БИОКРИСТАЛЛИЗАТОР Российский патент 1995 года по МПК C30B7/00 C30B29/58 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения монокристаллов макромолекул в условиях микрогравитации (МГ) на борту орбитальной станции и на Земле.

Кристаллизация макромолекул в условиях МГ позволяет получить высокооднородные и крупные кристаллы белков, необходимые для рентгеноструктурного анализа, с помощью которого можно изучать пространственную структуру молекул биообъектов, таких как белковые лекарственные или профилактические препараты, определять их свойства и механизмы функционирования в организме.

Известен биокристаллизатор [1] содержащий корпус с крышкой. Непосредственно в теле корпуса выполнены кристаллизационные ячейки, включающие камеры с белковым раствором и концентрично расположенные с ними камеры для раствора осадителя. В крышке расположены ответные камеры, в которых перемещается клапан, выполненный в виде поршня с седлом. При перемещении клапана вверх, что проделывает оператор с каждой кристаллизационной ячейкой отдельно, камеры с белковым раствором и раствором осадителя сообщаются для осуществления процесса кристаллизации. Кристаллизатор стерилизуется и заправляется на Земле и доставляется на борт в упаковочном ящике. Кристаллизация в нем происходит в условиях рабочего отсека орбитальной станции, снабженного системой терморегулирования, поддерживающей температуру в рабочем отсеке в пределах 18-24^оС.

Такой биокристаллизатор обладает следующими недостатками. Это устройство не удобно в эксплуатации как при наземном обслуживании, так и в космосе. На Земле для заправки камер надо снять крышку и заполнить все кристаллизационные ячейки при снятой крышке, при этом велика опасность занесения "чужого" раствора в соседнюю камеру, так как может произойти взаимное загрязнение растворов. Чтобы извлечь монокристаллы на Земле после эксперимента, необходимо снова снять крышку и обнажить все ячейки сразу (или по 12 шт. крышка секционна). Долгий процесс разгерметизации ячеек на Земле приводит к быстрому изменению концентрации маточного раствора в боковой камере за счет нарушения равновесия при испарении растворителя, что приводит к разрушению или оплавлению монокристалла белка. Такие случаи имели место в совместном эксперименте на орбитальной станции "Мир", поэтому в настоящее время выдвигается требование вскрывать для извлечения кристалла только ту ячейку, с которой работают, и сразу переносить монокристалл в соответствующий маточный раствор.

Кроме того, выполнение камер кристаллизационных ячеек непосредственно в корпусе приводит к тому, что в случае разгерметизации ячеек, расположенных в середине корпуса, загрязняются и выходят из строя соседние, а разгерметизация крайних ячеек приводит к заражению биообъектами рабочего отсека и оператора, при этом согласно требованиям к условиям обеспечения космического полета устройство с таким дефектом должно быть удалено с борта космического аппарата.

При этом устройство не содержит собственных средств термостатирования, что ведет к большому (до 5^оС) разбросу температур в течение 1-2 месячного времени роста кристаллов. Кроме того, из-за выполнения ячеек в едином корпусе это устройство не ремонтоспособно.

Таким образом, перечисленные недостатки конструкции ставят под сомнение надежность проведения столь "тонкого" и зависящего от многих факторов процесса кристаллизации.

Наиболее близким к изобретению является устройство кристаллизации в условиях космического корабля [2] содержащее термостат, в котором размещена по крайней мере одна камера, связанная со средствами ввода и вывода осадителя, и другая герметичная камера, включающая тигели с раствором кристаллизуемого вещества. Герметичная камера снабжена внутренней перегородкой с мембранами, которая обеспечивает доступ осадителя в камере к кристаллизуемому веществу в тигеле. Герметичная камера в процессе подготовки устройства к работе вставляется в основную камеру вместо съемной крышки. Включение в процесс осуществляется посредством использования системы подачи осадителя из двух шприцев с разными концентрациями в герметичную камеру, предварительно заполненную раствором осадителя недостаточной концентрации, доведения концентрации до необходимого заданного уровня и последующим подъемом перегородки.

Устройство-прототип имеет следующие недостатки. Оно неудобно в эксплуатации, так как не обеспечивает качество рабочих сред в ячейке к началу эксперимента. Чтобы начать процесс кристаллизации, необходимо либо во время предстартовой подготовки на Земле, либо на орбите заменять крышку в основной камере на герметичную камеру с белковыми тиглями. В этот момент может произойти расстерилизация стыков камер, попадание нежелательных микроэлементов в камеру с осадителем, что приведет к изменению характеристик раствором. Значит, чтобы провести новый эксперимент с данным устройством, его надо целиком вернуть с орбиты на Землю для лабораторного регламентного обслуживания (заменить шприцы с осадителем, промыть гидросистемы, стерилизовать и снова заправить).

