ПРОИЗВОДНЫЕ ТАКСОЛА И ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ТАКСОЛА Российский патент 1995 года по МПК C07D305/14 

Изобретение относится к водорастворимым производным таксола с противоопухолевой активностью, а более конкретно к сульфированным производным 2'-акрилоилтаксола, производным 2'-сульфоалкиламино-0-ацилкислого таксола и 2'-этилен-гликоль-0-ацилкислого таксола.

Основа изобретения.

Таксол это дитерпеноид природного происхождения, обладающий значительной противоопухолевой активностью, проявившей ее по отношению к опухолям различной природы. Впервые о выделении таксола и его структуре было сообщено Wani в "Противоопухолевые препараты растительного происхождения. VI выделение и структура таксола. Новые противоопухолевые и противолейкемические препараты из Taxus brevifolia", J.Am.Chem.Soc. 1971, 93, 2325. Таксол обнаружен в коре тиссового дерева, Taxus brevifolia. также, как и T.Baccata и T.cuspidata.

Биологическая активность таксола связана с его действием на процесс деления клеток. Таксол промотирует образование микроканальцев, образующих митотическое веретено в процессе клеточного деления. Однако, таксол предотвращает деполимеризацию тубулина, образующего микроканальцы митотического веретена, которая оказывает существенное влияние на процесс клеточного деления. Таким образом, таксол служит причиной остановки клеточного деления. Механизм действия таксола обладает особенностью, связанной с тем, что он промотирует образование полимеров тубулина, в то время как другие противоопухолевые препараты, такие как винбластин и колцихин, предотвращают обpазование микроканальцев.

Обширное обследование таксола не было осуществлено, поскольку таксол выделен лишь в небольших количествах и до сих пор еще не существует успешного пути синтеза таксола. Предварительные исследования показали, что таксол может обладать маргинальной активностью при острых лейкемиях и меланомах, и некоторая активность наблюдалась в случае некоторых других опухолей. Далее, исследования Mc Juire и других показали, что таксол должен быть активным в отношении рака яичником, не подающегося лечению лекарственными препаратами, см. "Таксол: Уникальное противоопухолевое средство, эффективно действующее на прогрессирующие овариальные эпителиальные новообразования", Ann.Int.Med. 1989, III, 273-279, Однако, из-за низкой растворимости таксола в воде, его вводят путем инфузий, pазбавляя водными растворами декстрозы.

Следует отметить, что в фазе I клинических испытаний таксол сам не оказывает повышенного токсического действия, но тяжелые аллергические реакции были вызваны эмульгаторами, вводимыми вместе с таксолом для того, чтобы компенсировать низкую растворимость таксола в воде. Действительно, по крайней мере, один смертный случай был вызван аллергической реакцией, индуцированной эмульгаторами. В связи с этим, исследователи предприняли попытку создать водорастворимые производные таксола, которые бы сохраняли свою противоопухолевую и противораковую активность.

Приведенная на фиг. 1 структура таксола охарактеризована данными ¹Н ЯМР-спектра образца таксола. Сигналы ЯМР спектра хорошо различимы и перекрывают область 1,0-8,2 м. д. Для простоты, спектр разделен на три области: первый диапазон 1,0-2,5 м.д. включает интенсивные 3-протонные сигналы метильных и ацетатных групп, а также сложные мультиплеты, вызванные некоторыми метиленовыи группировками; второй диапазон 2,5-7,0 м.д. включает сигналы протонов таксанового скелета и боковой цепи, а третий диапазон 7,0-8,2 м.д. включает сигналы ароматических протонов С-3 бензоата, С-3-фенильной и С-3-бензамидной групп. Пики ЯМР спектра на фиг. 1 отмечены в соответствии с номером углеродного атома в структуре таксола, с которым связаны протоны, дающие сигналы.

Magri и Kingston сообщили с биологической активности таксолов, замещенных в положении С-2' и C-7, которые были синтезированы для того, чтобы увеличить растворимость в воде, см. "Модифицированные таксолы. Синтез и биологическая активность таксолов, модифицированных в боковой цепи, "Journal of Natural Products, 51, N 2, стр. 298-306, март-апрель 1988. Был синтезирован 2'-(трет-бутилдиметилсилил)таксол и было установлено, что это производное по существу неактивно; это привело к мысли о том, что биологическая активность проявляется у тех производных таксола, у которых в положении 2'-боковой цепи таксола находится свободная гидроксильная группа. Далее, ацильные заместители в положении 2' в 2'-ацетилтаксоле и 2',7-диацетилтаксоле легко гидролизовались в условиях in vivo, и оба эти соединения проявили активность в биоисследовании на клеточной культуре. Лабильность ацильных заместителей в 2'-положении навела на мысль о том, что 2'-ацетилтаксолы могут служить в качестве пролекарственных форм таксола. (Как правило, пролекарственная форма это соединение, которое проявляет фармакологическую активность после биотрансформации).

