СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/42 A61K39/245 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано для получения диагностикумов к вирусу болезни Ауески.

Болезнь Ауески вирусная, остропротекающая болезнь сельскохозяйственных животных всех видов, пушных зверей и грызунов.

Диагноз на болезнь Ауески ставят на основании эпизоотической ситуации хозяйств, клинических признаков, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований, включающих выделение и обнаружение вируса. Основные методы лабораторной диагностики: выделение вируса, прямая и непрямая иммунофлюоресценция, РДП, радиоиммунологический метод, РН, РСК, ИФМ и биопроба. Диагноз на болезнь Ауески ставят в том случае, если видовая принадлежность вируса, выделенного в культуре клеток, подтверждена в иммунохимической реакции.

Для идентификации вируса болезни Ауески в реакции нейтрализации (РН) используют гипериммунные сыворотки свиней, которые получают инокуляцией взрослым свиньям с 2-недельным интервалом вируса болезни Ауески в нарастающих дозах (50-100 мл) с последующей инъекцией двух таких же доз вируса внутривенно. Кровь для получения сыворотки берут через 2 недели после последней иммунизации (Сюрин В. Н. и др. Диагностика вирусных болезней животных. М. Агропромиздат, 1991, с.71-90).

Недостатки данного способа состоят в его длительности и низкой специфической активности препарата. Сыворотка, полученная данным способом, в разведении 1:90 нейтрализует лишь 1000-3160 ТЦД₅₀ вируса.

Существует мнение исследователей, что использовать кроликов для получения гипериммунных сывороток к вирусу болезни Ауески нельзя, так как они очень чувствительны к этому возбудителю.

Известен способ получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески, включающий 2-кратную иммунизацию кроликов с интервалом 5 недель очищенным и инактивированным формалином специфическим антигеном с неполным адъювантом Фрейнда, отбор крови через 3 недели после последней иммунизации и последующее отделение целевого продукта (Sorensen K.J. Lei J.C. Aujeszky's disease: blocking Elisa for the detection of serum antibodies, J. Virol. Meth. 1986, 13, 171-181).

Недостаток способа длительность процедуры.

Известен способ получения диагностической сыворотки против вируса болезни Ауески, включающий 4-кратную иммунизацию кроликов с интервалом 2 недели очищенным, концентрированным в 200 раз ультрацентрифугированием и инактивированным этиленимином специфическим антигеном, репродуцированным в культуре клеток РК-15, с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, отбор крови и последующее отделение целевого продукта (Kardi V. Szegletes E. Perenyi T. Pergel J. Smal Z. Sandwich enzyme linkeg immunosorbent assay (ELISA) for measuring the concentration of, and detection of antibodies to Aujeszky's disease virus. Acta Vet. Hung. 1990, 38, 4, 299-309).

Этот способ принят за прототип как наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату при использовании.

Основной недостаток способа-прототипа длительность процедуры. Процесс длится более 8 недель.

Цель изобретения разработка способа получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески, позволяющего ускорить процесс получения целевого продукта и снизить затраты на его получение.

Цель достигается тем, что в известном способе получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески, включающем многократную иммунизацию кроликов эмульсией, содержащей в равном соотношении очищенный, концентрированный специфический антиген, репродуцированный в культуре клеток, и масляный адъювант, отбор крови с последующим отделением целевого продукта, в соответствии с изобретением первую инъекцию указанного препарата проводят в межпальцевые пространства задних конечностей кроликов в дозе 2 мл, вторую на 8-10 день после первой в каждый подколенный узел по 1 мл, третью через 19-25 дней после первой внутримышечно по 2 мл, а отбор крови осуществляют через 29-35 дн после начала иммунизации.

Для изготовления эмульсии используют очищенный концентрированный инактивированный антиген вируса болезни Ауески с активностью в РСК 1:16-1:256. Антиген для иммунизации готовят из вируса, репродуцированного в культуре клеток.