Кроме того, данное устройство позволяет использовать в одном эксперименте только один тип осадителя для нескольких кристаллизационных ячеек, а использование для каждой ячейки отдельного типа осадителя, что крайне важно для экспериментальной установки, привело бы к необходимости многократного увеличения габаритов и массы, так как потребовало бы размещения в нем соответствующих комплектов шприцов и гидромагистралей, а также сильно сказалось бы технологическое влияние изготовления гидромагистралей на условия подачи осадителя, различия расходов в магистралях от общего шприца, разной концентрации осадителя в камерах и соответственно привело бы к разным условиям кристаллизации в кристаллизационных ячейках.

При этом большая часть устройства, например основная камера с системой подачи и термостатом, монтируется заранее в условиях предполетной подготовки и только герметичная камера устанавливается в основную перед началом работы. Это создает условия невозможности быстрой замены белковых растворов и осадителя в случае разгерметизации общей гидросистемы устройства и опасность расстерилизации. Учитывая жесткую и необратимую циклограмму предполетной подготовки всего изделия, последний недостаток имеет крайне негативное значение.

Задачей изобретения является создание устройства для кристаллизации белков, преимущественно для работы в условиях космоса, предназначенного, кроме того, и для экспериментальной отработки режимов кристаллизации, отвечающего требованиям высокой надежности и удобства эксплуатации, экономичности и универсальности, а также ремонтоспособности с широким диапазоном белка и осадителя и с одинаковыми условиями по температуре для всех ячеек.

Сущность изобретения заключается в том, что в биокристаллизатор, содержащий термостат, в котором размещены кристаллизационные ячейки с камерами для раствора белка и осадителя и с устройством включения ячейки по крайней мере одна кассета, представляющая собой прямоугольный брусок, кассеты установлены в термостате с контактом друг к другу и к теплоотводящим поверхностям термостата, при этом в каждой кассете выполнен ряд одинаковых посадочных гнезд для установки в них с контактом кристаллизационных ячеек со средствами ориентации и фиксации ячейки в гнезде, причем корпус каждой кристаллизационной ячейки выполнен в виде модуля, а каждая кассета снабжена приводом одновременного включения ячеек, взаимодействующим с устройством включения каждой ячейки.

Привод одновременного включения ячеек может быть выполнен в виде вала, пропущенного в сквозные отверстия кассеты и каждого модуля этой кассеты.

Технический результат заключается в том, что по сравнению с известными техническими решениями предлагаемая конструкция обеспечивает высокую надежность процесса выращивания монокристаллов, а также удобство и доступность эксплуатации его на любом этапе подготовки, в процессе работы на орбите на этапе послеполетного обслуживания, когда необходимо изъять выращенные кристаллы. Устройство мобильно, ремонтоспособно и поэтому экономично, обеспечивает идентичность температурных и других заданных равных условий кристаллизации для всех ячеек.

Модульное выполнение корпуса каждой кристаллизационной ячейки, средства установки их в гнездах отдельных кассет, снабженных общим приводом, обеспечивает ремонтопригодность всего устройства, взаимозаменяемость любой ячейки или кассеты на любом этапе эксперимента без возвращения устройства на Землю и без дополнительной стерилизации. В случае разгерметизации ячейки вышедшие из строя кристаллизационные ячейки просто и быстро вынимаются оператором из гнезда и заменяются на новые, заправленные и постерилизованные, готовые к работе. Эту операцию можно проделать и целиком для кассеты, не причиняя вреда ни соседним ячейкам, ни соседним кассетам.

Введение кассет обеспечивает независимость моментов начала и прерывания эксперимента по кристаллизации для различных кассет с группами ячеек, содержащих разные комбинации белков и осадителей.

В то же время выполнение кассет в виде прямоугольных брусков из теплопроводного материала, плотная установка их с контактом друг к другу и теплопроводящим поверхностям термостата позволяет создать для кристаллизационных ячеек одинаковый и заданный тепловой режим, а при достижении номинального температурного уровня в снабженных общим приводом кассетах одновременно включаются в работу сразу все ячейки кассеты, при этом исключаются повторения множества однотипных операций при обслуживании каждой ячейки, которые могли бы привести к ошибкам и разбросам.

