СПОСОБ ОЧИСТКИ И ХРАНЕНИЯ ФАКТОРА IX, ВОДНЫЙ РАСТВОР ОЧИЩЕННОГО ФАКТОРА IX, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ФАКТОР IX, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/16 

Настоящее изобретение относится к очистке и стабилизации фактора IX, одного из белков, присущих целому каскаду реакций, которые завершают свертывание крови в месте пореза.

Фактор IX является глобулярным белком с молекулярным весом порядка 70000 дальтонов, который у здоровой особи постоянно производится печенью и содержится в крови при нормальной концентрации плазмы порядка 5 мкг/мл.

Гемофилия В (также известная как рождественская болезнь) является очень серьезным заболеванием, приводящим к снижению активности свертывания крови in vivo и in vitro и требует экстенсивного медицинского контроля на протяжении всей жизни пораженного человека. Такие люди показывают нормальные времена свертывания крови только в случае введения им экзогенного фактора IX, полученного из плазмы крови здоровых особей. При отсутствии такого лечения больной может страдать от спонтанных кровоизлияний в суставах, вызывающих сильные боли и изнуряющую неподвижность, кровоизлияний в мышцах, приводящих к накоплению больших объемов крови в тканях, спонтанных кровотечений в горле и шее, которые при отсутствии мгновенного вмешательства могут вызвать удушье, кровотечений в матке и тяжелых кровотечений, при которых необходимо хирургическое вмешательство, а также от небольших случайных ран или выпадения зубов.

Функциональная недостаточность фактора IX может развиваться различными путями. Генный код фактора IX находится в X-хромосоме. Этим объясняется, почему гемофилия B гораздо чаще встречается у особей мужского пола, нежели женского. Известно, что к некоторых пораженных людей есть унаследованная Х-хромосома с полным уничтожением гена фактора IX. Эти тяжело пораженные люди могут даже вырабатывать антитела для терапевтически введенного фактора IX. Известно, что многие больные гемофилией B могут вырабатывать молекулы фактора IX с переменной аминокислотной последовательностью, что приводит к молекулам с частичной активностью свертывания крови или с полным ее отсутствием. Некоторые больные гемофилией B вырабатывают нормальный фактор IX, но в незначительном количестве для эффективного свертывания крови за нормальное время после ранения.

Как уже говорилось выше, активность фактора IX у пациента можно восстановить с помощью инъекции плазмы здорового человека. Однако, для увеличения уровня фактора IX в крови пациента до эффективного уровня необходимо переливание минимум нескольких литров плазмы. В соответствии с этим, успехом в лечении больных гемофилей B может служить обеспечение их инъекциями концентрата плазмы, сильно обогащенного фактором IX. Создание такого концентрата не представляет серьезных трудностей, что должно быть ясно из приведенного ниже описания.

Механизмы, за счет которых циркулирующая кровь в основном предохраняется от свертывания, направленные по существу на свертывание крови в месте ранения, очень сложны и включают использование различных белков, других макромолекул, клеток и клеточных структур. Этот гемостатический механизм использует также различные пути обратной связи или усилия для дальнейшего регулирования свертываемости. За счет большого числа конкретных видов белка, которые создают возможность свертывания, и большого числа других макромолекул в плазме крови, чрезвычайно трудно выделить необходимое количество какого-либо одного компонента, включая фактор IX, в достаточно чистом виде. Кроме того, кровь содержит различные протеазы (ферменты, которые сжигают или повреждают другие белки), которые могут разрушающе действовать на белок, выбранный для выделения, такой как фактор IX, прежде чем он будет выделен из других компонентов крови.

Поскольку способность крови свертываться поддерживается в управляемом балансе, фактор IX и другие компоненты, связанные со свертываемостью, должны оставаться неактивными большинство времени во избежание ненужного свертывания. Но белки должны всегда присутствовать в системе кровообращения и быть готовы к немедленной реакции в случае необходимости.

Поэтому кровь по необходимости содержит очень сложный механизм для предотвращения свертывания, когда оно не требуется, для очистки от ненужного свертывания и для быстрой остановки потерь крови в поврежденном месте. Объяснение этого сложного механизма регулирования дает возможность понять, почему так трудно выделить терапевтический фактор IX, свободный от клинически опасных примесей.

Образование эффективного сгустка включает в себя сложное взаимодействие множества компонентов сосудистой системы, включая кровяные пластинки, коллагены и микрофибриллы, открытые за счет повреждения сосудистого эпителия, фосфолипиды и содержащиеся циркулирующие белки. Белки, которые циркулируют в крови в качестве инертных проферментов и которые включаются в свертывание, обычно называют "факторами свертывания". При активации они работают главным образом как высоко специфические ферменты, совершающие специфические изменения в других проферментах факторов свертывания. Таким образом, по очереди активируется каждый следующий фактор. Некоторые проферменты, такие как фактор XII, могут также активироваться за счет контакта с поврежденной поверхностью или за счет соединения с другими макромолекулами.

Механизм процесса свертывания известен довольно подробно. Активная форма фактора свертывания обозначается индексом "а" и обычно получается из неактивного профермента за счет воздействия другого профермента из протеаз конкретного фактора. В теории, назначение активированных факторов свертывания больным гемофилией влечет за собой опасность образования сгустка во множестве разных мест, кроме места повреждения.

Гемостатический механизм может быть охарактеризован как весьма тонкий баланс между теми материалами и процессами, которые вызывают свертывание, и теми, которые усиливают его. Перепроизводство одного или более веществ, в частности, активированных факторов свертывания, может привести к нежелательному свертыванию. Активированные факторы свертывания могут поэтому быть с опасными примесями в терапевтических препаратах из проферментов свертывания, таких как препараты фактора IX.

Что касается больных гемофилией B, то известные методы лечения включают типичное лечение "концентратом протромбинового комплекса", которые представляет собой экстракт плазмы с повышенной концентрацией фактора IX, но содержащий также еще и значительные количества других белков плазмы, включая факторы II, VII, X, их активные формы и множество других загрязняющих протеаз. Такие препараты могут точно также традиционно быть загрязнены фактором IX.

В литературе есть масса сообщений о неблагоприятных клинических последствиях назначения концентрата протромбинового комплекса (или других концентратах фактора IX), загрязненного фактором IX и/или активными или вырожденными формами других факторов свертывания. Наиболее серьезной опасностью является случайная активация каскада свертывания. Были зарегистрированы даже смертельные исходы.

Решению проблем, связанных с использованием неочищенных концентратов фактора IX, мешал недостаток понимания того, как и почему такие концентрации вызывают нежелательное свертывание. Предполагалось, что концентраты факторы IX способны вызывать свертывание не только из-за присутствия количеств фактора IX, но и потому, что они значительно загрязнены другими факторами свертывания, перегружая кровь большими концентрациями одного и более факторов свертывания или их активированных форм.

На базе электрофореза геля додецилсульфата полиакриламида натрия (SDS-PAGE) было найдено, что приблизительный молекулярный вес фактора IX составляет около 54000. Однако, другие виды пептидов, получаемых в результате расщепляющего белок вырождения фактора IX, имеют похожие молекулярные веса, например, примерно от 40000 до 65000. Пока еще неизвестно, что именно является главной причиной неблагоприятных клинических последствий, которые наблюдались при назначении концентрата протромбинового комплекса или других неочищенных, содержащих фактор IX, концентратов, продукты активации фактора IX или продукты вырождения. Следовательно, разработка терапевтических методов, использующих фактор IX, которые исключали бы опасности, связанные с неочищенными препаратами, представляют большой фармацевтический интерес.

Известны различные методы очистки фактора IX, включающие технологию моноклонального сродства антител для отделения фактора IX от других факторов свертывания. Между тем, важно, что такие способы очистки фактора IX используют любую возможность минимизации образования фактора IX или вырожденных пептидов фактора IX. Поскольку фактор IX (профермент) и активированный фактор IX (IX) сходны по структуре, то довольно трудно разделить две формы факторы IX любым методом очистки. Даже технология моноклонального сродства антител нежелательна для такого разделения, поскольку обе молекулы имеют в основном общие потенциальные детерминанты, а примесь факторы IX (и возможно вырожденных пептидов фактора IX) будет иметь тенденцию переноса в готовый продукт. Считывается, что в настоящее время неизвестны никакие другие антитела с такой же дифференциальной чувствительностью. Настоящее изобретение относится к улучшенным средствам для предотвращения расщепляющих белок преобразований фактора IX в фактор IX_a или в вырожденные пептиды фактора IX во время очистки фактора IX и для ограничения расщепляющего белок воздействия на очищенный фактор IX во время хранения.

Очистка фактора IX требует, чтобы он был выделен из других многочисленных белков плазмы крови и других макромолекул плазмы. Обычно фактор IX получают из свободной от криогенного осаждения плазмы. Эта фракция плазмы получается за счет быстрого замораживания всей плазмы, медленного растапливания и сбора отделенной надосадочной жидкости (См. Pool J.G. и др. Nature, 203, 312, 1964). Множество белков, включающих фактор VIII, выпадают в осадок и без медленного растапливания плазмы и могут отделяться центрифугированием.

В известной практике свободную от криогенного осадка недосадочную плазму, содержащую фактор IX, обычно смешивают с анионообменной смолой или гелем, таким как DEAE-сефадекс, DEAE-целлюлоза или DEAE-сефароза (после очистки в загрузке или колонне), или, в свою очередь, с гелем A1 (OH)₃, что ведет к адсорбции фактора IX наряду с другими факторами свертывания, обладающими сходными связывающими свойствами, а также адсорбции меньших количеств других загрязняющих белков. Начальное фракционирование с частицами анионообменной смолы имеет то преимущество, что определенные факторы свертывания (такие как II, VII, IX и X) селективно адсорбируются этой смолой, благодаря их отрицательно заряженным остаткам гамма-карбоксилутамата. Эти белки называют также "витамин К-зависимыми факторами свертывания", поскольку посттрансляционный процесс, зависящий от кофакторов витамина К, вносят гамма-карбоксильные группы, которые необходимы для правильного связывания факторов свертывания с Ca+², липидными поверхностями и кровяными пластинками.

Обычно, связанный фактор IX промывается, затем извлекается из анионообменной смолы с помощью буферизованного солевого раствора высокой молярности. Так как такой высокомолярный солевой раствор считается осмотически несовместимым с тканями человека, экспериментаторы известного уровня техники неизменно подвергали свои экстракты фактора IX диализу и фильтрации (или ультрафильтрации и диафильтрации), которые давали экстракт фактора IX в концентрированном виде, а высокомолярный солевой раствор заменяли физиологически совместимым низкомолярным солевым раствором.