Magri и Kingston сообщили, что два таксола с повышенной растворимостью в воде были получены ими: 2'-(β -аланил)таксол

и 2'-сукцинилтаксол:

Было установлено, что 2'-(β -аланил)таксол активен как in vivo, так и in vitro, но само соединение не стабильно. 2'-сукцинилтаксол, полученный путем обработки таксола ангидридом янтарной кислоты, обладает меньшей Р-238 активностью in vivo в сравнении с таксолом. В результате, попытки исследователей были сосредоточены на создании других производных таксола, которые бы не страдали от нестабильности и были бы активны как in vitro, так и in vivo. Deutsch и другие в работе "Синтез родственных соединений и пролекарственных форм. 3¹. Водорастворимые пролекарственные формы таксола, обладающие значительной противоопухолевой активностью", J.Med.Chem. 1989, 320 788-792. Сообщили, что соли 2'-сукцинилтаксола и 2'-глутарилтаксола обладают повышенной противоопухолевой активностью в сравнении со свободными кислотами. Поскольку этими исследователями было выдвинуто предположение о том, что соли, содержащие различные противоионы, зачастую отличаются по своим свойствам, то было синтезировано и проверено множество 2'-замещенных солей таксола. Установлено, что соли производных 2'-замещенного таксола с триэтаноламином и N-метилглюкамином обладают лучшей растворимостью в воде и повышенной активностью в сравнении с натриевыми солями. Далее, было установлено, что ряд солей 2'-глутарилтаксола обладают повышенной активностью в сравнении с аналогичными соединениями 2'-сукцинилтаксола. В частности, хорошую растворимость и биоактивность продемонстрировала соль таксола, полученная при взаимодействии 2'-глутарилтаксола с 3-(диметиламино)-1-пропиламином, с использованием N, N-карбонилдимидазола (КДИ).

Кроме того, для увеличения растворимости и биоактивности таксола, необходимо, чтобы производные таксола обладали повышенной стабильностью для продления срока их хранения. Полагают, что соли эфиров таксола легко гидролизуются в присутствии основания, и водорастворимые группы, такие как соли карбоновых кислот или соли аминов, обладают склонностью к превращению в основную форму. Итак, желательно, синтезировать нейтральные, водорастворимые производные таксола, активность которых была бы выше или сравнима с активностью самого таксола. Соли органических сульфонатов склонны к образованию нейтральной или слабоосновной среды, и поэтому, сульфонатные соли эфиров таксола должны обладать повышенной стабильностью.

Далее, в связи с трудностями синтеза солей карбоновых кислот и солей аминов эфиров таксола, желательно было найти менее дорогие водорастворимые производные такосла и способ их получения.

Настоящее изобретение относится к получению водорастворимых производных таксола и водорастворимых сульфонатных солей таксола. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, 2'-[(3-сульфо-1-оксопропил)-окси]-таксола натриевая соль получена при взаимодействии таксола с акриловой кислотой, при этом полученный 2'-акрилоилтаксол далее вступает в реакцию Михаэлиса с бисульфитом натрия, образуя соль 2'-сульфоэтилового эфира таксола. В другом предпочтительном варианте 2'-0-ацилкислые таксолы, такой как 2'-сукцинил таксол и 2'-глутарилтаксол вступают в новую реакцию с тетрабутиламмониевой солью таурина (аминоэтилсульфоновой кислоты) с образованием солей сульфоалкиламина и 2'-0-ацилкислого таксола. Другой предпочтительный вариант включает взаимодействие солей аминосульфокислот с янтарным или глутаровым ангидридом с последующим взаимодействием полученного продукта с таксолом с образованием производных сульфоалкиламина 2'-0-ацилкислого таксола. Еще в одном способе осуществления настоящего изобретения получены этиленгликолевые производные 2'-0-ацилкислых таксолов. Эти соединения отличаются высокой растворимостью в воде и демонстрируют противолейкемическую, противоопухолевую и/или противораковую активность.

Итак, первоочередная цель настоящего изобретения это получение водорастворимых производных таксола, обладающих высокой биоактивностью и стабильностью.

Следующая цель настоящего изобретения это создание простого и недорого способа получения 2'-акрилоилтаксолов и солей их сульфопроизводных.

Еще одна цель это получение 2'-0-ацилкислых таксолов и их солей с сульфоалкиламинами.

Кроме того имеется цель заключающаяся в создании простого и недорого способа получения сульфоалкиламиновых производных 2'-0-ацилкислых таксолов.

Дальнейшая цель настоящего изобретения состоит в получении гидроксиалкилокси производных 2'-0-ацилкислого таксола.

На фиг. 1 представлена структура таксола и его ЯМР-спектр, пики на котором отмечены в соответствии с теми частями структуры таксола, к которым они относятся.

Таксол был получен в Национальном Раковом Институте. ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР спектры были сняты на спектрометре Брукера марки 270SY 270 Мгц; 2D-ЯМР спектры были получены на спектрометре Брукера WP 200 на 200 Мгц. Химические сдвиги все записаны в м. д. относительно тетраметилсилана (ТМС) в случае ¹Н-ЯМР, а в случае ¹³С-ЯМР химические сдвиги относительно сдвига хлороформа при 77.0 или относительно ТМС при 0 м.д. Спектры образцов, как правило, записывали в растворе CDCl₃ или CD₃OD при комнатной температуре. Масс-спектры были получены на масс-спектрометре, связанном с газовым хроматографом (хромасс) марки Finnegan-МАТ 112 и масс-спектрометре марки 7070, оборудованном датчиком, ПАБ-источником и ЕI/CI источником. ЯМР и масс-спектрометрические данные весьма полезны в исследовании таксола и его производных наряду с данными других методов, таких как ИК- и УФ-спектроскопия, обеспечивающих дополнительную информацию о конформационной структуре.

