Способ получения белков с мол.м. 32000-34000, подавляющих свертывание крови Советский патент 1989 года по МПК A61K38/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии, и может быть использовано для получения белков с мол,м. 32000-34000, подавляющих свертывание крови.

Целью изобретения является повьшге- ние качества целевого продукта за счет предотвращения с лонности к кро- вотечениям при его использовании.

личео,тво тромбоцитов, центрифугируют в течение 15 мин при 10000 т. Таким образом получают плазму, свободную от тромбоцитов (PFP), которую исполь

На чертеже изображен профиль гель- зуют для определения противосвертыге-о-

15124734

личео,тво тромбоцитов, центрифугируют в течение 15 мин при 10000 т. Таким образом получают плазму, свободную от тромбоцитов (PFP), которую исполь

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии. Цель изобретения - повышение качества целевого продукта за счет предотвращения склонности к кровотечениям при его использовании. Для этого внутреннюю оболочку аорт или васкуляризованную ткань гомогенизируют в растворе 100 ммоль/л хлористого натрия, 50 ммоль/л гидрохлорида трис-(оксиметил)-аминометана, PH 7,5 (TBS), содержащем этилендиаминтетраацетат натрия, ингибитор трипсина из соевых бобов и бензамидин. Гомогенат центрифугируют 60 мин, при 100 000 G. Из надосадочной жидкости целевой продукт осаждают высаливанием сульфатом аммония. После центрифугирования при 10 000 - 12 000 G полученный осадок растворяют в малом объеме TBS, диализуют против TBS, содержащего бензамидин. Диализованную фракцию подвергают очистке с помощью хроматографии на гидроксиапатите, диализу, ионообменной хроматографии на сефацеле с диэтиламиноэтиловыми группами, повторному диализу. Полученную фракцию концентрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны РМ-10. Дальнейшую очистку проводят либо хроматографией на сефадексе G-100 с последующим диализом, либо с помощью гель-фильтрации на суперозе-12, ионообменной хроматографии на анионите Моно Q и повторной гель-фильрации на суперозе-12 с последующим диализом. Изобретение позволяет добиться получения целевого продукта более высокого качества, который в отличие от получаемого в способе-прототипе антитромбина-Ш не вызывает инактивации фактора свертывания крови Хаитромбина и поэтому не приводит к склонности к кровотечениям при его использовании. Целевым продуктом являются белки с мол.м. 32000 и 34000 и значениями изоэлектрической точки при PH 4,4-4,6.

фильтрации на сефадексе G-100, используемой на заключительной стадии очистки целевого продукта в примере 1.

Способ осуществляют следующим образом.

Внутреннюю оболочку (интиму) аорт или васкуляризованную ткань гомогенизируют в растворе 100 ммоль/л NaCl,

вающей активности фракций.

Непосредственно после сбора аорты животных тщательно промывают TBS, Ин- Q тиму отделяют от аорты и гомогенизируют в гомогенизаторе типа Баун MX 32, в TBS с 2 ммоль/л ЭЛТА (TBSE), который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов и 1,57 г/л бенз- 50 ммоль/л трис-НС1, рН 7,5 (TBS) , амидина.

держащем этилендиаминтетраацетат нат- Гомогенат из 8 аорт, который содер- рия (ЭДТА), ингибитор трипсина из сое- жит 20% (вес./объем) твердого веществых бобов и бензамидин. Гомогенат центрифугируют в течение 60 мин при 100000 g. Из надосадочной жидкости целевой продукт осаждают с помощью высаливания сульфатом аммония. После центрифугирования при 10000-12000 g полученный осадок растворяют в малом объеме TBS, диализуют против TBS,содержащего бензамидин. Лиализованную фракциао подвергают очистке с помощью хроматбграфии на гидроксиапатите, диализа, ионообменной хроматографии на сефацеле с диэтиламиноэтило- выми группами (ЛЕАЕ - сефацеле), повторного диализа. Полученную фракцию, содержащую VAC-белкк (vascular anticoagulant - противосвертывающее средство сосудистого происхождения),конпри 12000 g. Полученный осадок растворяют в малом объеме TBS и подвергают диализу против TBS, содержащего 1,57 г/л бензамидина. Лиализованную .фракцию подают на колонку (1 х X 20 см) с гидроксиапатитом, которая бьша уравновешена TBS. Колонку промы35

центрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны Amicon РМ-10.Дальнейшую очистку проводят либо хроматографией на сефадексе G-100 с последующим диализом, либо с помощью гель-фильтра- д.ки элюируют из колонки 200 мл натрий- ции на суперозе-12, ионообменной хро- фосфатного буфера (рН 7,5) с линейным

вают TBS в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. VAC-белградиентом 0-500 ммоль/л. Фракции,содержащие УАС-белки, объединяют и подвергают диализу против 50 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 (трис-трис/оксиметил/-аминометан).Такой же буфер применяют также для уравновешивания колонки (3x5 см), содержащей ЛЕАЕ-сефацель. В этой колонке диализат подвергают хроматографии,Колонку промывают применяемым для уравновешивания буфером, который берут в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. Затем VAC-белки элюируют из колонки с использованием 200 мл раствора NaCl , 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 с линейным градиентом NaCl 50-300 ммоль/л. Фракции, содержащие VAC-белкиi собирают, диализуют про

матографии на анионите Моно Q и повторной гель-фильтрации на суперозе-1 с последующим диализом.