Масляный адъювант, используемый в составе эмульсии, содержит масляную основу и эмульгатор при следующем соотношении компонентов, мас. масляная основа 85, эмульгатор 15, при этом в качестве масляной основы можно использовать вазелиновое масло, парфюмерное, вакцинное, синтетическое, минеральное масло для противоящурных биопрепаратов, а в качестве эмульгатора безводный ланолин (Инструкция по изготовлению и контролю эмульсионной вакцины против ящура О₁ для свиней. Утверждена ГУВ МСХ 24.04.84).

По сравнению с прототипом предлагаемый способ отличается тем, что первую инъекцию иммунизирующей эмульсии проводят в межпальцевые пространства задних конечностей в дозе 2 мл, вторую на 8-10 день после первой в каждый подколенный узел по 1 мл, третью через 19-25 дн после первой внутримышечно по 2 мл, а отбор крови осуществляют через 29-35 дн после начала иммунизации.

Указанные отличия являются существенными, так как они достаточны во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Ускорение процесса получения гипериммунных сывороток достигается за счет того, что одновременно с первой инъекцией антигена проводится фенотипическая коррекция иммунокомпетентной системы донора, обеспечивающая более интенсивный иммунохимический ответ. Она обеспечивается тем, что при введении антигена вируса болезни Ауески с адъювантом в межпальцевые пространства задних конечностей происходит коммитирование клеток памяти и гиперплазия лимфоузлов за счет интенсивности увеличения популяции антителообразующих клеток (Вершигора А.Е. Основы иммунологии. 1975, с.232).

Вторая инъекция антигена в смеси с адъювантом производится в гиперплазированные подколенные лимфоузлы и на фоне предварительной их сенсибилизации и раздражения адъювантом усиливает первоначально достигнутый иммунологический эффект. Этому же способствует и особая форма применения иммунизирующего антигена, который после эмульгирования в масляном адъюванте образует сложную липопротеиновую структуру, по физико-химическим свойствам идентичную лизосомам. Благодаря этой идентичности снижается интенсивность переваривания иммунизирующего антигена лизосомами иммунокомпетентных клеток. Известно, что чем ниже это переваривание, тем интенсивнее реализуется его антигенная информация и, следовательно, тем выраженнее иммунный ответ организма донора (Вершигора А.Е. Основы иммунологии, 1975, с.25).

Специфичность полученных сывороток в основном обеспечивается за счет того, что в качестве доноров иммунизируют кроликов, для которых не характерны болезни, свойственные свиньям, овцам, КРС, и, как следствие, не будет происходить продукция чужеродных антител. Использование инактивированного антигена позволяет избежать попадания в организм вирусов-контаминантов культур клеток. Введение донорам концентрированного антигена, эмульгированного с масляным адъювантом, позволяет значительно повысить иммунологический ответ доноров.

Использование в качестве неспецифического стимулятора иммуногенеза масляного адъюванта, а также введение больших концентраций антигена приводит к синтезу антител, относящихся в основном к IgG. Это особенно важно для иммунохимических реакций, используемых в диагностических целях, поскольку антитела этого класса характеризуются максимальной специфичностью и авидностью.

Полученные диагностические сыворотки пригодны для постановки РН, РСК, РРИД, РДП, ИФМ, а также для изготовления конъюгатов антител с маркерами.

Для постановки иммунохимических реакций использование полученной сыворотки ведет к снижению возможных ложных реакций.

Использование данного способа позволяет значительно ускорить процедуру по- лучения целевого продукта и получить гипериммунную сыворотку на 29-35 день, а также снизить ее себестоимость за счет уменьшения затрат на содержание доноров.

В случае уменьшения интервала между инъекциями удается получить гипериммунные сыворотки, но их активность на 2-3,0 лог₂ ниже, чем в предлагаемом способе.

Увеличение же срока между инъекциями не приемлемо по экономическим соображениям. К снижению себестоимости предлагаемого способа ведет также иммунизация инактивированным антигеном. В этом случае отпадает необходимость в специализированных виварных помещениях, пригодных для работы с животными, зараженными вирусом.