Для снятия ИК-спектров, а также УФ-спектров были использованы спектрофотометры фирмы марки Perkin-Elmer 710В и Perkin-Elmer 330, а также в работе был использован поляриметр фирмы Perkin-Elmer ВЭЖХ (высокоэффективная газожидкостная хроматография) образцов осуществлялась на аппаратуре, в состав которой входят насос марки Waters M 6000, с Rheodyne инжекторным клапаном, колонкой Waters Radial-Pak RLM-100 RP-8 УФ детектором марки Waters 440.

2'-акрилоилтаксолы.

Натриевая соль 2'-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола была получена при взаимодействии таксола с акриловой кислотой с последующим проведением реакции Михаэлиса с добавлением бисульфит-иона. Реакцию сочетания таксола с акриловой кислотой проводили в присутствии изобутилхлороформиата. После очистки с использованием флеш-хроматографии (силикагель, элюентдихлорметан: этилацетат= 1: 1) получили 2'-акрилоилтаксол с 94% выходом. Используя метод тонкослойной хроматографии, установили, что реакция сочетания акриловой кислоты с таксолом проходит на 90% за 15 ч при 60^оС. Дизамещенные С-2', С-7 продукты не образуются после продленного времени реакции. Н-ЯМР спектр 2'-акрилоилтаксола показал, что сигнал С-2' протона сдвинут до 5.46 м.д. (d, J= 3) от 4.73 м.д. для протонов С-2' незамещенного таксола. Сдвиг протонов вызван ацилированием С-2' гидроксильной группы. Поскольку сигнал для С-7 протонов при 4.43 м.д. остался практически без изменения в сравнении с С-7 протонами незамещенного таксола, сигнал которых находится при 4.38 м.д. то сделан вывод о том, что реакция в положении С-7 не происходит. Масс-спектроскопия показала молекулярную массу 907 с пиками при м/з 930 (MNa⁺) и 908 (МН⁺).

Затем 2'-акрилоилтаксол запускают в реакцию Михаэлиса с бисульфитом натрия. Бисульфит натрия используют потому, что он представляет собой хороший нуклеофил и потому, что он создает подходящее для реакции значение рН. ЯМР спектр протонов продукта реакции присоединения Михаэлиса отличался от ЯМР спектра 2'-акриолоилтаксола. В спектре продукта присоединения Михаэлиса отсутствуют сигналы виниловых протонов, характерных для спектра 2'-акрилоилтаксола. Однако, наличие двух триплетов 3.14 м.д. и 2.93 м.д. указывает на появление двух новых метиленовых групп в продукте присоединения Михаэлиса. Масс-спектроскопия свидетельствует о молекулярной массе 1011 с пиками при м/з 1034 (МN⁺) и 1012 (МН⁺).

Была предпринята попытка получения натриевой соли 2'-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси] таксола в одностадийном процессе путем сочетания таксола с 3-гидрокси-3-оксопропилсульфокислотой в присутствии пиридина и дициклогесилкарбодиимида (ДЦК), но продукт не был получен. Это возможно связано с тем, что сульфонильная группа атакует промежуточный продукт реакции.

Производные 2'-0-ацил-кислого таксола.

Натриевая соль 2'-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил]-окси}таксола и натриевая соль 2'-{[4-(3-сульфопропил)амино-1,4-диоксобутил]окси}таксола были по- лучены с высокими выходами при взаимодействии 2'-сукцинилтаксола с 2-аминоэтилсульфокислотой (таурином) и, соответственно, с солью тетрабутиламмония и 3-аминопропилсульфокислоты. Отметим, что для того, чтобы сделать аминоалкилсульфокислоты растворимыми в органических растворителях, можно использовать любые соли четвертичного аммония. 2'-сукцинилтаксол получают в результате взаимодействия ангидрида янтарной кислоты с таксолом, осуществляемого при комнатной температуре в течение 2 часов в пиридине или ДМП. Сравнение ЯМР спектров таксола и 2'-сукцинилтаксола показывает наличие сдвига С-2 протонов к 5.51 м.д. а сукцинильные протоны дают мультиплетный сигнал с центром примерно при 2.6. м.д.

Затем 2'-сукцинилтаксол запускают в реакцию с солью тетрабутиламмония и таурина в присутствии агента сочетания изобутилхлорформиата. После выделения с использованием флеш-хроматографии (силикагель, элюент-дихлорметан:этанол 7: 1) получают со 100% выходом соль 2'-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил] окси} таксола и тетрабутиламмония. За два часа, как показывает мониторинг с использованием ТСХ, реакция завершается только на 80% Для 100% выхода нужно продлить время реакции. На ЯМР спектре сульфоалкиламин-производного 2'-сукцинилтаксола имеется два новых пика при 3.6 м.д. и 2,94 м.д. характерных для двух метиленовых групп. Натриевую соль 2'-{[4-(2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола получили, пропустив соль тетрабутиламмония и 2'-{ [4-((2-таксола получили, пропустив соль тетрабутиламмония и 2'-{ [4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола через ионнообменную колонку Dow ex 50 (Na+ форма). В ЯМР спектре натриевой соли отсутствуют сигналы, характерные для бутильной группы. Масс-спектроскопия свидетельствует о молекулярной массе 1082 в присутствии пиков м/з 1105 (MNa⁺) и 1083 (MH⁺).