Элюат обогащенной фактором IX смолы (загрязненный значительным количеством других белков (включая факторы свертывания II, VII и X) известен как концентрат протромбинового комплекса. Фактор II (протромбин) и другие зависящие от витамина K факторы свертывания известны как "протромбиновый комплекс" из-за приведенных выше похожих связующих свойств. Больные гемофилией B обычно лечились именно этими концентратами.

В практике известного уровня вышеупомянутой анионообменной хроматографии могли предшествовать другие операции, а то и вовсе заменять ее. Например, свободная от криогенного осадка плазма, к которой добавлялась соль лимонной кислоты, могла обрабатываться хлоридом бария, вызывающим осаждение цитрата бария, с которым были связаны фактор IX и другие факторы свертывания. Белки могли отделяться от осадка, а затем подвергаться анионообменной хроматографии. См. , например, Miletich, J. P. et al., J.Biol. Chem., 253 (19), 6908-6916, 1978. Фактор IX мог также адсорбироваться гелем Al (OH)₃.

В свою очередь, в процесс может быть добавлен второй этап, связанный с использованием ионообменной смолы. Как описано в патенте США N 4447716 (далее по тексту '416), после анионообменной хроматографии фракция фактора IX подвергается ультрафильтрации и диафильтрации 0,15 М раствором NaCl, буферизуется 20 ММ цитратом, pH6, а затем снова подвергается второй фазе ионообменной хроматографии с использованием сульфированной декстрановой смолы. Факторы IX элютируют из этой второй смолы, когда концентрация соли достигает 0,8 М. Фактор IX, содержащийся в растворе с большой молярностью соли, снова подвергается ультрафильтрации и диафильтрации физиологически приемлемым 0,11 М раствором NaCl, буферизуется 20 мМ цитратом, pHB, и после всего этого хранится в лиофилизированной форме. Этот способ, однако, дает продукт, в котором фактор IX составляет менее 10% содержащегося белка, а остальные свыше 90% состоят из материала, представляющего собой загрязняющие белковые виды. В патенте '416 ничего не говорится о факторе IX_a и нет никакого описания эксперимента, которое помогло бы определить, действительно ли загрязняющие протеазы продолжают создавать фактор IX или вырожденные формы фактора IX, если продукт хранить в другой форме, отличной от лиофилизированной.

С помощью технологии, отражающей раскрытое в патенте '416 приготовление фактора IX Menache, D. et al., Blood 64(6), 1220-1227, 1984, заявляют, что им удалось исключить фактор IX_a и получить удельную активность порядка 5 единиц активности фактора IX на миллиграмм общего белка. Поскольку удельная активность чистого фактора IX составляет около 200 единиц на миллиграмм белка, то конечный продукт можно считать довольно сильно загрязненным другими белками, а из-за возможной активности протеаз, его долговременный нетромбогеничный статус сомнителен.

Michalski et al., Vox Sang, 55, 202-210, 1988, раскрыли методику очистки фактора IX, в которой стандартная анионообменная хроматография известного уровня техники проводилась перед хроматографией на основе смолы, покрытой гепарином, отрицательно заряженным мукополисахаридом. Авторы заявляют, что продукт не содержит фактора IX_a, поскольку проверен нейтрализацией антитромбина III, но содержит всего лишь 5% фактора IX в весовом отношении, остальное составляют белковые загрязнители. Назначать такие грязные препараты клинически нежелательно из-за возможности случайного активирования фактора IX одним из присутствующих загрязняющих белков. Без апробирования такого концентрата на животных моделях, чувствительных к тромбогенным компонентам, как говорится в данной заявке, отсутствие тромбогенной опасности нельзя считать доказанным.

Поскольку плазма крови содержит множество белков, имеющих сходные физические свойства и трудноотделимых от фактора IX, и поскольку большинство методик очистки приводит к значительной протеолитической активации и/или вырождению фактора IX, экспериментаторы попытались разработать новые методики лечения фактором IX, имеющие высокую удельную активность (высокую чистоту) и свободные от других белковых загрязнителей. Большое внимание было уделено клонированию человеческого гена фактора IX с тем, чтобы получать препараты фактора IX, не имеющие других клонирующих факторов и протеаз плазмы крови, стремящихся выродить фактор IX. К сожалению, до настоящего времени не представлялось возможным выделить фактор IX из таких препаратов в достаточно чистом виде. Кроме того, препятствия дублирования генетически построенного продукта, характеризуемые in vivo модификацией трансляции конкретных осадков глутаминовой кислоты для получения критических осадков фактора IX в гамма-карбоксилглутаминовой кислоте, не устранены до сих пор.

Антитела, характерные для отдельных белков, были удобным инструментом в попытках выделения факторов свертывания в чистом виде. Goodall et al., следуя методу Kochlet. G. and Milstein, C (Nature, 256, 495 - 497, 1975), идентифицировали моноклональные антитела фактора IX и использовали их в препаративной иммуноаффинитивной хроматографии с целью получения фактора IX с высокой удельной активностью (Blood, 59 (3), 664 - 670, 1982). Однако эта методика не решила критическую клиническую сложность того, что фактор IX_a существует в натуральной плазме и будет и далее создаваться за счет протеолитической активности во время предварительных этапов протокола (традиционная хроматография, такая как анионный обмен), предшествующих иммуноаффинитивной хроматографии. О тестах на содержание фактора IX или вырожденного фактора IX не сообщается. Методики контроля тромбогеничности перед иммуноаффинитивной хроматографией не предложено, результатов теста на животных моделях, чувствительных к тромбогенным компонентам, не представлено.

Методы, основанные на моноклональном сродстве антител, весьма эффективны при выделении фактора IX из других факторов свертывания и стали для большинства исследователей предпочтительными методами очистки. Однако, на известном уровне техники фактор IX, полученный с помощью иммуноаффинитивной хроматографии, значительно загрязнен совместно выделяемым фактором IX_a и/или клинически неприемлемыми вырожденными формами фактора IX, которые вступают в перекрестные реакции с антителами фактора IX.

В патенте США N 4786726 (далее по тексту '726) раскрыто конкретное моноклонарное антитело, обозначенное условно как антитело "А-7". Разработка заключается в осознании того, что связь этого антитела с фактором IX является Ca+2 - зависимой и может быть предотвращена добавлением этилендиамидтетрауксусной кислоты. Это дает полезный метод контроля элютирования фактора IX из стационарной фазы аффинитивной колонны после промывки для удаления белковых загрязнителей. В итоге фактор IX элютируют из комплексов антител и смолы за счет хелирования кальция. Разработка, однако, не улучшает качества концентрата протромбинового комплекса применительно к иммуноафинитивной колонне и не обеспечивает способа для отделения фактора IX_a от фактора IX. Признание необходимости средств контроля активации фактора IX и его вырождения на ранних стадиях процесса не приводится.

Smith, K. J. и др. Thrombosis Research, 33, 211 - 224, 1984, в публикации, отражающей патент 726, не смогли создать антитело, которое могло бы определять фактор IX, но не фактор IX_a или наоборот. На известном уровне техники такого антитела нет (что по существу обусловлено тем, что его очень трудно выделить), а это усиливает необходимость поиска других этапов и способов, которые смогли бы решить проблему активации фактора IX, но не фактора IX_a, или его вырождений в другие клинически неприемлемые пептиды.

С целью получения наиболее приемлемого клинически фактора IX, свободного от тромбогенных компонентов, необходимо контролировать разложение или активацию фактора IX в течение всего процесса приготовления и, особенно, на его ранних стадиях. Отсутствие решения этой проблемы сильно заметно на известном уровне техники. Например, сообщалось о получении иммуноаффинитивно очищенного продукта фактора IX с загрязнением компонентами меньшего атомного веса (включая IX_a), характерными для разложения фактора IX в исходном материале.

Кроме того, в качестве ссылки на другую систему иммуноаффинитивной очистки Liеbman, H.A. и др. Blood, издание 1, 288a, 1983 (кроме того, см. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 3879-3883, 1985), также отмечают все ту же самую невозможность дифференциации и отделения друг от друга факторов IX и IX_a.

Bessos, H. и др. сообщают о системе иммуноочистки, на которой удалось получить фактор IX с большой удельной активностью, активность которого падала после очистки, когда продукт помещали на хранение в раствор со слабой ионной концентрацией (Thrombosis and Haеmosfasis, 56(1), 86-89, 1986). Этот спад мог быть вызван активностью протеазы.

На известном уровне техники также были предприняты попытки, давшие только частичный успех, предотвратить активацию фактора IX относительно фактора IX_a с помощью ингибиторов конкретной протеазы, большинство которых являются органическими соединениями с высокой, как правило, токсичностью. Эти соединения удобны только для исследований на неживых объектах и весьма нежелательны в качестве реагентов в протоколах для клинических продуктов. Например, в патенте 726 говорится о том, что иммуноаффинитивная хроматография фактора IX должна проходить в присутствии бензамидина. Для получения достаточно чистого и стабильного для создания характерных моноклональных антител фактора IX Гуудалл и др. (Bood 59 (3) 664 - 670, 1982) предлагают добавлять токсичные органические бензамидины и диизопропилфлуорофосфанат в растворы, содержащие фактор IX.

Настоящее изобретение относится к стабилизации фактора IX против активации и вырождения.

В соответствии с настоящим изобретением, в способе очистки и сохранения выделенного из плазмы крови человека фактора IX обеспечено улучшение стабилизации фактора IX в растворе относительно активации фактора IX_a или деградации его в пептиды переменной длины и/или структуры за счет добавления одной или более растворимых органических или неорганических солей в раствор, содержащий фактор IX в концентрации, достаточной для предотвращения или существенного снижения активации или деградации фактора IX, но недостаточной для вызова осаждения, необратимых изменений или денатурации молекулы фактора IX, а также сохранение соли или солей в растворе при указанной концентрации во время хранения или дальнейшей обработки.

