно добавляют один или несколько стабилизаторов, выбранных из группы сахаров, аминокислот и сахарных спиртов, при условии, что в качестве указанного стабилизатора не используют индольный стабилизатор и С₆-С₁₀ жирную кислоту, после чего (d) указанный второй раствор альбумина, к которому, необязательно, добавлен стабилизатор, подвергают окончательной упаковке и стерилизующему фильтрованию, и которым, необязательно, заполняют конечные контейнеры. Изобретение обеспечивает получение терапевтически применимого, прошедшего вирусную инактивацию альбумина, обладающего повышенной способностью связывания в отношении веществ по сравнению с альбумином, прошедшим вирусную инактивацию с помощью пастеризации. При этом альбумин по данному изобретению обладает способностью связывания, которая повышается, по меньшей мере, на 10% свыше способности альбумина, прошедшего вирусную инактивацию пастеризацией, обычно связывающей способностью, которая повышена на от 20 до 500%. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения альбумина, отличающийся комбинацией из следующих стадий:

(a) проведение обработки первого водного раствора альбумина для инактивации вирусов методом SD (растворитель/детергент) путем контактирования с реагентами SD при температуре ниже 45°С;

(b) удаление, по меньшей мере существенное, реагентов SD масляной экстракцией с последующей хроматографией гидрофобного взаимодействия, причем гидрофобный матрикс, в частности матрикс, с которым могут, необязательно, связываться гидрофобные группы, используется для указанной хроматографии при условии, что указанные группы являются алифатическими группами из более чем 24 атомов углерода, с получением второго раствора альбумина, к которому

(c) необязательно добавляют один или несколько стабилизаторов, выбранных из группы сахаров, аминокислот и сахарных спиртов, при условии, что в качестве указанного стабилизатора не используют индольный стабилизатор и С₆-С₁₀ жирную кислоту, после чего

(d) указанный второй раствор альбумина, к которому, необязательно, добавлен стабилизатор, подвергают окончательной упаковке и стерилизующему фильтрованию, и которым, необязательно, заполняют конечные контейнеры.

a) контактирования раствора альбумина с активированным углем с последующим удалением активированного угля из раствора альбумина; или

b) проведения ионообменной хроматографии раствора альбумина.