Натриевая соль 2'-{ [4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил] -окси} таксола была получена согласно той же методике, по которой была получена натриевая соль сульфоэтиламонотаксола: однако, вместо таурина была использована соль тетрабутиламмония и 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты. ЯМР-спектр подтвердил образование 3-сульфопропиламинопроизводного; новые пики при 3.28 м.д. 1,98 м.д. и 2,87 м.д. представляют три дополнительные метиленовые группы, образующие пропильную группировку. Натриевая соль, образуемая производный сульфопропиламино-сукцинил таксола была получена в результате пропускания соли тетрабутиламмония через ионнообменную колонку с Доwex 50 (Na⁺форма). Масс-спектроскопия натриевой соли сульфопропиламиносукцинилтаксола показала молекулярную массу 1096 в присутствии пиков при м/з 1119 (MNa⁺) и 1097 (MH⁺).

Также предполагается, что между аминосульфокислотой и ангидридом или двуосновной кислотой может быть образована амидная связь, и что полученный продукт может взаимодействовать с таксолом с образованием водорастворимых производных 2'-0-ацилкислого таксола. Предпочтительно, когда аминосульфокислота представлена в виде растворимой в органическом растворителе соли.

Попытки синтезировать натриевую соль 2'-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобу- тил] окси} таксола непосредственно из 2'-сукцинилтаксола в одну стадию оказались безуспешны. 2'-сукцинилтаксол соединили с триэтаноламином, изобутилхлорформиатом, тетрагидрофураном (ТГФ), таурином, ДМФ и водой. Однако, вода, необходимая для солюбилизации таурина, вызывала гидролиз смешанного промежуточного ангидрида и, в результате образовывались исходные вещества. В тех случаях, когда были использованы неводные условия, реакция также не шла, поскольку таурин не растворялся в органических растворителях.

Путем соединения 2-сукцинилтаксола, триэтиламина, изобутилхлороформиата, ТГФ, 2-тиоэтиламина и дихлорметана был получен 2'-{[4-((2-этантиол)амино)-1,4-диоксобутил] окси} таксол с низким выходом. Попытка окислить тиол в желаемую сульфокислоту в присутствии мета-хлорпербензойной кислоты (МХПБК) и дихлорметана не привела к образованию заметного количества требуемого производного сульфоалкиламиносукцинилтаксола.

Этиленгликолевые производные сукцинилтаксола.

2'-{[4-(гидроксиэтил)окси)-1,4-дио- ксобутил]окси}таксол был получен при взаимодействии сукцинилтаксола с этиленгликолем. Производное гидроксиэтилоксисукцинилтаксола было получено с 83% выходом через 20 ч выдерживания реакционной смеси при комнатной температуре. Производное гидроксиэтилоксисукцинилтаксола было синтезировано для того, чтобы превратить вторичную гидроксильную группу в положении 2' в таксоле в первичную гидроксильную группу; предполагается, что гидроксильная группа в продукте более реакционноспособна нежели гидроксильная группа в таксоле, а это дает возможность получения других производных таксола в мягких условиях. ЯМР-спектр этиленгликолевого производного свидетельствует о наличии новых пиков при 3.7 м.д. и 2.1 м.д. относящихся к двум новым метиленовым группам гидроксиэтилокси производного. Масс-спектроскопия дала молекулярную массу 997 при пиках с м/з 1020 (MNа⁺) и 998 (MNa⁺).

Формиат 2'-γ -аминобутирилтаксола.

Формиат 2'-γ -аминобутирилтаксола был синтезирован путем смешения таксола с N-карбобензилокси (CBZ)-γ -аминомасляной кислотой с последующим отщеплением защитной группы от амина. Таксол реагирует с N-CBZ-γ-аминомасляной кислотой в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦК), используемого как агента реакции сочетания. После очистки методом препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле с элюентом гексан:этилацетат 3:2 был получен с 75% выходом 2'-N-CBZ- -аминобутирилтаксол. При добавлении воды ДЦК разлагается с образованием дициклогексилмочевины, так, что удалить избыток реагентов, используемых для проведения реакции, не представляет проблемы. Большая часть дициклогексилмочевины и N-СВZ-γ-аминомасляной кислоты удалялась путем фильтрации. Удаление защитной группы 2'-N-CBZ-γ-аминобутирилтаксола проводили, использовав в качестве источника водорода муравьиную кислоту и 5% Pd/C в качестве катализатора. Муравьиная кислота обеспечивает активную форму водорода для удаления CBZ защитной группы, а также приводит к обpазованию соли формиата производного 2'-γ-аминобутирилтаксола, которая более растворима в воде нежели нейтральная форма. ЯМР-спектр подтверждает образование формиата 2'-γ-аминобутирилтаксола. Однако, это соединение нестабильно в метанольном растворе и распадается через несколько часов с образованием таксола. Эта нестабильность привела к тому, что формиат 2'-γ-аминобутирил таксола далее не рассматривался в качестве пролекарственной формы таксола.

Растворимость в воде.