Взаимодействие общего привода с устройствами включения каждой ячейки обеспечивает воспроизводимость номинальных условий протекания процесса кристаллизации в случае замены ячеек на любом этапе эксплуатации.

Модульное выполнение кристаллизационных ячеек обеспечивает удобную, надежную и независимую стерилизацию ячеек.

Кювета позволяет в экспериментальной установке использовать и отрабатывать модули ячеек разной конструкции, их быстрый демонтаж и замену.

Кроме того, модульное выполнение кристаллизационных ячеек и кассетный принцип их укладки позволяют реализовать процесс кристаллизации для сколь угодно широкой комбинации белковых и осаждающих растворов с выполнением требований сохранения стерильности, а значит, надежно. Эти же особенности конструкции позволяют на завершающем этапе эксплуатации, на Земле, последовательно изымать выращенные монокристаллы из ячеек, переносить их в маточный раствор, не нарушая целостности и равновесия кристалла и среды соседних ячеек.

На фиг. 1 представлен биокристаллизатор, вид сверху; на фиг. 2 то же, вид сбоку; на фиг. 3 разрез кассеты; на фиг. 4 модуль ячейки в разрезе; на фиг. 5 устройство фиксации модуля ячеек в кассете; на фиг. 6 крышка корпуса термостата, вид спереди.

Биокристаллизатор включает корпус 1 термостата, в котором смонтирована выполненная известным образом система термостатирования с термоэлектрическими элементами 2 и теплоотводящими поверхностями 3, представляющими собой медный кожух, способствующий равномерному распределению температуры по объему кассет. На корпусе термостата расположена панель с блоком управления исполнительными органами системы термостатирования (не показана).

В медном кожухе с контактом к нему и с контактом друг к другу установлены кассеты 4.

Каждая кассета представляет собой брусок из теплоемкого материала, например пластмассы, прямоугольной формы, что позволяет обеспечить плотный контакт между кассетами, способствующий равномерному распределению тепла в теле кассет. В кассете выполнены посадочные гнезда 5, внутренняя поверхность которых идентичная поверхности корпуса кристаллизационной ячейки 6, например цилиндрическая. Такое выполнение сопрягаемых поверхностей также способствует плотному контакту между ячейками и кассетой, обеспечивая одинаковые температурные условия для всех ячеек.

Кристаллизационная ячейка 6 выполнена как независимый модуль, в корпусе, не подлежащем разборке после стерилизации и заправки растворами в течение всего процесса кристаллизации вплоть до доставки на Землю. Модуль представляет собой корпус 7, в котором расположены камеры 8 и 9 для растворов белка и осадителя соответственно, индивидуальное устройство включения модуля, содержащее втулку-кулачок 10, взаимодействующий с эластичной трубкой 11, размещенной в соединительном канале между камерами 8 и 9 с белком и осадителем. Во втулке выполнено сквозное отверстие 12, в которое пропускается вал индивидуального или общего привода.

На фиг. 5 показана установка кристаллизационной ячейки 6 в посадочном гнезде 5. С помощью буртика 13 на корпусе ячейки, пластинчатой пружины 14 и вертикального паза 15 кристаллизуемые ячейки фиксируются контактно в посадочных гнездах. Вертикальные пазы 15 для всех посадочных гнезд расположены под одинаковым углом к продольной оси кассет и выполняют функцию одинаковой ориентации ячеек относительно кассеты с тем, чтобы обеспечить соосное расположение сквозных отверстий 16 кассеты и каждого модуля 12, в которых пропущен вал 17 общего привода одновременного включения ячеек. Каждая кассета имеет свой общий привод одновременного включения ячеек. На крышке термостата напротив каждой кассеты установлено индикаторное устройство с градуировочной шкалой 18. Вал 17 общего привода входит в зацепление с втулкой-рукояткой 19, снабженной указателем 20, взаимодействующим с градуировочной шкалой 18. Вал снабжен фиксатором 21 относительно корпуса кассеты. Кассеты вкладываются в корпус 1 и фиксируются в нем крышкой 25. На корпус термостата устанавливается координационный механизм 22 портального типа для подстыковки средств 23 фоторегистрации. В корпусе 1 термостата напротив каждого посадочного гнезда 5 в кассетах 4 соосно с ним выполнены смотровые окна 24.

Биокристаллизатор работает следующим образом.