Целевым продуктом являются белки с мол.м, 32000-34000, подавляющие свертывание крови, но отличающиеся по свойствам от получаемого в способе- прототипе белкового антикоагулянта антитромбина-Ш.

Пример 1. В течение 30 мин после забоя у крупного рогатого скота берут аорты. Кровь крупного рогатого скота собирают с добавлением цитрата натрия трехздмещенного до конеч- ной концентрации 0,38 вес.% и центрисЪугируют в течение 10 мин при комнатной температуре 2000 g. Полученную плазму, содержшчую небольшое ко

ва, центрифугируют в течение 60 мин при 100000 g.

В надосадочную жидкость добавляют порошок сульфата аммония до 30% от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и затем центрифугируют в течение 20 мин при 12000 g . В получаемую при этом надосадочную жидкость добавляют порошок сульфата аммония до 90% от насьпцающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин

и центрифугируют в течение 20 мин

при 12000 g. Полученный осадок растворяют в малом объеме TBS и подвергают диализу против TBS, содержащего 1,57 г/л бензамидина. Лиализованную .фракцию подают на колонку (1 х X 20 см) с гидроксиапатитом, которая бьша уравновешена TBS. Колонку промы

ки элюируют из колонки 200 мл натрий- фосфатного буфера (рН 7,5) с линейным

ки элюируют из колонки 200 мл натрий- фосфатного буфера (рН 7,5) с линейным

вают TBS в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. VAC-белки элюируют из колонки 200 мл натрий- фосфатного буфера (рН 7,5) с линейным

градиентом 0-500 ммоль/л. Фракции,содержащие УАС-белки, объединяют и подвергают диализу против 50 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 (трис-трис/оксиметил/-аминометан).Такой же буфер применяют также для уравновешивания колонки (3x5 см), содержащей ЛЕАЕ-сефацель. В этой колонке диализат подвергают хроматографии,Колонку промывают применяемым для уравновешивания буфером, который берут в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. Затем VAC-белки элюируют из колонки с использованием 200 мл раствора NaCl , 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 с линейным градиентом NaCl 50-300 ммоль/л. Фракции, содержащие VAC-белкиi собирают, диализуют про

31

тив 500 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 затем концентрируют с помощью ультрафйльтрационной мембрны Amicon РК-10. Концентрат объемом 2 мл подают на колонку (3x80 см) с с факдесом G-100, которая была уравновешена 500 ммоль/л NaCl и 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5. Элюат собирают фра циями па 2 мл, активные фракции, содержащие VAC-белки с мол,мае.32000 и 34000, диализуют против содержащего 10 об,% глицерина TBS и хранят при -70 С. Все стадии очистки проводят при 0-4 С.

Определение противосвертывающей активности содержащих VAC-белки фракций проводят следующим образом.

В кювете из силиконизированного стекла перемешивают (900 об/мин) 175 мкл испытуемой фракции (или 175 мкл TBS в качестве контроля) вместе с 50 мкл PFP и 25 мкл разбавленного бычьего тромбопластина (БТР После инкубации в течение 3 мин при 37°С вызывают коагуляцию путем добавления 250 мкл буфера, который содержит 80 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л СаС и Ю ммоль/л трис/НС1, рН 7,5. ОбразО вание фибрина регистрируют оптически Время свертывания контрольной пробы составляет 65 с. Это испытание применяют во время очистки для исследования различных фракций на наличие VAC-активности. Для определения выхода VAC-белков во время очистки определяют единицу VAC-активности, как такое количество VAC-б.елков, которое удлиняет время свертьгоания при вьппеука- занном испытании до 100 с,

В данном примере получены следующие результаты.

19500 ед. VAC-активности, удельная активность : 31,0 ед/мг;

выход 100%;

степень очистки 1,0,

470 мг белка; 19000 ед. VAC-активности} удельная активность 40,4 ед/мг; степень очистки 1,3.

3,Фракция после хроматографии на гидроксиапатите:

206 мг белка;

17-300 уд. VAC aктивнocти|

0

5

0

5

0

5

0

5

удельная активность 84,0 ед/мг-,

выход 89%

степень очистки 2,7.