Растворимость в воде всех соединений определяли путем вычисления коэффициента распределения между октанолом-1 и водой. Для определения растворимости использовали октанол, насыщенный дистиллированной водой и дистиллированную воду, насыщенную октанолом. Результаты проведения эксперимента по определению коэффициента распределения показали, что натриевая соль 2'-[(3-сульфо-1-оксо-пропил)окси] таксола в 210 раз более растворима в воде нежели сам таксол, натриевая соль 2'-{[4-((2-сульфоэтил)амино-1,4-диоксобу- тил]окси таксола в 191 раз более растворима в воде, чем таксол, и натриевая соль 2'-{ [4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксо- бутил] окси}таксол в 118 раз более растворима в воде, чем таксол.

Следующие, не ограничивающие данное изобретение, примеры демонстрируют методы специфического синтеза водорастворимых производных таксола настоящего изобретения. Все технические и научные термины, использованные здесь, понятны любому специалисту в данной области. Другие методы и материалы, подобные или эквивалентные использованным, могут применяться в процессе получения или исследования соединений настоящего изобретения.

П р и м е р 1. В 25 мл круглодонной колбе в атмосфере аргона растворили в 5 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ) 50 мкл триэтиламина и 30 мкл акриловой кислоты. После охлаждения раствора до 0^оС в ледяной бане к нему добавили 50 мкл изобутилхлороформиата, и реакционную смесь нагрели до комнатной температуры в течение 15 мин. Затем к реакционной смеси добавили 100 миллиграмм таксола и реакционную смесь перемешивали в течение 15 ч при 60^оС, проверяя ход реакции методом ТСХ с элюентом дихлорометан:этилацетат=2:1. В процессе реакции выпал в осадок гидрохлорид триэтиламина, который удалили путем фильтрации. Растворитель отогнали в вакууме, и продукт очистили методом флеш-хроматографии, использовав силикагель и в качестве элюента дихзлорметан: этилацетат=1:1. Получили в результате 100 мг (94% выход) 2'-акрилоилтаксола

Акрилоильная группировка 2'-акрилоилтаксола вследствие электрофильности β-алкенового углеродного атома, являющегося местом нуклеофильной атаки, представляет хороший акцептор Михаэлиса. Таким образом взаимодействие 2'-акрилоилтаксола с подходящими нуклеофилами будет приводить к образованию продуктов присоединения Михаэлиса в положение 2'-таксола. В примерно 3 мл перегнанного изопропанола растворили 85 мг 2'-акрилоилтаксола, а 84 мг метабисульфита натрия растворили в примерно 1 мл дистиллированной воды. Два раствора смешали вместе, и по- лученную реакционную смесь перемешивали при 60^оС в течение 15 ч. Мониторинг реакции осуществляли методом ТСХ с использованием в качестве элюента дихлрометан:метанол 10:1. Затем растворители отогнали в вакууме, а воду удалили в виде азеотропной смеси с ацетонитрилом. Для очистки продукта использовали флеш-хроматографию, применив в качестве элюента смесь дихлорметан: изопропанол=2:1. В результате получили 83,5 мг (83,5% ) натриевой соли 2'-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола, формула которого представлена

Были сняты спектры ЯМР, УФ, ИК(Квr) масс-спектры образцов продукта, а также определены оптическое вращение и точка плавления продукта. Эти данные приведены в табл. 1 и 2.

Предполагается, что использованная акриловая кислота может быть заменена другими представителями семейства акриловой кислоты, которые также являются хорошими акцепторами Михаэлиса, катионом может служить другой щелочной металл или аммонийная группа, такая как тетрабутиламмоний. Очевидно также, что солеобразующая группировка может быть замещена Н. Биологические исследования натриевой соли 2'-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола показали, что соединение в дополнение к улучшенной растворимости обладает биоактивностью.

П р и м е р 2. В 25 мл колбе, снабженной магнитной мешалкой, соединили 206 мг таксола, 2,9 мг 4-диметиламинопиридина (ДМАП) и 49 мг ангидрида янтарной кислоты. К смеси добавили 0,2 мл сухого пиридина, и полученный раствор перемешивали в течение 2,5 ч при комнатной температуре. После этого добавили несколько миллилитров воды, при этом образовался белый осадок в непрозрачной суспензии. Для экстрагирования продуктов добавили несколько миллилитров дихлорометана. Добавление 1 мл концентрированной HCl вызывает исчезновение белой водной суспензии. Для осушения слоя дихлорметана использовали сульфат натрия, который затем отфильтровывают и упаривают. Тонкослойная хроматография с использованием в качестве элюента -СН₂Сl₂:MeOH=7:1 показала лишь следы оставшегося пиридина. Оставшийся пиридин удалили путем циклического добавления гептана с последующей отгонкой; в результате получили 218 мг сукцинилтаксола, что составляет 96,6% выход. ЯМР спектр продукта соответствует данным, приведенным в литературе. Структура была также подтверждена с использованием 2D-ЯМР спектроскопии НОМО СОSY (моноядерная корреляционная спектроскопия).