На Земле в период предполетной подготовки независимые кристаллизационные модули проверяют на герметичность, стерилизуют в специализированной лаборатории комплексом различных методов, затем заправляют камеры 8 и 9 растворами белка и осадителя, герметизируют модули и устанавливают и группами по 6 шт. в кассеты 4. Кассеты вкладывают в корпус термостата и задвигают крышкой 25, проверяют наличие и целостность всех узлов устройства.

В собранном виде биокристаллизатор доставляется на орбиту в упаковочном контейнере. Одновременно в пассивных термостатах на орбиту доставляется необходимое количество подготовленных к работе указанным образом кристаллизационных модулей.

В условиях орбитальной станции оператор работает с биокристаллизатором. Для приведения устройства в рабочее состояние оператор поворачивает втулку-рукоятку 19, связанную с указателем 20, взаимодействующим с градуировочной шкалой 18, на заданный угол. При этом вал 17, находящийся в зацеплении с втулкой-рукояткой 19 и пропущенный через сквозное отверстие 16 в кассете и соосное ему сквозное отверстие во втулке-кулачке каждого модуля 12, открывает эластичную трубку 11 в соединительном канале на соответствующее углу поворота проходное сечение. Предварительно, при наземной отработке устройства проведена тарировка индикаторного устройства, показывающего площадь проходного сечения эластичной трубки 11, в зависимости от угла поворота вала 17. Начинается процесс кристаллизации. Принцип действия ячеек основан на эффекте направленной диффузии растворителя через полупроницаемую мембрану, разделяющую растворы с разной концентрацией солей белкового раствора и раствора осадителя. Изменяя затем проходное сечение эластичной трубки 11 в соединительном канале вращением вала 17, изменяют диффузионный поток на границе с белковым раствором, воздействуя таким образом на скорость процесса кристаллизации. На орбитальной станции оператор устанавливает координационный механизм 22 на корпус термостата и через смотровые окна 24 наблюдает за ростом кристаллов и фотографирует процесс с помощью средств 23 фоторегистрации. По окончании процесса кристаллизации поворотом вала до упора оператор пережимает проходное сечение эластичной трубки 11 в соединительном канале. Процесс прекращается.

В случае необходимости оперативной замены кристаллизационного модуля оператор, не приостанавливая процесса, открывает крышку 25 термостата, вынимает вал общего привода 17 (предварительно приводом индивидуального включения выставляет новый модуль на заданный угол), заменяет использованный модуль на новый, снова устанавливает вал общего привода в кассету и закрывает крышку термостата.

Таким образом, по сравнению с известными техническими решениями предлагаемое устройство обладает надежностью, удобством эксплуатации, ремонтоспособностью, оно экономично и выполняет поставленную задачу.

Изобретение может быть использовано для получения монокристаллов макромолекул в условиях микрогравитации на борту орбитальной станции и на Земле. Биокристаллизатор содержит термостат, в котором размещены кристаллизационные ячейки, выполненные в виде модуля с камерами для растворов белка и осадителя и с устройством включения модуля. В устройство введена по крайней мере одна кассета, при этом в каждой кассете выполнен ряд одинаковых посадочных гнезд для установки в них с контактом кристаллизационных модулей. Каждая кассета снабжена приводом одновременного включения ячеек с индикаторным устройством, а привод одновременного включения ячеек взаимодействует с устройствами включения каждой ячейки. Конструкция обеспечивает не только высокую надежность процесса выращивания монокристаллов, но и удобство эксплуатации его на любом этапе подготовки, в процессе работы на орбите и на этапе послеполетного обслуживания. Устройство обеспечивает равные и заданные условия кристаллизации для всех ячеек. 1 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. БИОКРИСТАЛЛИЗАТОР, содержащий термостат, в котором размещены кристаллизационные ячейки с камерами для растворов белка и осадителя и со средством включения ячейки, отличающееся тем, что корпус каждой кристаллизационной ячейки выполнен в виде съемного модуля, модули размещены в одинаковых посадочных гнездах по крайней мере одной кассеты с контактом с ней, при этом кассеты установлены в термостате с контактом одна с другой и с теплоотводящими поверхностями термостата, каждое посадочное гнездо под модуль имеет средства ориентации и фиксации модуля, а каждая кассета снабжена приводом одновременного включения ячеек с индикаторной шкалой, взаимодействующим со средствами включения каждой ячейки. 2. Биокристаллизатор по п.1, отличающийся тем, что привод одновременного включения ячеек выполнен в виде вала, пропущенного в сквозные отверстия кассеты и каждого модуля этой кассеты.