13900 ед. VAC-активности; удельная активность 388 ед/мг; выход 71%; степень очистки 12,5.

666 ед. VAC-активности;

удельная активность 1480 ед/мг;

в з1ход 3,4%;

степень очистки 47,7,

Количество белка определялось по методу Lowry и сотр. (1951).

П р и м е р 2. Через 15 мин после родов собирают человеческие пуповины. Артерии Сразу же промывают ледяным буфером TBS, после чего гомогенизируют в гомогенизаторе типа Браун MX 32, в TBSE, которьй содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов и 1,57 г/л бензами- дина.

Гомогенат, который содержит 10% (вес/объем) твердого вещества, центрифугируют в течение 60 мин при 100000 g. В надосадочную жидкость, добавляют порошок сульфата аммония до 30% от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и затем центрифугируют в течение 20 мин при 100000 g.

Полученный осадок растворяют в малом объеме TBS и подвергают диализу против TBS, содержащего 1,57 г/л бензимидина.Диализованную фракцию подают на колонку (1x20 см) с гидроксиапа- титом, которая бьша уравновешена TBS. Колонку промывают TBS в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. VAC-белки рлюируют из колонки 200 мл натрийфосфатного буфера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 ммоль/л. Фракции, содержаш 1е VAC-белки, объединяют и подвергают диализу против 50 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л-трис/НС, рН 7,5.

Такой же буфер применяют для уравновешивания колонки (3x5 см),содержащей ДЕАЕ-сефацель. В этой колонке диализат подвергают хроматографии, Колонйу промывают применяемым для уравновешивания буфером, который берут в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. Затем VAC-белки

элюиругот нз колонки с использованием 200 мл раствора NaClв 20 ммоль/л трис/НС, рН 7,5, с линейным градиентом NaCl 50-300 ммоль-/л. Фракции, содержащие. белки-VAC, собирают, диа- лизуют против 500 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л трис/НС1, рН 7,5 и затем концентрируют с -помощью ультрафильтрационной мембраны Amicon РМ-10. Концентрат объемом 2 подают на колонку (3x80 см) с сефадексом G-100 которая была уравновешена 500 ммоль/л NaCl и 20 ммоль/л: трис/НС1, рН 7,5. Элтоат собирают фракциями по 2 мл, активные фракции, содержащие VAC-бел ки с мол.мае. 32000 и 34000, диали- зуют против содержащего 10 об.% глицерина TBS и хранят при 70°С. Все стадии очистки проводят при 0-4° П р и м е р 3. Получаемую непосрественно после родов человеческую плаценту охлаждают до 4 С и освобождают от крови. Удаляют мембранный материал и гомогенизируют в буфере TBS с 7,4, который содержит 1 ,,57 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов, 1,6 г/л бензамидина и 1 ммоль/л ЭДТА, Гомогенат, который содержит 20% (вес./объем) твердого вещества, центрифугируют в течение 60 мин при 100000 g. В надосадочную жидкость добавляют порошок су шфата аммония до 30% от насьпцающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин л затем и.ентрифугируют в течение 20 мин при 10000 g.

Полученный осадок растворяют в малом объеме TBS и подвергают диализу пр ТИБ TBS,содержащего 1 ,57 г/л бензамидина. Диалнзованную фракцию подают на колонкз (1x20 см) с гидроксиапатитом которая была уравновешена TBS. Колонку промывают TBS в количестве,соо ветствующем 4 объемам слоя колонки. VAC-белки элюируют из колонки 200 мл натрийфосфатного буфера (рИ 7,5) с линейным градиентом 0-500 ммоль/л„ Фракции, содержащие VAC-белки, объединяют и подвергают диализу против 50 ммоль/л NaCl, 20 ммоль/л трис/НС1 7,5.

Содержащие VAC-белки фракции подвергают дальнейшей очистке путем .разделения на колонке с ДЕАЕ-сефаце- лем.. Колонка была уравновешена 20 ммоль/л трис/НС1 буфером с 50 ммоль/л хлористого натрия, рН 7,4 Связанные VAC-белки элюируют тем же

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

буфером с 300 ммоль/л хлористого натрия, рН 7,4, Затем последовательно осуществляют при комнатной температуре следующие хроматографичес- кие операции;с, гель-фильтрацию содержащих VAC-белки фракций на колонке с суперозой-12 (торговый продукт шведской фирмы Фармация, который представляет собой сшитую агарозу с величиной частиц 10 мкм), которая была уравновешена буфером 20 ммоль/л бис-трис/НС1,. 100 ммоль/л хлористого натрия, рН 6,3, и ионообменную хроматографию элюата на Моно О (торговый продукт шведской фирмы Фармация, который представляет собой анионит шариковой структуры с величиной частиц 10 мкм), который был уравновешен применяемым на предыдущей стадии буфером, Элюцию осуществляют с использованием линейного градиента хлористого натрия в 20 ммоль/л бис-трис/НС1, рН 6,3 о VЛC бeлки элюируют при 190 ммоль/л хлористого натрия. Затем содержащие VAC-белки фракции подвергают повторной хроматографии на суперозе-12. После диализа против буфера TBS фракции, содержащие VAC-белки с мол.гас.32000 и 34000, хранят при -70°С,

Пример4. В течение 30 мин после забоя у крупного рогатого скота берут аорты.