Одна особенность настоящего изобретения заключается в защите фактора IX от активации относительно факторов IX_a или деградации в пептиды переменной длины и/или структуры во время многоступенчатой очистки за счет минимизации времени пребывания неочищенного фактора IX в растворах, содержащих недостаточную концентрацию соли. Соответствующий настоящему изобретению улучшенный процесс оказывается особенно удобным для предотвращения каталитического воздействия протеаз на фактор IX. В соответствии с этим, в способе очистки фактора IX в растворе, объединяющем в себе два или большее количество последовательных процесса выделения, обеспечивается улучшение, содержащее добавление во время или после конкретного процесса выделения одной или нескольких органических или неорганических солей в содержащий фактор IX раствор, причем концентрация соли достаточна для предотвращения или существенного снижения каталитического воздействия протеаз на фактор IX, а полная концентрация указанной соли или солей недостаточна, чтобы вызвать осаждение, необратимые изменения или денатурацию молекулы фактора IX, и сохранение частично очищенного белка в контакте с указанным солевым раствором при указанной достаточной концентрации соли в течение периода по меньшей мере до следующего процесса выделения.

Ниже будет подробно описано широкое разнообразие растворимых в воде органических и неорганических солей, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительными солями являются водорастворимые соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, наиболее предпочтительны магний, калий, натрий и хлорид лития или сульфат натрия. Предполагается, что наиболее часто используемая концентрация соли будет находиться в диапазоне от 0,4 до 1,4 М.

Другой особенностью настоящего изобретения является то, что оно включает в себя использование водных растворов частично очищенного фактора IX, имеющих заданную удельную активной, и одной или нескольких водорастворимых органических и неорганических солей с концентрацией, достаточной для предотвращения или существенного снижения каталитического воздействия протеаз на фактор IX, но недостаточной для вызова необходимых изменений конструкции или денатурации молекулы фактора IX, раствор после хранения в течение не менее 12 часов при температуре не выше 4^oC имеет активность фактора IX, составляющую от 80 до 100% заданной активности.

Следующей особенностью настоящего изобретения является создание состава фактора IX, который в терапевтической форме стабилен, так что может храниться в виде водного раствора без ухудшения свойств в течение длительных периодов времени, например в течение по меньшей мере двух недель при комнатной температуре. В соответствии с этим настоящее изобретение включает в себя также в терапевтический состав, состоящий из водного раствора фактора IX, имеющий удельную активность свыше 50 единиц активности фактора IX на миллиграмм белка, причем состав способен храниться в течение периода времени около двух недель при температуре до 15-30^oC, в то время как остаток свободного фактора IX_a вырожденных форм фактора IX и/или активных форм других факторов свертывания в концентрациях, которые будут стремиться вызвать заметное нарушение терапевтического эффекта в организме человека, когда указанный состав назначен в терапевтической дозе.

Следующая особенность настоящего изобретения обеспечивает способ лечения рождественской болезни пациента, состоящий из назначения такому пациенту эффективного количества одного или более терапевтических составов, соответствующих настоящему изобретению.

Важными преимуществами настоящего изобретения являются:
1) улучшение чистоты, безопасности и стабильности терапии фактором IX; 2) внесение гибкости и экономичности в коммерческие графики производства фактора IX. Еще одним преимуществом настоящего изобретения является то, что стабильный, высоко очищенный фактор IX можно производить без использования терапевтически нежелательных, высоко токсичных органических ингибиторов протеаз. Кроме того, природа настоящего изобретения такова, что оно широко применимо во множестве типов процессов, которые уже разработаны для производства препаратов фактора IX, включая препараты низкой, промежуточной и высокой чистоты.

На фиг. 1 показан полиакриламидный густой гель, иллюстрирующий DEAE - концентраты и конечные продукты фактора IX, полученные из них общеизвестным из уровня техники способом и способом согласно настоящему изобретению.

На фиг. 2 показаны результаты вестерн-блоттинга, иллюстрирующие DEAE-концентраты и конечные продукты фактора IX, полученные из них общеизвестным из уровня техники способом и способом, соответствующим настоящему изобретению.

На фиг. 3 показаны результаты вестерн-блоттинга, иллюстрирующие уровни протеолиза фактора IX, при температуре 25^oC в образцах содержащего фактор IX DEAE-концентрата, диализованного с различными молярностями хлорида натрия.

На фиг. 4 показаны результаты вестерн-блоттинга, иллюстрирующие уровни протеолиза фактора IX, при температуре 4^oC в образцах содержащего фактор IX DEAE-концентрата, диализованного с концентрацией 0,5 М различных солей.

Настоящее изобретение основано на признании того фактора, что водорастворимые органические и неорганические соли можно использовать для защиты фактора IX от протеолиза, включая активацию фактора IX_a во время очистки фактора IX.

Производство фактора IX, для терапевтического использования при лечении гемофилии (рождественской болезни) традиционно начинается с подвергаемой заморозке плазмы крови. Эта замороженная плазма затем медленно оттаивается, при этом фактор свертывания VIII и некоторые другие белки могут быть восстановлены в виде криогенного осадка. Фактор IX и другие белки переходят в растворимую недосадочную фазу.

Эта фракция плазмы, содержащая фактор IX, затем обычно подвергается адсорбции на анионообменной смоле. После длительной промывки частиц смолы разбавленным солевым раствором с целью удаления несвязанных или слабо связанных белков для элютирования фактора IX, который скапливается во фракции, известной как "концентрат протромбинового комплекса", обычно используют высокомолярный солевой раствор, поскольку от также содержит значительные количества других факторов свертывания, зависимых от витамина К или относящихся к "протромбиновому комплексу", такие как факторы II, VII, X и их активированные формы.

Обычно, эта обогащенная фактором IX фракция подвергается длительной концентрации с помощью фильтров и диализу, что может занимать до 24 часов, с целью замещения высококонцентрированной солевой среды солевым раствором малой молярности, физиологически совместимым буфером. Ранее, именно эту форму продукта использовали в лечебных целях. Обычно, эта слабосолевая форма концентрата протромбинового комплекса содержит протеазы, которые преждевременно активируют фактор IX клинически опасный фактор IX_a. При таких обстоятельствах фактор IX, кроме того, еще и вырождается в другие белки, которые тоже могут быть клинически опасными. Такой протеолиз фактора IX особенно силен, когда фактор IX длительно хранится в солевых растворах низкой молярности.

После назначения такого типа продукта регистрировались даже смертельные исходы (Ploat, N.M. и др., Annals of Internal Medicine, 81, 766-770, 1974).

В попытке улучшить клинически адекватную чистоту концентрата протромбинового комплекса исследователи изменяли описанный выше базовый процесс, например, за счет добавления различных дополнительных этапов или отдельных операций или за счет подгонки различных методик, чтобы предотвратить протеолиз фактора IX и удалить дополнительные примеси. Последние протоколы, как правило, являются модификацией следующего: 1) криогенное осаждение, 2) анионный обмен с использованием преимущества общей удельной адсорбирующей способности зависимых от витамина К факторов свертывания; и 3) дополнительная процедура выделения фактора IX из других белков протромбинового комплекса.

Примеры процедур такого дополнительного выделения включают в себя использование хроматографии геля агара, с которым были связаны гепариновые группы, катионный обмен на сульфатированном геле декстрана или иммуноаффинитивную хроматографию, в которой стационарная фаза системы выделения (очистки) содержит характерные для фактора IX антитела.

Другая методика включает в себя использование фракционирования сульфата аммония и/или элюирование факторы IX из адсорбционного комплекса, образованного из осажденных солей бария с последующей анионообменной хроматографией. Селективная адсорбция гелем гидроокиси алюминия также применялась. Еще одна другая методика использует дополнительную анионообменную смолу, усиливающую выделение белков протромбинового комплекса, которые не были выделены в предыдущем контакте с различными типами анионообменных смол.

Еще одним подходом может служить использование всей плазмы при свободной от криогенного осадка плазмы непосредственно со смолой, характерной для имминоаффинитивной хроматографии фактора IX, находящейся в ректификационной колонне.

Доступные методы очистки фактора IX, такие как описанные выше, включают в себя способы выделения и манипуляции.

Термин "способ выделения", как он здесь используется, означает этап, который включает в себя выделение фактора IX из его смеси с одним или большим числом других пептидов (белков). Термин "манипуляция", как он здесь используется, означает этап, который не вызывает выделения фактора IX из других пептидов (белков) и проводится до или после процесса выделения. Примерами таких манипуляций могут служить диализ, стерильная фильтрация, тепловая стерилизация неактивных загрязняющих микроорганизмов или вирусных частиц в растворах фактора IX, а также диафильтрация, в ходе которой фактор IX селективно задерживается на селективно проницаемой мембране, в то время как растворитель, в котором он находится во взвешенном состоянии растворен, отфильтровывается и заменяется.

Когда способ выделения или манипуляции известного уровня техники требует применения соли, он традиционно проводится с использованием низкомолярного солевого раствора (обычно 0,15 м) за исключением того, когда природа способа или манипуляции требует его проведения с использованием высокой концентрации соли. В последнем случае принято снижать концентрацию соли сразу после этапа, включающего ее использование, без создания условий для хранения фактора IX в нем. Примерами манипуляции, в которой высокая концентрация соли не предназначается для защиты фактора IX от протеолиза и удаляется сразу же после этапа, включающего ее использование, являются: 1) элюирование фактора IX из хроматографической колонны с помощью высокосолевого буфера с последующим удалением соли такими процедурами, как диализ, или замораживанием и лиофилизацией элюата, удаляя при этом соль с помощью испарения, и 2) нагревание раствора, содержащего фактор IX, для дезактивации микроорганизмов и вирусов. По ходу создания настоящего изобретения было признано, что снижение концентрации органической и неорганической соли в растворе, содержащем фактор IX, во время или после окончания процедуры выделения или манипуляции создает главную возможность для активации фактора IX в фактор IX_a или деградации фактора IX в другие, получаемые из него пептиды.

Считается, что это и есть две основные причины того, что значение протеолиза фактора IX и, как следствие, создание фактора IX_a в слабосолевой среде не было признано на известном уровне техники.

Во-первых, высокомолярные солевые растворы мешают некоторым типам процессов выделения. Например, высокие концентрации солей будут предотвращать связывание фактора IX некоторыми ионообменными смолами или иммуноаффинитивными колоннами и выделения не будет.

Во-вторых, содержащие фактор IX солевые растворы высокой молярности нельзя вводить пациенту, поскольку они осмотически несовместимы с живыми тканями. В результате, известный уровень техники считает "избыток" соли чем-то таким, что должно быть удалено из препарата фактора IX как можно раньше.

Использование солей с относительно высокими концентрациями в соответствии с настоящим изобретением позволяет защитить фактор IX не только во время манипуляции между или после процессов выделения, но и в ходе самих процессов.