Таурин, Н₂NCH₂CH₂SO₃H высокополярное соединение, в основном нерастворим в органических растворителях, таких как хлороформ. Производные таурина и органических кислот ранее получали путем обработки хлорангидрида кислоты таурином в условиях Шоттен-Баумана (т. е. в основном водном или водно-этанольном растворе). Этот метод неприемлем для таксола, поскольку он легко гидролизуется в основание, и таким образом распадается в условиях реакции. Для того, чтобы разрешить эту проблему, был разработан новый метод, который включал добавление таурина к гидроксиду тетрабутиламмония, с последующим удалением непрореагировавших материалов и упариванием. Это приводит к образованию соли тетрабутиламмония и таурина вместо натриевой соли, использованной в прототипе. Соль тетрабутиламмония и таурина растворима в органических растворителях, таких как дихлорметан. Таким образом, 2'-сукцинилтаксол в ТГФ и триэтиламине может вступать в реакцию с изобутилхлороформиатом и солью тетрабутиламмония и таурина с образованием соли тетрабутиламмония и тауринпроизводного таксола. Отметим, что промежуточный продукт представляет собой смешанный ангидрид, который гидролизуется в исходное соединение в присутствии воды.

Для растворения 250 мг таурина в колбе был использован минимальный объем дистиллированной воды и к этому раствору добавили 1 мл водного гидроксида тетрабутиламмония. Этот раствор перемешивали при комнатной температуре в течение часа, а затем упарили до сухости. Сухой продукт растворили в примерно 15 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ), отфильтровали, и фильтрат упарили до сухости. Сухой продукт затем растворили в 2 мл сухого ТГФ.

Получение соли тетрабутиламмония и 2'-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобу- тил]окси}таксола.

Раствор 2'-сукцинилтаксола, полученный растворением 122 мг 2'-сукцинилтаксола в примерно 4 мл сухого тетрагидрофурана (ТГФ) и 50 мкл триэтламина, охладили до примерно 0^оС. Раствор затем соединили с 50 мкл изобутилхлороформиата, реакционную смесь нагрели до комнатной температуры в течение 15 мин и добавили 0,5 мл раствора соли тетрабутиламмония и таурина в ТГФ (эквивалентно 91 мг соли тетрабутиламмония и таурина). Вслед за добавлением соли тетрабутиламмония и таурина реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч, мониторинг реакции осуществляли, используя ТСХ с применением в качестве элюента Этилацетат:метиловый спирт=2:1. Реакционную смесь затем отфильтровали, и растворители упарили. После очистки методом флешхроматографии на силикагеле (300х15 мм, элюент СН₂Cl₂:MeOH=7:1) получили 168 мг (100% выход) соли тетрабутиламмония и 2'-{[4-((2-сульфоэтил)-амино)-1,4-диоксобутил]окси} таксола.

Тетрабутиламмониевую соль превратили в натриевую соль, поместив 160 мг соли тетрабутиламмония в склянку, заполненную ионоообменой смолой марки Dowex 50 в Na⁺ форме (примерно 3 мл смолы на 3 мл деионизованной воды). После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 1,5 ч смесь затем пропустили через небольшую колонку со смолой, содержащей 2 мл смолы в Na⁺ форме, используя в качестве растворителя деионизованную воду.

Раствор превратили в азеотроп путем добавления ацетонитрила, в результате получили 122 мг натриевой соли 2'-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола

Параметры, характеризующие это соединение, приведены ниже в табл. 3, а данные химических сдвигов ЯМР-спектра представлены в табл. 4.

Отметим, что соль тетрабутиламмония и таурина может с легкостью вступать в реакцию с другими 2'-0-ацилкислыми таксолами, например, 2'-глутарилтаксолом. 2'-глутарилтаксол можно легко получить, взяв вместо ангидрида янтарной кислоты глутаровый ангидрид. Полагают, что другие члены ряда щавелевой кислоты и другие ангидриды могут взаимодействовать с таксолом примерно также, как и описанные соединения. Отметим, что в некоторых случаях предпочтительнее использовать 2'-глутарилтаксол нежели другие 2'-0-ацилкислые таксолы. Далее, предполагается, что группировка, образующая соль, может быть замещена на Н или любой щелочной или щелочноземельный металл.

П р и м е р 3. К раствору 280 мг 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты в дистиллированной воде добавили 1 мл гидроксида тетрабутиламмония. Раствор перемешивали в течение одного часа, а затем упарили до сухости. Продукты растворили в примерно 15 мл ТГФ и отфильтровали избыток 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты. Фильтрат упарили и вновь растворили в 2 мл сухого ТГФ для проведения последующих реакций. Приготовили раствор, содержащий 130 мг 2'-сукцинилтаксола и 50 мкл триэтиламина в 4 мл сухого ТГФ и охладили его до 0^оС. Аликвоту изобутилхлороформиата в 50 мкл добавили в реакционную смесь, и полученный раствор нагрели до комнатной температуры примерно за 15 мин. Затем добавили 0,6 мл раствора соли тетрабутиламмония и 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты в ТГФ (эквивалентно 108 мг соли тетрабутиламмония и 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты). Реакционнную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3-х ч, мониторинг реакции осуществляли методом ТСХ, используя в качестве элюента-этилацетат:метанол=4:1. Затем реакционный раствор отфильтровали и упарили, продукт реакции очистили методом флеш-хроматографии на силикагеле (300 мм х 15 мм), использовав в качестве элюента дихлорметан: метанол= 10: 1. Выход 128 мг (71,2%) гомогенной соли тетрабутиламмония и таксола.