П р и м е р 1. Для изготовления антигена используют вирус болезни Ауески, репродуцированный в суспензионной культуре клеток ВНК-21, положительно реагирующий в РСК со специфическими сыворотками 1:4 и обладающий инфекционной активностью 8,0±0,23 ТЦД₅₀/мл. После удаления клеточного детрита в суспензию добавляют 20% (по объему) 50% стерильного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000. После тщательного перемешивания суспензию выдерживают 16-18 ч при 4^оС и затем центрифугированием отделяют осадок. Последний ресуспендируют в 1/100 исходного объема в растворе Хенкса. К полученному препарату концентрированного вируса добавляют до 0,12% (конечная концентрация) гидробромида бромэтиленимина и инкубируют при 37^оС 16 ч.

Инактивированный концентрированный антиген с активностью в РСК не менее 1:16 в равном соотношении эмульгируют с масляным адъювантом и полученную эмульсию в дозе 2 мл вводят в межпальцевые пространства задних конечностей кроликам весом 2-3 кг. Через 10 дн этот же препарат в дозе 1 мл вводят в каждый подколенный лимфоузел, а на 25 день инокулируют внутримышечно по 2 мл эмульсии. Кроликов обескровливают на 35 день после начала иммунизации и из полученной крови известным способом отделяют сыворотку.

П р и м е р 2. Подготовку иммунизирующей эмульсии и иммунизацию кроликов проводят так, как описано в примере 1.

Отличие состоит в том, что используют вирус болезни Ауески, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с инфекционной активностью 8,25±0,12 ТЦД₅₀/мл, титром в РСК 1:8, который инактивируют 0,12% димером этиленимина (конечная концентрация). При второй иммунизации антиген кроликам вводят в подколенные лимфоузлы на 8 день, внутримышечно на 19 день, а обескровливают доноров на 29 день после начала иммунизации.

П р и м е р 3. Подготовку иммунизирующей эмульсии и иммунизацию кроликов проводят так, как описано в примере 1.

Отличие состоит в том, что антиген кроликам вводят в подколенные лимфоузлы на 9 день после первой иммунизации в межпальцевые пространства задних конечностей. Через 22 дня после начала иммунизации вводят антиген внутримышечно. Обескровливают на 32 день после начала иммунизации.

В результате опытов, проведенных на кроликах, были получены гипериммунные сыворотки, активные и специфичные в РН, РСК, РРИД, РДП. Результаты этих исследований представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что предлагаемый способ позволяет получить гипериммунные сыворотки кроликов к вирусу болезни Ауески, по активности и специфичности не уступающие сывороткам, полученным способом-прототипом, но за короткий срок 29-35 дней.

Таким образом, авторами предложен способ получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески, использование которого обеспечивает по сравнению с прототипом ускорение процесса получения целевого продукта, что одновременно приводит и к снижению его себестоимости.

Предлагаемый способ найдет промышленное применение при изготовлении средств для диагностики болезни Ауески.

Использование: для получения диагностикумов к вирусу болезни Ауески. Сущность изобретения: в качестве доноров используют кроликов весом 2 3 кг, которых многократно иммунизируют эмульсией, содержащей в равном соотношении очищенный инактивированный концентрированный специфический антиген, репродуцированный в культуре клеток, и масляный адъювант, причем инъекцию проводят в межпальцевые пространства задних конечностей, вторую на 8 10 день после первой в подколенные лимфоузлы, третью через 19 25 дн после первой внутримышечно, а отбор крови осуществляют через 29 35 дн после начала иммунизации. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ, включающий многократную иммунизацию кроликов специфическим антигеном с адъютантом, отбор крови с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что первую инъекцию иммунизирующего препарата проводят в межпальцевые пространства задних конечностей, вторую через 8 10 дней после первой в подколенные лимфоузлы, третью через 19 25 дней после первой иммунизации внутримышечно, отбор крови осуществляют на 29 30 день после начала иммунизации.