В приведенных ниже публикациях раскрыты примеры очистки фактора IX, которые можно изменить в соответствии с настоящим изобретением с целью получения терапевтического материала наивысшей степени очистки, улучшенной безопасности и стабильности. В качестве одного иллюстративного варианта таких изменений в очищенный раствор фактора IX была введена и оставлена в нем растворимая соль (пусть, хлорид кальция) в относительно высокой концентрации, пусть, хотя бы около 0,5 м.

(А) В патенте США N 4447416 раскрыт способ очистки фактора IX, использующий анионообменную смолу в растворе соли низкой молярности с этапами очистки и концентрации за счет фильтрации низкой последующей концентрацией соли. После следующей очистки на катионообменной смоле сульфатированного декстрана раствор диализуется от низкомолекулярного солевого раствора.

(Б) Michalski et al. , Vox. Sang, 55, 202-210, 1988, раскрыли продукт фактора IX, очищенный традиционной ионообменной хроматографией с последующим использованием смолы, связанной с гепарином. Кроме того, включены многочисленные процедуры с низкой концентрацией ионов, такие как элютирование из анионообменной смолы с буфером из NaCl, разбавление перед связыванием с покрытой гепарином смолой и элютирование из нее.

(С) Miletich J. P. и др. Methods of Euthimology, 80, 221 - 228, 1981, описали продукт фактора IX, полученный из последовательных этапов адсорбции цитрата бария, аммоний сульфатного фракционирования, ионообменной и декстран сульфатной хромотографии (с элютированиями из них) с помещением фракций фактора IX промежуточной чистоты на длительные периоды времени в растворы с низкими концентрациями солей. О проверках содержания фактора IX или тромбогеничности не сообщается.

(Д) Bajaj S.P. et al., Preparative Biochemistry, 11(4) 397 - 412, 1981, сообщают о приготовлении фактора IX с помощью способа, содержащего четыре отдельных последовательных процедуры, включающие в себя использование адсорбции и элютирования цитрата бария, фракционирование сульфата аммония, хроматографию DEAE-сефадекса и хроматографию гепарин-арагоза. Фактор IX низкой и промежуточной очистки сохраняется в низкомолярных солевых растворах в течение значительных периодов времени до и после каждой процедуры выделения. Ни о каких энзиматических проверках содержания фактора IX или тромбогеничности не сообщается.

(Е) Патент США N 4786726 раскрывает многоэтапную очистку фактора IX, включающую в себя осаждение соли бария, анионообменную хроматографию, осаждение сульфата аммония и хроматографию сульфата декстрана перед последующей очисткой в иммуноафинитивной колонне. Манипуляции фактором IX производятся в течение нескольких длительных периодов диализа от незащищающих фактор IX низкомолекулярных солевых растворов.

(Г) Goodall, A. H. et al., Blood, 59(3) 664-670, 1982, в способе, представляющем собой иммуноаффинитивные методы, описывают использование моноклональных антител для очистки фактора IX, присутствующего в исходном материала концентрата протромбинового комплекса, концентрат приготавливается стандартными способами без учета защиты фактора IX от активации и деградации на ранних стадиях.

Несмотря на то, что колонны моноклональных антител имеют высокую специфичность для фактора IX и эффективно используются для удаления других загрязняющих факторов свертывания, считается, что на современном уровне нет доступной методики аффиитивной очистки антител, которая позволила бы связать фактор IX и подавить фактор IX_a, или наоборот (Смит К. Дж и др., Thrombosis Research, 33, 211-224, 1984). Таракан Дж. и др., Vox. Sang. 58, 21 - 29, 1990 описывают высокую удельную активность иммуноаффинитивно очищенного продукта фактора IX, который тем не менее загрязнен продуктами вырождения фактора IX, полученными из традиционного исходного материала протромбинового комплекса.

Выделение человеческого фактора свертывания IX из рекомбинантного клона ДНК ранее уже было продемонстрировано в клетках млекопитающих (Энсон Д.С. и др. Nature 315, 683 - 685, 1985, Джеллат С. и др. ЕМВО Journal, 9 (10), 3295 - 3301, 1990). Очистка такого фактора IX обычно включает в себя сбор клеточного экстракта с последующей однократной или многократной очисткой по указанным выше методикам выделения. Защита такого фактора IX во время очистки от эндогенных клеточных протеаз может быть закончена доведением до максимума количества времени, в течение которого содержащие фактор IX фракции находятся в контакте с относительно высокими концентрациями одной или более органических и неорганических солей в соответствии с настоящим изобретением.

Должно быть понятно, что конкретный процесс выделения или манипуляции, используемый в очистке фактора IX, может быть испорчен использованием сравнительно большой концентрации соли, как уже говорилось выше. Если это так, то следует, безусловно, избегать использования сравнительно большой концентрации соли в данном конкретном процессе выделения или манипуляции, понимая, что такая высокая концентрация соли может эффективно использоваться для другой очистки или сопутствующих ей этапах, воздействие на которые не является разрушающим, а также при хранении частично очищенного раствора фактора IX. Таким образом, одна из особенностей настоящего изобретения может быть описана, как признание того факта, что вызываемое протеазой повреждение фактора IX, которое может произойти в растворах, содержащих низкие концентрации солей, может быть существенно снижено за счет переконструирования процедуры очистки с целью доведения до максимума количества времени, в течение которого неочищенный и промежуточно очищенный фактор IX сохраняется в сравнительно высоко концентрированной среде, использующей одну или более растворимых солей, соответствующих настоящему изобретению.

В практическом применении настоящего изобретения может использоваться широкое разнообразие солей различных типов. Один возможный механизм воздействия состоит в том, что эффективные соли воздействуют за счет изменения энергетики и каталитики соответствующих протеаз. Эффективная соль может воздействовать за счет дестабилизации протеаз, за счет стабилизации структуры фактора IX, за счет возвратного изменения структуры фактора IX, так что она не придает ни одной конкретной протеазе тех структурных свойств, которые нормально подавлены, за счет увеличения энергии активации, необходимой для размещения и/или расщепления фактора IX в активном месте протеазы, или за счет любой комбинации перечисленных причин. Поскольку специфическая природа всей плазмы крови или других протеаз, которые могут расщеплять фактор IX, неизвестна, то трудно определить конкретные механизмы, по которым действует каждый из полезных ингибиторов протеолиза. Постулируется, что молекула фактора IX хорошо устойчива к значительным необратимым изменениям ее структуры третьего порядка, вызываемым растворимыми неорганическими и органическими солями.

Замечено, что существует множество других причин денатурирования белков (с результирующей потерей каталитической активности и/или разрушением трехмерной структуры) во время процедур выделения или манипуляции, а также во время хранения в растворе. Примерами процессов, способных денатурировать, разрушать или как-то по другому необратимо воздействовать на белки в растворе, могут служить гидродинамическое фрагментирование, связи с поверхностью сосуда, такой как стеклянные стенки, вспенивание раствора и окисление остатков цистеина атмосферным кислородом. Соляные растворы, применимые в практике настоящего изобретения, могут быть эффективны также и в исключении этих других возможных причин вырождения фактора IX.

В практике настоящего изобретения может быть использована любая водорастворимая неорганическая и любая водорастворимая органическая соль, которая способна снижать вызванное протеазой расщепление фактора свертывания IX при концентрации соли, которая не изменяет необратимо структуру фактора IX или вызывает осаждение фактора IX. Соли содержат положительно заряженную катионную компоненту и отрицательно заряженную анионную компоненту, которые в водной среде диссоциируют на ионы. Термин "органическая соль" относится к соли, в которой либо катионная, либо анионная компонента является углерод-содержащим веществом.

Примерами водорастворимых неорганических и органических солей для использования в качестве ингибиторов протеаз, которые активируют или вырождают фактор IX, могут служить: галиды аммония, щелочных металлов или щелочноземельных металлов, тиосульфаты аммония, щелочных металлов или щелочноземельных металлов; фосфаты или сульфаты аммония или щелочных металлов; сульфат или фосфат магния; ацетаты щелочноземельных или щелочных металлов, галиды акрила аммония, включая четвертичные галиды аммония, и хлориды имидазола, лизина и тригидрооксиаминометилметан ("Tris").

Предпочтительными солями в практике настоящего изобретения являются хлорид натрия; тиосульфаты натрия или калия; хлориды магния, калия и лития; и сульфат натрия, причем наиболее предпочтительны хлорид натрия и сульфат натрия.

Эффективные концентрации солей для использования в практике настоящего изобретения могут широко изменяться в зависимости от конкретной используемой соли. Нижний предел концентрации определяется тем, сколько соли необходимо для подавления вырождения и активация фактора IX. Верхний предел определяется тем количеством, которое может вредно влиять на фактор IX, и/или тем, при котором относительные выгоды не реализуются из-за увеличения количества соли. Как только будет понят изложенный принцип защиты молекулы фактора IX от вырождения или протеолиза, так сразу же будет легко определить оптимальные концентрации соли с помощью описанных здесь инкубационных экспериментов.

Следует также понимать, что существуют факторы, которые снижают диапазон концентраций, в котором эффективна данная конкретная соль. Такие факторы включают в себя время или температуру, при которых желательны защитные эффекты, концентрацию макромолекул, включая протеазы, присутствующих в образце, и природу процессов выделения или манипуляции и/или условия хранения, при которых требуется защита. Эти факторы, связанные с присущей каждой конкретной соли способностью изменять энергетику и протеолиз, должны приниматься во внимание при выборе эффективных концентраций.

Считается, что для большинства применений, в зависимости от конкретной используемой соли, удовлетворительной концентрацией соли будет от 0,4 до 1,4 М.

Следует понимать, что можно использовать и более высокую концентрацию соли. Такие соли, как, например, хлорид магния, калия или лития и сульфат натрия эффективны в нижнем конце этого диапазона. Эти соли особенно полезны, поскольку эффект защиты фактора IX можно реализовать при концентрациях соли, которые гораздо меньше способны нарушать процедуры выделения, такие как процедуры, включающие в себя загрузку или включение фактора IX в эффинитивную колонку или ионообменную смолу. Поэтому, фактор IX может защищаться постоянно в ходе всей многоэтапной процедуры очистки. Есть и другие соли, которые нужно использовать в верхнем конце этого диапазона, например, с концентрацией, по крайней мере равной 0,7 М. Диапазон предпочтительных количеств для указанных предпочтительных и наиболее предпочтительных солей составляет примерно от 0,35 до 3 М, в зависимости от конкретной используемой соли.

Что касается относительной эффективности различных типов солей, то в одной серии тестов 1 М концентрации органических солей, таких как гидрохлориды тригидроксиаминометилметана, лизим и имидазол, и ацетат натрия оказались способны создавать меньший эффект стабилизации фактора IX, чем NaCl с концентрацией 1М.