Непосредственно после сбора аорты основательно промывают TBS. Интиму отделяют от аорты и гомогенизируют в гомогенизаторе типа Браун MX 32, в TBSE, который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов и 1,57 г/л бензамидина.

Гомогенат центрифугируют в течение 60 мин при 100000 g.

В надосадочную жидкость добавляют порошок сульфата аммония до 30% от насьш,а1ощей концентрации;, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют в течение 20 мин при 12000 g. Твердое вещество суспендируют в малом объеме IBS и подвергают диализу против TBS, содержащего 1,57 г/л бензамидина. Диализованную фракцию подают на колонку (1x20 см) с гидроксиапатитом, которая была уравновешена TBS. Колонку промывают TBS в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. VAC- белки элюируют из колонки 200 мл натрийфосфатного буфера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 ммоль/л.

Содержащие VAC-белки фракции подвергают дальнейшей очистке путем раз деления на колонке с ДЕАЕ-сефацелем. Колонка бьша уравновешена 20 ммоль/л трис/НС буфером, 50 ммоль/л хлористого натрия, рН 7,4,

Связанные VAC-белки элюируют с использованием 200 ммоль/л трис/НС1 буфера, 300 ммоль/л хлористого натри рН 7,4. Затем последовательно осуществляют при комнатной температуре слдующие хроматографические операции: гель-фильтрацию содержащих VAC-белки фракций на колонке с суперозой-12, к торая была уравновешена буЛером 20 ммоль/л бис-трис/НС1, 100 ммоль/л хлористого натрия, рН 6,3, и ионно- обменную хроматографию элюата на анионите Моно О, который бьш уравно- вешен применяемым на предыдущей стадии буфером, Элюцию осуществляют использованием линейного градиента хлористого натрия в 20 ммоль/л бис-трис/НС1, рН 6,3, VAC-белки элюи руют при 190 ммоль/л хлористого натрия. Затем содержащие VAC-белки фракции подвергают повторной хроматографии на суперозе 12. После диализ против буфера TBS фракции, содержа- щие VAC-белки с мол, мае,32000 и 34000, хранят при -70°С, Все стадии очистки -проводят при 0-4 С,

С помощью диск-электрофореза в по лиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия установлено, что получаемая VAC-активность представлена белкйми с мол.мае, 32000 и 34000,

Изоэлектрофокусирование при рН 3,5-9,5 в тонкослойных пластинах полиакриламидного геля показало, что VAC- белки имеют значения изоэлектри- ческой точки при рН 4,4-4,6,

АминокислотньТй состав обоих VAC- белков, определяемый с помощью кислотного гидролиза, представлен в таблице (Тгр не определялся).

Q |520 5 30

0

35

0

5

5

По своей биологической активности VAC-белки могут быть охарактеризованы следующим образом:

-они тормозят активацию про- траЯбина с помощью фактора свертываемости крови Ха в присутствии отрицательного заряженных фос- фолипидов и ионов Са

-они не тормозят-биологическую и амидолитическую активность факторов Ха и Па,

-они тормозят in vitro активацию фактора X по внутреннему пути с помощью фактора 1Ха в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидов и

и ионов ,

-они тормозят in vitro индуцированное стенкой сосуда свертывание крови;

-они вытесняют фактор Ха и про- трамбин из комплекса с отрицательно заряженной поверхностью фосфолипидов ;

-они удлиняют тромбиновое время, определенное модифицированным методом;

-они удлиняют активированное, частичное тромбопластиновое время, определенное модифицированным методом;

-они удлиняют протромбиновое время;

-на их активность не оказывают влияние коллагеназа и/или эластаза.

При хранении в TBS, содержащем 10 об.% глицерина, VAS-активность стабильна по крайней мере в течение 3 мес при -70°С, при 0°С - по крайней мере 12ч, при 37 С - по крайней мере 30 мин. При 56 С активность исчезает в течение 2 мин.

Получаемый в способе-прототипе антитромбин-Ш приводит к увеличению склонности к кровотечению, что обусловлено тем, что он связывается с активированными факторами свертьша- ния крови, в результате чего имеет место их инактивация. Получаемые же

SO 80 т Ш

Составитель В,Гудошников Редактор А,ЛОЛИНИЧ Техред Л,Сердюкова:

/W

/W т т 200 №(рракции

Корректор М,Шароши