СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ФАКТОРА IX Российский патент 1995 года по МПК A61K38/43 

Изобретение относится к медицине, в частности к созданию препаратов крови на основе фракционирования донорской плазмы.

Известны способы получения концентрата фактора IX (протромбинового комплекса), являющегося антигемофильным препаратом, путем фракционирования криосупернатанта донорской плазмы с помощью таких адсорбентов, как фосфат кальция, гидроокись алюминия и сульфат бария. Однако низкая специфичность этих адсорбентов по отношению к протромбиновому комплексу не позволяет обеспечить достаточно полное удаление балластных белков, что отрицательно сказывается на качестве и выходе конечного продукта, вследствие чего данные адсорбенты не нашли широкого применения.

Наиболее близким к предлагаемому аналогом, решающим ту же задачу и нашедшим практические применение, в том числе и в производственных масштабах, является способ получения концентрата фактора IХ, основанный на анионообменной хроматографии, где в качестве адсорбента применяют анионообменник ДЕАЕ-Сефадекс А 50. Способ включает стадии сорбента протромбированного комплекса на носителе, промывки носителя, элюции сорбированного комплекса, его обессоливание гельфильтрацией и последующую стерильную фильтрацию и лиофилизацию.

Недостатком способа являются значительные загрязнения получаемого продукта балластными белками, обусловленные недостаточной специфичностью сорбента по отношению к протромбиновому комплексу и снижающие эффективность и качество препарата. Это заставляет производителей искать дополнительные пути очистки, что неизбежно приводит к уменьшению выхода конечного продукта. Снижают выход также потери в процессе гельфильтрации на стадии обессоливания.

Цель предлагаемого изобретения улучшение качества получаемого концентрата фактора IX и увеличение выхода конечного продукта.

Для этого стадия фракционирования осуществляется на анионообменнике ДЕАЕ-Тойоперл вместо ДЕАЕ-Сефадекс А-50, что позволяет на первом же этапе получить высокоочищенный протромбиновый комплекс. Предлагаемый способ включает стадии сорбции, промывки, элюции протромбинового комплекса. При этом во избежание дополнительных потерь стадию обессоливания осуществляют не гельфильтрацией, а с использованием полых волокон с последующими стерильной фильтрацией и лиофилизацией.

В литературе есть указания на применение ДЕАЕ-Тойоперл для разделения методом аналитической колоночной хроматографии различных биополимеров в количествах не более 30 мг. Полые волокна находят применение в пищевой промышленности для ультрафильтрации жидкостей. Использование сорбента и полых волокон в производстве препаратов крови не известно.

Сравнение сорбционных характеристик анионообменников ДЕАЕ-Сефадекс А-50 и ДЕАЕ-Тойоперл проводилось экспериментальным путем. Результаты, полученные в серии на 5 опытов по взаимодействию исследуемых гелей с криосупернатантом донорской плазмы, представлены в таблице 1.

Как следует из таблицы, оба геля обладают значительным средством к фактору IX (графа 2 и 4), однако ДЕАЕ-Сефадекс А-50 в силу своей высокой емкости по белку (графа 3) сорбирует и балластные по отношению к протромбиновому комплексу белки, что подтверждается значениями удельной специфической активности фактора IХ (графа 5), характеризующими качество получаемого продукта.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о большей специфичности ДЕАЕ-Тойоперл в качестве сорбента фактора IX.

Обнаруженные специфические особенности ДЕАЕ-Тойоперл, заключающиеся в способности избирательно сорбировать на своей поверхности фактор IX неизвестны из литературы и выявлены экспериментально.

Пригодность данного типа геля для технологических целей оценивали по двум параметрам: выход и кратность очистки выделяемого фактора IX. Кратность очистки определяли как отношение удельной специфической активности фактора (ед/мг белка) в элюате к удельной активности исходного криосупернатанта. Данные, полученные в экспериментальных условиях, представлены в табл. 2.

Как следует из таблицы, большая специфичность ДЕАЕ-Тойоперл обеспечивает высокую кратность очистки целевого продукта и позволяет увеличить его выход на этой стадии в 1,5 раза. Выраженная специфичность данного типа геля в сочетании с такими известными из литературы характеристиками, как высокая механическая прочность, устойчивый размер частиц и высокая текучесть, обусловливают его преимущества для использования в технологических целях.

Поиск альтернативного гельфильтрации метода обессоливания белковых растворов, позволяющего избежать значительных механических потерь, осуществляли путем скрининга существующих методов диализа. В результате был избран метод с использованием полых волокон. Конструктивная особенность полых волокон позволяет извлекать конечный раствор практически без механических потерь, что положительно сказывается на величине общего выхода концентрата фактора IX. Кроме того, применение полупроницаемых волокон обеспечивает, помимо удаления избыточного количества солей, концентрирование полученного продукта что влечет за собой снижение объема раствора готового продукта, подлежащего фильтрации и лиофилизации, и приводит к упрощению процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Криосупернатант плазмы размораживали при +4^оС и смешивали с гелем в соотношении 20-30 мл геля на 1 л плазмы при комнатной температуре. Смесь выдерживали 40-60 мин при 25^оС. После отделения геля с сорбированным белком его промывали 2-3-кратным объемом (по отношению к гелю) физиологического раствора (0,15 М NaCl) для удаления неадсорбированных белков. Элюцию протромбинового комплекса осуществляли последовательным увеличением молярности NaCl от 0,8 М до 2,0 М.