Важной особенностью настоящего изобретения является то, что высокосолесодержащие фракции фактора IX промежуточной чистоты, которые были частично очищены ионообменной хроматографией или другим процессом выделения, но еще не подвергавшиеся иммуноэффективной хроматографии и другим процессам выделения, могли эффективно храниться в течение длительных периодов времени, например, порядка 12 часов при 4^oC или порядка трех месяцев в замороженном виде. При таком хранении вырождение или активация фактора IX замедлялась за счет использования с фактором IX относительно высококонцентрированных солей, как уже говорилось выше. Это является клинически важной альтернативой хранению таких фракций в присутствии токсичных ингибиторов органических протеаз, которые с трудом удаляются из конечного продукта.

Есть множество текущих преимуществ, связанных с возможностью хранения фракции промежуточной частоты фактора IX во время его очистки.

Даже продукты фактора IX самой высокой чистоты могут содержать следы множества протеаз, которые будут случайно вырождать или активировать фактор IX, особенно если продукт, даже при низкой температуре, подвергнут длительному хранению в жидком виде. В соответствии с настоящим изобретением и в качестве альтернативы лиофилизации или замораживанию соли можно добавлять в продукты очищенного фактора IX, чтобы сделать возможным длительное хранение в жидком виде. В целях создания из композиции фактора IX терапевтической формы концентрация соли в ней должна быть снижена до клинически приемлемого уровня, например до 0,15 М и ниже. Это можно получить с помощью таких процедур, как диализ или диафильтрация, перед распределением продукта по больницам или пациентам.

Ожидается, что очищенная терапевтическая форма фактора IX, соответствующая настоящему изобретению, не будет вызывать нежелательные клинические последствия (такие как инфаркт миокарда, тромбофлебит и распространяющееся межсосудистое свертывание крови), которые могут возникать в результате назначения доступных в настоящее время продуктов фактора IX. В следующем ниже разделе в качестве примеров приведены данные, подтверждающие безопасность фактора IX, приготовленного в соответствии с настоящим изобретением.

Ниже приведено описание предпочтительной полной очистки фактора IX, предназначенного для практического использования настоящего изобретения.

Предпочтительная очистка последовательно включает в себя: криогенное осаждение плазмы крови для удаления таких белков, как фактор VIII; анионообменную хромотографию, использующую удельную адсорбирующую способность зависимых от витамина K факторов свертывания; иммуноаффинитивную хромотографию с использованием моноклональных антител. Указанный процесс выделения подтверждает большую специфичность фактора IX по сравнению с другими белковыми соединениями.

Предпочтительная для очистки фактора IX аминообменная смола представляет собой высокогидрофильный состоящий из гранул гель поперечно связанного эпихлорогидрином декстрана, к которому присоединены обменные группы диэтиламиноэтилового эфира (DEAE), такие как DEAE сефадекс А-50, поставляемый фирмой "Фармация", г. Упсала, Швеция. Во время равновесного процесса адсорбции сефадекса сохраняется температура ниже 15^oC, предпочтительно ниже 4^oC. Несмотря на то, что фактор IX связывается с DEAE-сефадексом А-50 быстрее и полнее при температуре 20^oC, чем при 4^oC, рекомендуется, чтобы температура была насколько возможно ниже, чтобы снизить до минимума активность воздействия протеаз на фактор IX. Поэтому предпочтительна адсорбция фактора IX при 4^oC. Фактор IX_а как примесь конечного продукта, также сведен до минимума сохранением фракций фактора IX (до того времени, пока они не будут отделены от остальных загрязняющих протеаз в колонне моноклональных антител) в среде с низкой температурой (такой как 4^oC и ниже) в относительно высокомолярных солевых растворах, соответствующих настоящему изобретению.

В соответствии с предпочтительным практическим применением настоящего изобретения протеолиз фактора IX поддерживается в элюатах анионообменной хроматографии за счет сохранения белка в присутствии одной или более подходящей органической или неорганической соли со сравнительно высокой молярностью непосредственно до начала дальнейшего процесса выделения фактора IX из его обогащенных фракций с помощью иммуноаффинитивной хроматографии с использованием моноклональных антител, которые применяются для выделения фактора IX из остальных факторов свертывания и других белков.

Для оценки чистоты композиций фактора IX, которые могут быть получены в соответствии с настоящим изобретением, необходимо определить два параметра, концентрацию белка и удельную активность.

Измерения, определяющие концентрацию белка в образцах фактора IX, могут сильно изменяться в зависимости от точности используемого способа. В практике настоящего изобретения концентрация белка в образцах фактора IX определяется при 280 мм на основании коэффициента экстинкции для раствора 10 мг/мл чистого фактора IX с активностью 13,7 единиц на пути в один сантиметр. Корректировка на рассеяние Релея проводится по методу, который предложил Bloom. J.W. и др., Biochemistry, 18, 4419-4425, 1979. См. также Shapiro, C. C. и др., Thromb. Dial. Haemorr. 16, 469, 1966.

Сообщалось о многих способах испытаний для оценки удельной активности (единиц активности фактора IX на мг белка) композиций фактора IX. В таких способах анализа часто не удается делать корректировку на загрязнение образца фактора IX фактором IX_a. В результате, трудно оценить чистоту и безопасность препаратов фактора IX, изготовленных различными способами и/или испытанных по различным методикам.

Некоторые недавно проведенные испытания включают две стадии контроля свертываемости (Leibman. H.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3879-3883, 1985), другие основаны на одной стадии контроля времени активированного частичного тромбопластина ("APTT") Smith, K.J. и др. Blood, 72, 1269 - 1277, 1986), есть испытания, представляющие собой модификации теста APTT (Jenuy, p. и др. Preparatiol Biochemistry, 16, 227-245, 1986). Испытания, основанные на антигенной силе фактора IX, также предлагались в качестве меры чистоты (Smith, K.J. и др. Blood, 72, 1269 - 1277, 1988).

В испытаниях, проведенных в известном уровне техники, многие исследователи также использовали в качестве стандарта образцы фактора IX, полученные из плазмы крови человека, которой приписывалась предполагаемая сила 1,0 единиц/мл. Однако, следует подчеркнуть, что нормальная плазма крови человека часто содержит фактор IX с концентрацией, значительно превышающей 1,0 единиц-мл. На сегодняшний день, можно также сослаться на международный стандарт фактора IX, WHO#1, изданный Мировой организацией здравоохранения.

В литературе приводятся величины удельной активности очищенного фактора IX в диапазоне от 130 до 220 единиц/мг. Различия в способах определения содержания белка, методах испытаний и стандартах калибровки подтверждают это. Сравните данные следующих источников: Smith, K.J. и др., Blood, 72, 1269 - 1277, 1988, (134-158 единиц/мг); Bajaj, S.P. и др., Preparative Biochemistry, 11(4), 397-412, 1981 (180-220 единиц/мг); Osterud, B и др., J. Biol. Chem., 253 (17), 5946 - 5951, 1978, (206 единиц/мг) Jenny. R. et. al., Preparative Biochemistry, 16, 227 - 245, 1986 (132 единицы/мг).

Сравнивать результаты различных лабораторных групп, использующих различные способы испытаний фактора IX_a, тоже очень трудно. Это особенно важно, поскольку фактор IX и фактор IX_a могут каждый влиять на исследования, направленные на измерение другого из них. Дополнительным вкладом, связанным с созданием настоящего изобретения, является проведение высокочувствительных испытаний фактора IX_a на основе теста частичного тромбопластина ("PТT"). На это испытание не влияет присутствие фактора IX и, как показано в следующем разделе, подтверждает применение способа, стабилизации фактора IX, соответствующего настоящему изобретению.

Терапевтические композиции, содержащие фактор IX, полезные для лечения рождественской болезни, не должны состоять из фактора IX с абсолютным лимитом удельной активности, поскольку остающиеся белковые примеси не способны вызвать заметного нарушения клинического эффекта в человеке, когда такие композиции назначены в других терапевтических дозах. Как показано в следующем разделе, процедура очистки примера 1 может использоваться для производства фактора IX для терапевтического применения с удельной активностью, равной по меньшей мере 194 единицам на мг белка при уровне загрязнения фактором IX_a менее 0,02% (в весомом отношении). Композиции фактора IX, пригодные для введения пациенту, могут быть приготовлены, например, восстановлением с фармакологически приемлемым разбавителем лиофелизованного образца, содержащего очищенный фактор IX и стабилизирующие соли.

Среди способов, которые можно использовать для демонстрации чистоты результирующего фактора IX, минимального содержания фактора IX_a - и деградации белков фактора IX в соответствующих настоящему изобретению терапевтических композициях, содержатся: электрофорез геля додекилсульфат полиакриамида натрия (SDS-PAGE), вестерн-блоттинг разложенных электрофорезом образов, содержащих фактор IX, и прямые ферментативные анализы на содержание фактора IX и фактора IX_a.

В практике настоящего изобретения и в связи с трудностями коррелирования тромбогенных событий в живых и неживых объектах, потенциальная тромбогеничность очищенных препаратов фактора IX оценивается с помощью: 1) проводимого на кроликах статистического анализа Бесслера: 2) SDS-PAGE и вестерн блоттинга для определения количества белков с приблизительным молекулярным весом 54 килодальтона; 3) новой измененной формы АРТТ - анализа для определения уровня содержания фактора IX_a и других белков, вызывающих IX_a - подобную активность. Считается, что наилучший из доступных в настоящее время показателей безопасности препаратов фактора IX обеспечивается, когда образец имеет низкую характеристику проводимого на кроликах статистического анализа, то есть содержит (по SDS-PAGE) менее 10% материала с молекулярным весом 54 килодальтона, и обладает низким содержанием фактора IX_a, измеряемым с помощью измененного теста АРТТ (см. ниже пример 3).

Примеры
Представленные примеры иллюстрируют практическое применения настоящего изобретения.

Пример 1. Очистка фактора IX
Данный пример показывает очистку препаративных количеств терапевтически применимого фактора IX из плазмы крови с использованием высоких концентрацией хлорида натрия на конкретных этапах с целью предотвращения протеолитического повреждения фактора IX.