Соль тетрабутиламмония превратили в натриевую соль, поместив 120 мг соли тетрабутиламмония и 2'-{ [4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил]окси} таксола в склянку, заполненную ионообменной смолой Dowex 50 в Na⁺ форме (примерно 3 мл смолы на 3 мл деионизованной воды). По- лученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, а затем пропустили через колонку со смолой, содержащей примерно 2 мл смолы в Na+ форме, используя в качестве растворителя деиозованную воду. Раствор азеотропировали ацетонитрилом, получили в результате 84 мг (79,3%) натриевой соли 2'-{[4-((3-сульфопропил)-амино)-1,4-диоксобутил]окси}таксола

Данные, характеризующие этот препарат, представлены в табл. 5, а химические сдвиги ЯМР спектра приведены в табл. 6.

Отметим, что натрий может быть замещен на Н или щелочной металл, или щелочно-земельный металл, а также на аммонийные группы.

П р и м е р 4. В токе аргона приготовили раствор, содержащий 26 мг 2'-сукцинилтаксола и 20 мкл триэтиламина в 2 мл сухого тетрагидрофурана. Полученный раствор охладили до 0^оС и добавили к нему 10 мкл изобутилхлороформиата, после чего реакционную смесь нагрели до комнатной температуры в течение 15 мин. После стадии нагрева к раствору добавили 4 мкл этиленгликоля, после чего реакционную смесь перемешивали в течение 15 ч при комнатной температуре, мониторинг реакции осуществляли методом ТСХ, используя в качестве элюента дихлорметан:этилацетат=1:1. Реакцию остановили, отфильтровав осадок и упарив растворитель. Сырой продукт очистили методом тонкослойной препаративной хроматографии (элюент дихлорметан:этилацетат=1:3), в результате получили 25 мг (83,3%) 2'-{[4-(2-гидроксиэтил)окси)-1,4-диоксобутил]окси} таксола

Данные, характеризующие препарат, представлены в табл. 7, а химические сдвиги ЯМР спектра в табл. 8.

П р и м е р 5. В 10 мл колбу поместили 20 мг таксола, 40 мг дициклогесилкарбодиимида и 20 мг N-карбобензил-γ -аминомасляной кислоты. Реагенты растворили в 4 мл сухого ацетонитрила (сухой ацетонитрил получили, пропустив ацетонитрил через активированный оксид алюминия). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 30 ч, раствор отфильтровали, удалив выпавшую в осадок дициклогексилмочевину. Растворитель затем отогнали в вакууме, а сырые продукты разделили, использовав препаративную ТСХ (элюент-гексан: этилцетат= 45: 55). В результате получили 19,1 мг (75,9%) чистого 2'-N-CBZ-γ -аминобутирилтаксола.

Формиат 2-γ -аминобутирилтаксола синтезировали путем добавления 6 мг 2'-N-CBZ-γ -аминобутирилтаксола к 1,5 мл метанола. К растворенному производному CBZ-таксола добавили 1 мл муравьиной кислоты для образования 40% раствора-муравьиная кислота/метанол. Для проведения реакции к раствору добавили 5 мг 5% Pd/C и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 26 ч. Реакцию остановили, отфильтровав Pd/C и упарив в вакууме фильтрат. В результате получили формиат 2-γ -аминобутирилтаксола

Cнятый через несколько часов протонный спектр ЯМР и данные тонкослойной хроматографии (элюент дихлорметан:этилацетат:метанол 2:1:0,02) показали, что 2- γ -аминобутирилтаксол разложился с образованием таксола.

П р и м е р 6. Растворимость таксола определяли, растворяя 1,6 мг таксола в 10 мл дистиллированной воды, насыщенной октанолом-1 в делительной воронке, после чего добавляли 10 мл октанола-1, насыщенного дистиллированной водой. Воронку встряхивали, а затем оставили стоять примерно в течение 30 мин до разделения водной и органической фаз. После этого провели определение поглощения в УФ-области спектра при 228 нм водного слоя и/или октанольного слоя, при измерении поглощения октанольного слоя его предварительно разбавили в 5 раз.

Следуя той же самой процедуре, которая представлена выше, и, использовав 0,8 мг натриевой соли 2'-[(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола, 0,8 мг натриевой соли 2'-{[4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил] окси}таксола и 0,7 мг натриевой соли 2'-{[4-(34сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил] оксо}таксола, определили растворимость в воде этих соединений относительно таксола; полученные результаты представлены ниже в табл. 9.

Как видно из данных табл. 9, наивысшей растворимостью обладает производное 2'-акрилоилтаксола, которая в 210 раз превышает растворимость собственно таксола. Отметим, что таурин производное 2'-сукцинилтаксола обладает значительно большей растворимостью в воде, чем производное 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты и 2'-сукцинилтаксола; однако, растворимость обоих соединений более чем в 100 раз превышает растворимость таксола. Пониженная растворимость производного 3-амино-1-сульфопропионовой кислоты и 2'-сукцинилтаксола возможно вызвана удлинением алкильной цепочки.

П р и м е р 7. Хотя из вышеприведенного примера 1 легко видны другие члены ряда акриловых кислот, такие, но не только такие, как акриловая кислота, замещенная в α и/или β -положение алкилами, алкенами, арилами и циклическими соединениями, однако, были получены дополнительные акрилокислотные производные таксола, чтобы убедительно доказать, что другие члены ряда акриловых кислот могут реагировать с таксолом аналогичным образом, как акриловая кислота.