Элюат диализовали на полых волокнах против 3-кратного объема 0,15 М раствора NaCl, содержащего 0,03 М цитрата натрия и 0,05 М глицина. Отдиализованный раствор концентрировали в 4-5 раз. Выделенный и сконцентрированный раствор протромбинового комплекса подвергали стерилизующей фильтрации через фильтры 0,22 мк системы Миллипор, разливали в стерильные флаконы по 10-20 мл и подвергали лиофилизации.

Качественные показатели полученного протромбинового комплекса по предлагаемому способу исследовали методом перекрестного иммуноэлектрофореза против антисыворотки к белкам плазмы человека. Полученные иммуноэлектрофореграммы свидетельствуют о значительно более высокой очистке продукта, выделенного по предлагаемому способу. Число пиков преципитатов, соответствующее числу сывороточных белков, содержащихся в исследуемом образце, значительно меньше в случае использования ДЕАЕ-Тойоперл, причем большая их часть присутствует в следовых количествах.

П р и м е р 1. 9,25 л криосупернатанта плазмы смешивали с 14 г сухого ДЕАЕ-Сефадекс и перемешивали в течение 45 мин. Гель промывали 5 раз по 1 л 0,15 М раствором NaCl. Смыв протромбинового комплекса с геля проводили с порциями по 200 мл 7 раз М NaCl с добавлением 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата натрия. Концентрация белка в элюате до концентрирования составила 1,13% специфическая активность 2 ед/мл; после концентрирования 3,3% и 5 ед/мл соответственно. После стерильной фильтрации удельная специфическая активность конечного продукта составила 0,2 ед/мг, выход 24%
П р и м е р 2. 24,7 л криосупернатанта плазмы смешивали с 500 мл ДЕАЕ-Тойоперл и перемешивали в течение 50 мин. Гель, содержащий сорбированный фактор IX, промывали порциями 10 л 0,15 М раствора NaCl. Элюцию протромбинового комплекса осуществляли 3,5 л раствора 2,0 М NaCl, содержащего 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата натрия. Концентрация белка в элюате составила 0,43% а специфическая активность фактора IX-5,5 ед/мл.

После 4-кратного концентрирования элюата на аппарате АР-0,05, включающем полые волокна, и диализа против 5-кратного объема 0,15 М раствора NaCl, содержащего также 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата натрия, выделили концентрат фактора IX с концентрацией белка 1,22% и специфической активностью 10 ед/мл.

После стерильной фильтрации и лиофилизации величина удельной специфической активности конечного продукта составила 1,28 ед/мг, выход 43%
П р и м е р 3. 41 л криосуперантанта плазмы смешивали с 1 л ДЕАЕ-Тойоперл и выдерживали в течение 50 мин. Гель промывали 0,15 М раствором NaCl. Элюцию протромбинового комплекса осуществляли 5 мл 2,0 М раствором NaCl, содержащего 0,015 М глицина и 0,015 М среднего цитрата. Концентрация белка в элюате составила 0,40% а специфическая активность фактора IX 3,3 ед/мл.

После 4-кратного по объему концентрирования элюата и 5-кратого диализа на полых волокнах против 0,15 М раствора NaCl с добавкой 0,015 М глицина и 0,015 среднего цитрата концентрация белка возросла до 1,3% и специфическая активность до 16 ед/мл.

Удельная специфическая активность стерильного и лиофильно высушенного конечного продукта составила 1,23 ед/мг. выход 51%
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать концентрат фактора IX с улучшенным за счет увеличения удельной специфической активности качеством и повысить выход конечного продукта благодаря сочетанию двух операций проведению адсорбции фактора IX на анионообменнике ДЕАЕ-Тойоперл с повышенным, как было установлено, сродством к протромбиновому комплексу и осуществлению диализа и концентрирования на полупроницаемых полых волокнах.

Способ используется в медицине для создания препаратов на основе фракционирования донорской плазмы, в частности для получения концентрата фактора XI свертывания крови. Сущность изобретения: осуществляют сорбцию фактора XI на сорбенте ДЕАЕ-Toyopearl из криосупернатанта донорской плазмы, промывание анионообменника, элюцию фактора IX, диализ и концентрирование целевого продукта на полупроницаемых полых волокнах. Целевой продукт отличается улучшенным качеством, что выражается в более высокой удельной специфической активности (количество единиц активности на мг белка). Предлагаемое изобретение способствует увеличению выхода конечного продукта. 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ФАКТОРА IX системы свертывания крови, включающий сорбцию фактора IX из криосупернатанта донорской плазмы на анионообменнике, промывание анионообменника, элюцию фактора IX, диализ и концентрирование целевого продукта с последующей его стерильной фильтрацией и лиофилизацией, отличающийся тем, что сорбцию проводят на сорбенте ДЕАЕ- Toyopearl, а диализ и концентрирование осуществляют на полупроницаемых полых волокнах.