Производимое в коммерческих целях количество замороженной плазмы медленно размораживают при 0^oC с созданием надосадочной фракции и осажденных фракций (см. Pool, J. G. др. Nature, 203, 312, 1964). Надосадочная фракция плазмы, которая осталась после криогенного осаждения, содержит фактор IX и множество исходных концентраций факторов II, VII, X. К надосадочной фракции плазмы при температуре 4^oC были добавлены анионообменные гранулы DEAE-сефадекса А-50 (порядка 1,5 г/л надосадочной фракции). Полученная суспензия тщательно перемешивалась в течение одного часа на холоде, чтобы фактор IX связался с гранулами смолы. Порядка 96% фактора IX по весу, первоначально содержавшегося в плазме, было связано гранулами смолы. Кроме того, также были связаны и другие белки протромбинового комплекса. Гранулы смолы с удерживаемым ими белком были собраны с помощью фильтрования, промыты в объеме промывающего буфера, предварительно охлажденного примерно до 4^oC, который был по меньшей мере равен объему свободой от криогенного осадка надосадочной фракции. Промывочный буфер состоял из раствора 0,2 М NaCl, 0,01 M Na₃ цитрата с pH 7,0 и 0,04 единицы/мл гепарина натрия. Ионная сила промывающего буфера была слишком мала, чтобы вызвать значительную диссоциацию фактора IX из гранул сефадекса. Элютирующий буфер (водный раствор 2М NaCl с 10 мМ цитрата натрия, pH 7,0 охлажденный до 4^oC) был добавлен и тщательно перемешан с гранулами смолы в течение 30 минут. Полученный элюат был собран и оставлен для дальнейшей обработки. Элютирование гранул смолы можно повторить, а элюаты слить вместе. Температурный контроль позволял поддерживать температуру от 2 до 8^oC для каждого из этапов свызывания DEAE-сефадексом и процедуры элютирования.

Элютирование обогащенной фактором IX фракции (протромбинового комплекса) из смолы DEAE-сефадекс раствором 2М NaCl, буферизованным 10 мМ цитратом натрия, приводит к получению объединенной фракции элюата, конечная молярность NaCl в которой составляет около 1,0 М (из-за слабой ионной силы пустого объема раствора).

Очищенный и стерильно профильтрованный объединенный элюат ("стабильная, обогащенная фактором IX фракция") хранился замороженным при температуре - 40^oC и ниже до следующей обработки. Хранение в замороженном состоянии при -40^oC и ниже в течение не более 4 недель не повлияло на пригодность образцов, содержащих фактор IX. В качестве результата стабилизирующего действия солей, используемых в практическом применении настоящего изобретения, хранение в течение комерчески используемых периодов времени приводит к промежуточной чистоте препаратов фактора IX, обеспечивающей менее 10% возможных потерь, и совсем небольшой активации или деградации, а то и к полному их отсутствию. Но этого бы не было, если бы хранение не проводилось в буфере, содержащем низкомолярную соль, такую как 0,15 М NaCl далже и при -40^oC.

В другом случае, стабильная фракция, обогащенная фактором IX, хранилась при температуре 4^oC вплоть до 12 часов до следующей обработки. Это проводилось для сравнения со способами известного уровня техники, в которых считается, что элюат должен быть как можно лучше диализован или диафильтрован от буфера с низкой концентрацией соли перед следующей очисткой или клиническим применением.

Непосредственно перед подачей "стабильной, обогащенной фактором IX фракции" в аффинитивную колонну с моноклональным антителом она разбавляется водой в отношении 1:1, что снижает концентрацию хлорида натрия препарата до 0,5 М. Раствор протромбинового комплекса, содержащий фактор IX, загружается в колонну с моноклональным антителом, длительно промывается и элюируется 3 М тиоцианатом натрия. Тестирование элюата на содержание вырожденного фактора IX или фактора IX_a показывает их присутствие лишь в очень малых количествах, позволяющее закончить фракционирование.

Получение и применение моноклональных антител для иммуноаффинитивной хроматографии стабильной, обогащенной фактором IX, фракции происходит с помощью хорошо известных процедур. Очистка фактора IX, достаточная для приготовления моноклональных антител, проводилась по методу, который предложили Osterud, B. , et al., J. Biol. Chem, 253 (17), 5946-5951, 1978. Селезенки мышей, заранее инъектированные высокоочищенным фактором IX, удалялись, а их клетки синтезировались в соответствии со стандартной процедурой (Браун Дж. П. и др. , журнал биологической химии, 225, 4980-4983, 1980). Подробности приготовления и работы с иммуносорбентной системой изложены в описании изобретения к патенту "Иммуносорбент и способ восстановления из него зависимых от витамина K белков". Европейское патентное ведомство, заявка N 84-301162, 8, опубликованная 12 сентября 1984 г., исходящий номер 0118256.

Фактор IX был элютирован из колонны моноклонального антитела в раствор 3 М тиосульфата натрия, 50 мМ Tris HCl, 10 мМ EDTA, pH 8,0, а затем диофильтрован из 50 мМ NaCl 5 мМ гистидина, pH 7,0. Раствор диафильтрованного фактора IX затем был подвергнут ультрафильтрации через мембрану УМ 100, изготовленную компанией "Амикон ко Денверз", Миннесота, США, обладающей отсечкой молекулярного веса глобулярных белков порядка 100 килодальтонов, позволяя тем самым фактору IX проходить через себя с отделением вирусных частиц. Фильтрат, содержащий фактор IX, собирался и отфильтровывался на мембране, подходящей для отделения глобулярных белков с молекулярным весом свыше 10 килодальтонов. Затем очищенный раствор фактора IX замораживался и хранился при температуре -70^oC до конечной обработки, что соответствует графику коммерческого производства. Очищенный раствор фактора IX подвергался, наконец, хроматографии на гранулированном геле агара, содержащем положительно заряженные аминогексильные группы (АН сефароза 4В, фиры "Фармация" г. Упсала, Швеция). Хроматография геля агара не приводит к дальнейшему улучшению чистоты фактора IX относительно других факторов свертывания, но служит концентрации фактора IX и удалению остаточных уровней антитела фактора IX, которые могли остаться после колонны моноклонального антитела. Можно использовать и другие коммерчески доступные гели.

После связывания фактора IX гранулами геля агара гель промывался раствором 0,15 М NaCl, 10 мМ гистидин • HCl, 5 мМ лизин • HCl, pH 7,0. Фактор IX элютировался из геля раствором 0,05 М CaCl₂, 0,15 М NaCl, 10 мМ гистидин • HCl, pH 7,0. Элюат затем диафильтровался из раствора 66 мМ NaCl, 10 мМ гистидин • HCl, 3% (веса к объему) маннитол. pH 7,0 осветлялся, стерильно фильтровался и хранился при температуре -40^oC и ниже. В качестве альтернативы, отфильтрованный раствор можно высушивать замораживанием. Результирующим материалом являлся соответствующий настоящему изобретению "улучшенный конечный продукт фактора IX" со средней удельной активностью порядка 180-200 единиц активности на миллиграмм белка.

Пример 2
Сравнение с продуктами известного уровня техники
Как известно, концентрат протромбинового комплекса в растворе NaCl с концентрацией порядка 1M-2M требует более длительных манипуляций, таких как диализ, занимающий порядка 24 часов, чтобы снизить концентрацию соли в изоляторе, содержащем фактор IX, до физиологически приемлемого диапазона порядка 1,5 М) для клинического применения или перед дальнейшей очисткой в условиях малой ионной силы раствора.

Было проведено сравнение очищенного, отфильтрованного концентрата протромбинового комплекса, находящегося в растворе NaCl 0,1 М, содержащем также цитрат натрия 10 мМ, pH 7,0 (стабильной, обогащенной фактором IX фракции примера 1), с известным элюатом амионообменной хроматографии DEAE-сефадекса (концентратом протромбинового комплекса), который в соответствии со стандартной практикой был подвергнут диализу или диафильтрации для снижения концентрации соли до физиологически приемлемого уровня. Оба типа фракций элюата были затем подвергнуты дальнейшей очистке с помощью моноклональных антител, как описано выше для получения "улучшенного конечного продукта, обогащенного фактором IX" и типичного продукта известного уровня техники.

Результаты чистоты, полученной для конечного продукта фактора IX примера 1 и конечного продукта известного уровня техники, приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, отдельные пробы "улучшенного конечного продукта фактора IX", полученные из "стабильной фракции, обогащенной фактором IX", показавшие гораздо меньше загрязнения фактором IX_a, чем конечный продукт, полученный из аминообменного элюата, полученного из DEAE-сефадекса, отражающий известный уровень техники, были подвергнуты диафильтрации в изотоничном буферном растворе в течение 3 - 4 часов и последующему хранению, в замороженном виде до обработки в иммуноаффинитивной колонне. Анализ на содержание фактора IX проводился методом "APTT" Smith. K.J. и др. Blood, 72, 1269 - 1277, 1988). Анализ на содержание фактора IX_а проводился частичным местом тромбопластина, "PTT" (Varadi, K., et al., Thromb Haemos. 35, 576 - 585, 1976), измененному как в протоколе примера 3. Пониженное загрязнение фактором IX_a улучшенного продукта было также подтверждено большими временами свертывания (в секундах) фактора IX_a, как показано в таблице 1.

Элюаты анионообменной хроматографии и полученные из них конечные продукты при анализе с помощью электрофореза геля додекилсульфата полиакриламида (SDS-PAGE) в соответствии с процедурой, которую предложили Weber K. и др. , журнал биологической химии, 244, 4406 - 4412, 1969, или процедурой с изменениями, которые внес Laemi, U.K., Nature 227 680-685, 1970, использующей градиент акриламидной концентрации от 4 до 12%, показали (см. фиг. 1), что элюат анионообменной хроматографии известного уровня техники (протромбиновый комплекс) и результирующий конечный продукт сильно загрязнены полосой с молекулярным весом порядка 54000, присущей фактору IX_a (и некоторым белкам вырождения фактора IX), хотя это загрязнение не столь заметно в пробирках геля, соответствующих стабильной, обогащенной фактором IX фракции настоящего изобретения, и в полученном из нее конечном продукте. В пробирку густого геля (рис. 1) загружено примерно по 14 мг белка в случае DEAE-концентратов, из которых получают примерно по 9 мг готового продукта. Дорожка 1 показывает на рисунке соответствующие отметки молекулярного веса. Пробирки 2,4 и 6 показывают отдельные пробы стабильной, обогащенной фактором IX фракции, полученной хроматографией DEAE-сефадекса в соответствии с процедурой примера 1. Пробирки 3,5 и 7 содержат образцы соответствующих, полученных из них, конечных продуктов. Пробирка 8 содержит образец DEAE-концентрата, приготовленного с помощью известной неоптимизированной процедуры, в которой не используются высокие концентрации соли для защиты фактора IX. Пробирки 9 и 10 представляют дублирующие образцы конечного продукта.