Таксол (22 мг) в высушенной колбе, продутой аргоном, обрабатывали при 0^оС одним миллитром раствоpа, приготовленного из дициклогексилкарбодиимида (ДСС, 39,9 мг), транс-цинамовой кислоты (16,0 мг) и сухого ацетонитрила (примерно 4,0 мл). Было добавлено каталитическое количество диметиламинопироидина (ДМАР); реакцию контролировали с помощью тонкослойной хроматографии. Через 15 мин была добавлена вторая порция раствора реагента в количестве 1 мл. Примерно через полчаса смесь нагрели до 25^оС и ставили стоять в течение одного часа. Реакция дала 10,4 мг 2'-транс-циннамоилтаксола (выход примерно 65%). ЯМР-спектр-2'-транс-циннамоилтаксола представлен на фиг. 2.

П р и м е р 8. Таксол (23 мг) в высушенной колбе, продутой аргоном, обрабатывали при 0^оС одним мл раствора, приготовленного из 43 мг ДСС, 10,0 мг кротоновой кислоты и 4 мл сухого ацетонитрила. Было добавлено каталитическое количество диметиламинопиридина (ДМАР); реакцию контролировали с помощью тонкослойной хроматографии. Через 15 мин была добавлена вторая порция раствора реагента в количестве 1 мл и примерно через полчаса смесь нагрели до 25^оС и оставили стоять в течение 1 ч. Очистка и анализ подтвердили синтез 2'-транс-кротонилтаксола (выход 45%). ЯМР-спектр 2'-транскротонилтаксола представлен на фиг. 3.

П р и м е р 9. Следуя методике, описанной в примере 1, таксол реакцией с подходящими кислотами превращают в 2'-ацилтаксолы, показанные в табл. 10. Установленная точка плавления приведена для данных аналогов.

Настоящее изобретение раскрывает новые производные таксола с повышенной растворимостью в воде по сравнению с собственно таксолом. Эти производные стабильны в течение длительного периода времени, в отличие от некоторых полученных ранее производных таксола с повышенной растворимостью в воде. Эти соединения получают согласно новым способам, которые характеризуются высокими выходами в основном чистых продуктов. Данные характеристик и ЯМР-спектры подтверждают структуру и свойства производных таксола настоящего изобретения. Кроме того, обладая повышенной растворимостью в воде и улучшенной стабильностью, эти соединения сохраняют биологическую активность и их можно использовать в качестве пролекарственных форм, обладающих противоопухолевой, противолейкемической и противораковой активностью.

Рассматриваемые варианты производных таксола, растворимых в воде, включают 2'-акрилоил и 2'-0-ацилкислые производные таксола, которые имеют один или более заместителей в боковой цепи или в кольце, замещенных безразличной группой (т. е. группой, которая практически не влияет на требуемые свойства производных таксола настоящего изобретения) такой как -Н, ОН, -OR, -NR. -A, или0, замещаемой на другую безразличную группу.

Из выше приведенной прописи следует, что возможны различные варианты и модификации настоящего изобретения. Следует понимать, что изобретение может быть осуществлено способом, отличным от приведенных в конкретных описаниях.

Использование: в медицине в качестве водорастворимого противоопухолевого средства. Сущность изобретения: продуктпроизводные сульфированного 2′ -акрилоилтаксола и сульфированного 2′ -о-ацилкислого таксола, которые обладают улучшенной растворимостью в воде и стабильностью в одновременным сохранением биоактивности. В частности, получена натриевая соль 2′ [(3-сульфо-1-оксопропил)окси]таксола при взаимодействии таксола с акриловой кислоты и с последующей реакцией 2′ -акрилоилтаксола с бисульфито согласно реакции Михаэлиса. При взаимодействии 2′ -сукцинилтаксола с солями тетрабутиламмония и таурина и 3-аминопропилсульфокислотой, соответственно, с последующим обменом аммония на натрий были синтезированы натриевые соли 2′ [4-((2-сульфоэтил)амино)-1,4-диоксобутил] окси таксола и 2′[4-((3-сульфопропил)амино)-1,4-диоксобутил]окси} таксола. При взаимодействии гликоля с 2′ -о-ацилкислым таксолом были синтезированы гликолевые производные 2′ -о-ацилкислых таксолов, обладающие улучшенной растворимостью в воде. 2 с. и 6 з.п.ф-лы, 3 ил. 10 табл.

1. Производные таксола общей формулы

где X водород, C₁ C₆-алкил или фенил;
Y и Z водород или C₁ C₆-алкил. 2. Водорастворимые производные таксола общей формулы

где W, X, Y, и Z водород,
M щелочной металл. 3. Соединение по п.2, отличающееся тем, что оно обладает большей растворимостью в воде, чем таксол, и проявляет по крайней мере некоторую противоопухолевую активность таксола. 4. Производные таксола по п.1 общей формулы

где X и Y имеют указанные значения. 5. Соединения по п.4, отличающаяся тем, что X и Y водород. 6. Водорастворимые производные таксола по п.2 общей формулы

где X водород;
Y водород;
M щелочной металл. 7. Соединение по п.6, отличающееся тем, что X и Y водород, M натрий. 8. Соединение по п.6, отличающееся тем, что оно обладает большей растворимостью в воде, чем таксол, и проявляет по крайней мере некоторую противоопухолевую активность таксола.