Загрязнение фактором IX_a конечного продукта фактора IX и элюата, анионообменные хроматографии (оба получены как в соответствии с улучшенным процессом, так и в соответствии с известным уровнем техники) сравнивались также с помощью высоко чувствительного вестерн-блоттинга. Фактор IX_a определялся по перекрестной реактивности антитела антифактора IX. В этой процедуре испытываемые образцы подвергались электрофорезу в геле с акриламидным градиентом от 4 до 12%, в присутствии детергента додецилсульфата натрия. Затем белки гибридизировались и иммобилизировались на листе нитроцеллюлозы. Картина проявлялась с помощью применения кроличьей антисыворотки к человеческому фактору IX и хрен- пероксидазного конъюгата козлиного противокроличьего IgG. Цвет был окончательно доведен с помощью 4-хлоро-1-наптола и перекиси водорода (См. Pasternak et al., Nature, 322, 740, 1986). На фиг. 2 показано, что новые процессы приводят к получению конечного продукта, имеющего лишь следы фактора IX_a, даже если гели перегружены, по сравнению с характерным результатом известного уровня техники. Пробирки с гелем фиг. 2 в точности соответствуют пробиркам фиг. 1 и представляют вестерн-блоттинг дубликата SDS-PAGE геля, показанного на фиг. 1. Пробирки с гелем были загружены примерно до 14 мг образца, содержащего DEAE-концентраты, а пробирки с конечными продуктами - до 0,07 мкг.

Пример 3. Улучшенный анализ содержания фактора IX_a в препаратах фактора IX
В процессе работы над настоящим изобретением был проведен и стандартизирован улучшенный анализ свертываемости фактора IX_a, белков, полученных из вырожденного фактора IX с молекулярным весом 54 килодальтона, или белков с IX_a - подобной активностью с целью создания методики очистки крови по улучшенному аналитическому способу. Принцип нового анализа свертываемости, обладающий высокой чувствительностью, основан на частичном тесте тромбопластика ("PTT") и показывает нехватку активности фактора IX_a в факторе IX, очищенном в соответствии с настоящим изобретением. Анализ полезен для предсказания тромбогенности препаратов фактора IX in vivo, особенно, если используется совместно с анализами in vivo объектор примера 7.

Сила фактора IX_a или белков, обладающих IX_a - подобной активностью, рассчитывается непосредственно по времени свертывания одноэтапного анализа. Использованный в анализе фосфолипидный реагент был получен из коровьего мозга и применялся без активатора. Его название тромбофакс, а изготавливает его фирма "Ортодиагностик система", Raritan, Нью-Йорк, США. Типичная PTT - процедура была изменена добавкой BASO₄ адсорбированного коровьей плазмой, к человеческой плазме с нехваткой фактора IX согласно протоколу анализа, за счет чего увеличивалось содержание нестабильных факторов V и VIII.

Этот способ использовался для измерения содержания активированного фактора IX_a в конечных продуктах фактора IX, а также для текущего контроля образцов по ходу процесса. Результаты спайк-теста образцов фактора IX показали хорошую линейность и воспроизводимость анализа содержания фактора IX_a в диапазоне от 0,0005 единиц/мл до 0,05 единиц/мл. Поэтому можно измерять даже очень малые количества фактора IX_a в факторе IX.

Влияние очищенного фактора IX на анализ содержания фактора IX_a было также исследовано с помощью сравнения фактора IX_a, на который воздействовало разбавление фактора IX, и фактора IX, на который воздействовало разбавление фактора IX_a. Фактор IX не мешает анализу фактора IX_a. Анализ вполне пригоден для текущего контроля других процедур приготовления фактора IX. В соответствии с этой процедурой были рассчитаны данные концентрации фактора IX_a, приведенные в таблице 1.

В конечном продукте фактора IX, очищенном моноклональным антителом и полученном в соответствии с настоящим изобретением, удалось найти лишь только очень низкие уровни содержания фактора IX_a. Примеры 4 - 8 также показывают чистоту и стабильность фактора IХ, которую можно достичь с помощью различных типов солевой среды, соответствующей настоящему изобретению.

Пример 4. Стабилизация фактора IX в различных концентрациях NaCl
Данный пример показывает влияние различных концентраций хлорида натрия на стабильность фактора IX в препаратах промежуточной чистоты (фракция элюата DEAE-сефадекса) чрез 5 дней хранения при температуре 4^oC.

Протромбиновый комплекс (содержащий фактор IX, значительные количества факторов II, VII, X и различные другие загрязняющие белки) элюируются из смолы DEAE-сефадекс с помощью 2М NaCl в соответствии с процедурой примера 1. Первый и второй элюат собираются вместе и хранятся при 4^oC. Элютированные фракции дают различные конечные молярности NaCl (0,96-1,4 М), поскольку буфер, присутствующий в пустом объеме смолы, должен быть замещен.

Образцами элюатов, полученных для данного примера, являются:
(A) элюат из первой колонны (0,956 м NaCl),
(B) образец материала (A), разбавленной до 0,524 м NaCl,
(C) образец материала (A), подвергнутый ультрафильтрации и диафильтрации согласно типичному процессу известного уровня техники, снижающему концентрацию NaCl до 0,056 М,
(D) часть образца (C), взятая после окончания процесса фильтрования и разбавления до 0,481 М NaCl для анализа через 5 дней,
(E) элюат из второй колонны (1,4 М NaCl),
(F) образец материала (E), разбавленный до 0,532 м NaCl.

После приготовления эти образцы хранились при 4^oC и исследовались сразу, через день, через два и через пять дней на фактор IX и на фактор IX_a. Фактор IX анализировался за один этап с помощью процедуры определения времени образования активизированного частичного тромбопластика ("ATTT"), которую описали Smith. K.J. и др. Blood, 72, 1269-1277, 1988, а уровни содержания фактора IX_a определялись с помощью нового анализа, представленного в примере 3. В таблице 2 показано, что NaCl с концентрацией 1,4 М и выше дает максимальную защиту фактора IX от активности протеаз и сводят до минимума производство фактора IX_a при указанных условиях.

Из таблицы 2 можно видеть, что использование настоящего изобретения придает значительную стабильность фактору IX во фракциях протромбинового комплекса. Результаты, полученные сразу же и через 5 дней, были также получены с помощью вестерн-блоттинга по примеру 2 с использованием моноклонального антитела антифактора IX, который также реагирует с фактором IX_a и другими белками с молекулярным весом 54 килодальтона, полученными из фактора IX.

Пример 5. Влияние концентрации соли на стабильность фактора IX при двух различных температурах
Данный пример показывает, что использование относительно высокой концентрации соли в соответствии с настоящим изобретением эффективно в широком диапазоне температур.

Образец элюата DEAE-сефадекса, полученный в процедуре примера 1, который был осветлен, стерильно отфильтрован и содержал 1M NaCl и 10 мМ цитрата натрия с pH 7,0, был оттаян после хранения при -80^oC. Пять отдельных аликвотных проб образца были диализованы накануне при температурах 3^oC и 25^oC раствором хлорида натрия 1,0, 0,75, 0,5 им 0,15М, а затем анализировались с помощью вестенр-блоттинга на активность факторов IX и IX_a. При низких концентрациях диализной соли активация фактора IX существенна даже при 3^oC. Например, при 3^oC и 0,15 М NaCl примерно две трети исходного фактора IX выродились через 12 часов. Снижение уровней фактора IX_a в образцах, диализованных при низких концентрациях соли, также наблюдались при 3^oC и 25^oC и еще раз подтвердили их возможное содержание в протеолизе протромбинового концентрата.

На фиг. 3 показаны результаты вестерн-блоттинга, полученные при 25^oC. Результаты для 3^oC весьма похожи. Соответствующие пробирки содержат: (1) показатели молекулярного веса, (2) контрольный образец, состоящий из замороженного концентрата элюата, полученного на смоле DEAE-сефадекса, выдерживавшийся при высокой концентрации соли согласно настоящему изобретению; (3) оттаявшие образцы DEAE-концентрата (изготовленные по процедуре примера 1 и также содержащие порядка 1 М NaCl), добавленные непосредственно в родственный гель акриламида без диализа накануне; (4) образец DEAE-концентрата, изготовленный по процедуре примера 1 и диализованный накануне в 1,0 М NaCl; (5) образец, такой же как (4), но диализованный в 0,75 М NaCl; (6) образец, такой же как (4), но диализованный в 0,5 М NaCl; (7) образец, такой же как (4), но диализованный в 0,15 М NaCl.

Пример 6. Применение различных солей
Данный пример демонстрирует, как множество растворимых солей дают эффект защиты фактора IX.

Образец элюата DEAE-сефадекса, полученный в процедуре примера 1, перед хранением при -80^oC, был осветлен, стериально отфильтрован и содержал 1 М NaCl и 10 мМ цитрата натрия с pH 7,0. Пять отдельных аликвотных проб оттаянного раствора образца были диализованы накануне при температуре 3^oC в 1М растворах ацетата натрия, хлорида, лития, хлорида магния, хлорида калия, хлорида натрия и сульфата натрия. Диализованные растворы были подвергнуты анализу на содержание фактора IX и фактора IX_a, а также анализу на время образования неактивированного частичного тромбопластина, то есть тесту "NAPTT" (Кингдон, Г.С. и др. Thromb. Diath, Haemorr, 33, 617-631, 1975). Результаты приведены в таблице 3 и закончены проведением вестерн-блоттинга. Можно видеть, что LiCl, KCl, NaCl, MgCl₂ и Na₂SO₄ хорошо защищают фактор IX при концентрации 1,0 М. Замечено, что такие факторы могут иметь место в обоих конкретных сильных солевых растворах (Na или KSCN) и в некоторых умеренно сильных растворах (KCl и Na₂SO₄).

Диализат ацетата натрия показал гораздо большее производство фактора IX_a, чем растворы других растворимых солей, хотя в нем были замечены меньшая активация фактора IX и вырождение, что и следовало ожидать, используя диализный раствор 0,15 М NaCl.

Пример 7. Подтверждение чистоты фактора IX статистическим анализом Бесслера
Данный пример показывает, что фактор IX, очищенный согласно процессу примера 1, не вызывает нежелательного свертывания, что подтверждает проводимый на живых объектах (кроликах) анализ Бесслера на тромбогеничность.

Препараты фактора IX из соответствующих известному уровню техники элюатов DEAE-сефадекса (диафильтрованные в физиологически изотопном буфере) и конечные продукты фактора IX, изготовленные в соответствии с практически применением настоящего изобретения (с помощью анионообменной хроматографии и сохранения в высокой концентрации хлорида натрия до последующей иммуноаффинитивной хроматографии) были введены в отдельный живой объект, лигированные участки времени яремных вен кролика, в соответствии с процедурой, которую предложили Бесслер и др., журнал прикладной физиологии, 14: 943-946, 1959, для анализа закупорки вен тромбом.

Подсчет проводился по системе Бессера и др. В соответствии с размером сгустка, где сгусток +4 представляет собой наибольший размер сгустка, который может быть нормально создан из тромбогеничных материалов с учетом размеров и типа выбранных сосудов, a +1 является наименьшим сгустком, который можно определить визуально. Результаты оценок композиций известного уровня техники настоящего изобретения показывают, что по сравнению с композициями известного уровня техники композиции настоящего изобретения не оказывают разрушающего воздействия на живой объект вплоть до концентраций фактора IX в пересчете на кг веса намного превышающих те, которые будут реально назначаться человеку, больному гемофилией Б. Предполагается, что использование данного анализа совместно с анализами SDS-PAGE гелей для белков с молекулярным весом 54 килодальтона, а также с анализами фактора IX (пример 3) даст наилучший доступный способ предсказания возможности и безопасности использования терапевтических препаратов фактора IX для живых объектов.

Пример 8. Средние концентрации некоторых солей довольно эффективны для защиты фактора IX
Данный пример показывает, что некоторые растворимые соли эффективны в защите фактора IX при использовании при более низких концентрациях, чем концентрации, используемые обычно для хлорида натрия. Поскольку использование концентрата протромбинового комплекса может привести к опасным клиническим последствиям, то недавно открытые методики очистки включают в свои протоколы дополнительные этапы выделения для достижения еще большей чистоты фактора IX. Но не все эти способы выделения работоспособны в условиях высокой концентрации соли. Например, фактор IX может не связываться в аффинитивной колонне с конкретным антителом, если концентрация соли намного выше 0,5 М. Поэтому может оказаться желательно определить растворимые соли, которые вызывают эффекты защиты фактора IX при средних концентрациях, таких как 0,4 - 0,7 М и ниже.

В соответствии с этим пять аликвотных проб по 5 мл образца DEAE концентрата или так называемой "стабильной, обогащенной фактором IX фракции", изготовленной по протоколу примера 1 (содержащих 1,0 М NaCl, буферизованный при pH 7,0 10 М цитратом натрия), которые хранились в заторможенном виде при температуре -80^oC, были диализованы накануне при 4^oC 0,5М растворами NaCl, KCl, LiCl, Na₂SO₄ и MgCl₂. Для контроля использовался диализат цитрата, буферизованный 1М NaCl. Затем проводились анализы на содержание фактора IX и фактора IX_a и проводился вестерн-блоттинг, результаты которого представлены на фиг. 4.

Как видно из результатов вестерн-блоттинга на фиг. 4, буферизованные растворы 0,5 М хлорида магния (пробирка 3), сульфата натрия (пробирка 4), хлорида лития (пробирка 5) и хлорида калия (пробирка 6) продемонстрировали способность стабилизации фактора IX, которая приблизительно равна стабилизирующей способности 1,0 М NaCl (пробирка) и гораздо выше стабилизирующей способности 0,5 M NaCl (пробирка 7).

Пробирка 9 на фиг. 4 демонстрирует соответствующие указатели молекулярного веса. Пробирка 1 демонстрирует контроль DEAE-концентрата, изготовленного с помощью типичного процесса известного уровня техники и диализованного в изотоничном буфере перед замораживанием, что приводит к большому содержанию вырожденного белка с молекулярным весом 54 килодальтона, а пробирка 2 демонстрирует образец замороженного DEAE-концентрата, полученного в качестве элюата DEAE-сефадекса, содержащегося в высококонцентрированной соли в соответствии с практическим применением настоящего изобретения.

Изобретение относится к очистке и стабилизации фактора IX, терапевтической композиции и способу лечения болезни Кристмаса. Предложен новый способ защиты фактора свертывания крови IX от протеаз во время очистки или хранения. Высокие концентрации одной или более растворимых в воде органических и неорганических солей использованы для стабилизации фактора IX, содержащегося в растворах, получаемых из плазмы крови, или в растворах, получаемых из других источников, против его превращения в клинически непригодные белковые структуры, такие как фактор IХ_a и/или вырожденные белки фактора IX. Технический результат: способ полезен для стабилизации препаратов фактора IX с промежуточной чистотой во время очистки и для сохранения целостности очищенного фактора IX при длительном хранении. Кроме того, также раскрыты стабильные препараты фактора IX, обладающие большой удельной активностью. 4 с. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 ил.

1. Способ стабилизации фактора IX, полученного из плазмы крови человека или другого источника, при его хранении и очистке, причем указанная очистка включает два или более последовательных процесса разделения, по крайней мере один из указанных процессов выбирают из криопреципитации, ионообменной хроматографии, адсорбции гепарином, осаждения солью бария, фракционирования сульфатом аммония и аффинной хроматографии на антителах, включая в случае соответствия процессу разделения стадию элюирования 2-молярным раствором хлорида натрия или такой же концентрацией другой водорастворимой соли, отличающийся тем, что фактор IX стабилизируют в растворе от активации до фактора IXa или от разрушения до пептидов измененной длины и/или конформации путем добавления одной или более растворимых органических или неорганических солей к содержащему фактор IX раствору для обеспечения общей концентрации указанной соли или солей, то есть в диапазоне 0,35 - 3 М, и достаточной для того, чтобы предотвратить или свести к минимуму активацию или разрушение фактора IX, причем указанная общая концентрация соли или солей недостаточна для того, чтобы вызвать осаждение, или необратимое изменение, или денатурацию молекулы фактора IX, и поддержание концентрации соли или солей в растворе в указанной концентрации во время хранения или до тех пор, пока фактор IX не будет отделен от тех примесей, которые имеют свойство активировать фактор IX до фактора IXa, и/или разрушать фактор IX до пептидов измененной длины и/или конформации. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что добавляют одну или более из указанных растворимых солей к раствору во время или после каждого из указанных процессов отделения и концентрацию указанной соли или солей поддерживают в указанном растворе в течение периода, по меньшей мере, непосредственного до начала другого процесса отделения. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что растворимую соль выбирают из группы, состоящей из галогенидов аммония щелочного металла и щелочноземельного металла; тиоцианатов аммония, щелочного металла и щелочноземельного металла; фосфатов и сульфатов аммония и щелочного металла, сульфата магния, ацетатов щелочных металлов и щелочноземельных металлов, галогенидов алкиламмония и солей имидазола и лизина. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что растворимую соль выбирают из хлорида натрия, хлорида калия, хлорида лития, хлорида магния, тиоцианата натрия, тиоцианата калия и сульфата натрия. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная добавляемая соль является хлоридом натрия. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что общая концентрация соли или солей в растворе равна 0,4-1,4 М. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения терапевтической композиции, которая применима при лечении болезни Кристмаса, которая обладает удельной активностью более 50 единиц активности фактора IX/мг белка и которая способна храниться в форме раствора в течение периода времени, равного 2 неделям, при температуре 15-30^oC, в то же время оставаясь свободной от фактора IXa, денатурированных форм фактора IX и/или активных форм других факторов свертывания, в концентрациях, которые имели бы свойство вызывать выявляемые побочные клинические эффекты у людей, когда указанная композиция вводится в терапевтической дозе, способ включает стадии: а) контактирования свободной от криопреципитата плазмы крови с анионообменной смолой, на которой абсорбируется фактор IX и другие факторы; б) элюирование фактора IХ из анионообменной смолы путем контактирования смолы с раствором соли достаточной молярности для того, чтобы элюировать фактор IX и чтобы обеспечить элюат, содержащий фактор IX; в) поддержание в элюате, содержащем фактор IX, концентрации одной или более растворимых органических или неорганических солей в интервале 0,4 - 1,4 М; г) проведения хроматографии на иммуноафинной колонке элюата, содержащего фактор IX для связывания фактора IX на ней, причем концентрация соли в элюате является приблизительно от 0,4 до приблизительно 0,6 молярной при проведении хроматографии на указанной колонке; д) удаления фактора IX с иммуноафинной колонки для получения раствора, содержащего очищенный фактор IX. 8. Способ по п.2, отличающийся тем, что один или более последовательных процессов выделения выбирают из анионообменной хроматографии, адсорбции на геле гидроксида алюминия и осаждения хлоридом бария. 9. Способ по п. 7 или 8, отличающийся тем, что соль является хлоридом натрия. 10. Водный раствор частично очищенного фактора IX, содержащий фактор IX, обладающий заданной исходной удельной активностью, отличающийся тем, что он получен в соответствии с процессом по п.1 и в нем присутствует одна или более водорастворимых органических или неорганических солей в концентрации в интервале 0,35 - 3 М, причем указанная концентрация достаточна для предотвращения или по существу сведения к минимуму каталитического действия протеаз на фактор IX, но недостаточна для того, чтобы вызвать необратимые изменения, осаждение или денатурацию молекулы фактора IX, раствор при хранении в течение, по меньшей мере, 12 ч при температуре 4^oC или ниже, имеющий активность фактора IX, составляющую 80 - 100% указанной заданной исходной активности. 11. Терапевтическая композиция, содержащая фактор IX, пригодный для лечения недостаточности фактора IX, отличающаяся тем, что она представлена в форме водного раствора фактора IX, который может быть получен из раствора по п. 10 и который готов к употреблению, указанная композиция имеет удельную активность выше, чем 50 единиц активности фактора IX/мг белка, указанный раствор обладает достаточной чистотой, чтобы храниться в течение двух недель при температуре 15-30^oC, оставаясь достаточно свободной от концентрации фактора IXa, деградированных форм фактора IX и/или активных форм других факторов свертывания, такие концентрации в случае присутствия являются недостаточными, чтобы вызвать выявляемые побочные клинические эффекты у человека, когда указанную композицию вводят в терапевтической дозе. 12. Терапевтическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что она имеет удельную активность фактора IX выше, чем 100 единиц мг белка. 13. Способ лечения болезни Кристмаса у пациента, отличающийся тем, что такому пациенту вводится эффективное количество терапевтической композиции по п.11 или 12.