СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ Российский патент 1995 года по МПК A61K39/42 A61K39/245 

Предполагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для получения диагностикумов к вирусу болезни Ауески.

Диагноз: болезнь Ауески ставят на основании эпизоотической ситуации хозяйства, клинических признаков, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований, включающих выделение и обнаружение вируса. Диагноз: болезнь Ауески ставят в том случае, если видовая принадлежность вируса, выделенного в культуре клеток, подтверждена в иммунохимической реакции. Наиболее широко используемой является реакция нейтрализации (РН). Этот метод является классическим, с которым сравнивают все остальные. Для постановки этой реакции используют гипериммунные сыворотки свиней, которые готовят инокуляцией взрослым свиньям с 2-недельным интервалом вируса болезни Ауески в нарастающих дозах (50-100 мл) с последующей инъекцией таких же доз возбудителя внутривенно. Кровь для получения сыворотки берут через 2 недели после последней иммунизации.

Антисыворотку к вирусу болезни Ауески для метки ферментом получают на поросятах 6-месячного возраста, которых вначале заражают интраназально в дозе 10^3,3 ТЦД₅₀, а через 12 недель вводят внутримышечно в 4 участка тела частично очищенный вирус, смешанный с полным адъювантом Фрейнда. Через 9 дней инъекцию повторяют. Для приготовления эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума используют гипериммунную сыворотку свиней с вируснейтрализующим титром 11,5 и 10,0 лог₂ соответственно.

Основными недостатками данных способов являются:
длительность процедуры (8-16 недель);
сложность процедуры (внутривенное и внутримозговое введение вируса);
возможность получения диагностической сыворотки, содержащей антитела к другим возбудителям циркулирующим в организме донора;
полученные сыворотки пригодны для постановки РН, РДП и иммуноферментного метода;
необходимость в специализированных виварных помещениях, пригодных для работы с животными, зараженными вирусом.

Кроме гипериммунных сывороток для диагностики болезни Ауески используют иммуноасцитическую жидкость (ИАЖ), получаемую на взрослых крысах, которых трехкратно гипериммунизируют вирус-вакциной против болезни Ауески. Асцит у гипериммунизированных животных вызывают внутрибрюшинным введением 1 мл взвеси перевиваемых клеток опухоли яичка. Однако и этот способ имеет существенные недостатки, в том числе длительность процедуры, ограничение в использовании, а также работа с клетками опухоли и сложность процедуры.

Кроликов использовать для получения антисывороток нельзя, так как они очень чувствительны к вирусу болезни Ауески. Указанные недостатки частично устранены в способе получения гипериммунных сывороток на белых крысах. Данный способ взят в качестве прототипа как наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату при использовании. Сущность способа прототипа заключается в том, что белым крысам вводят вирус вакцину из штамма ВГНКИ и БУК-628 в оптимальной дозе. В дальнейшем доноров гипериммунизируют через каждые 22 дня с использованием в качестве адъюванта витамина В₁₂.

Однако этот способ обладает рядом существенных недостатков:
длительность процесса (до 2,5 месяцев);
малый выход сыворотки крови;
использование в качестве иммунизирующего антигена вирус-вакцины болезни Ауески приводит к получению антител на вирусные контаминанты культур клеток, используемых для культивирования вирус-вакцины, как следствие, к получению ложных результатов;
трудности осуществления способа из-за агрессивности доноров сывороток;
гипериммунные сыворотки белых крыс пригодны только для поставки реакций нейтрализации и диффузионной преципитации;
использование в качестве адъюванта дорогостоящего и дефицитного витамина В₁₂.

В задачу создания предлагаемого способа входило получение диагностической сыворотки с высокой специфической активностью, пригодной для наиболее распространенных иммунохимических реакций, ускорение процесса получения целевого продукта и снижение его себестоимости.

Поставленная задача решена тем, что в известном способе получения гипериммунных сывороток, включающем многократную иммунизацию доноров специфическим антигеном с адъювантом, отбор крови с последующим отделением целевого продукта, в соответствии с изобретением в качестве доноров используют морских свинок весом 400-500 г, а иммунизацию доноров осуществляют внутримышечно эмульсией, содержащей в равном соотношении инактивированный концентрированный специфический антиген, репродуцированный в культуре клеток и масляный адъювант. Первую инъекцию проводят в бедренную группу мышц, вторую на 20-22-й день, а третью на 28-30-й день после первой, а отбор крови осуществляют на 39-40-й день после начала иммунизации.

Для изготовления эмульсии используют инактивированный концентрированный антиген вируса болезни Ауески с активностью в РСК не менее 1:16.

Масляный адъювант, используемый в составе эмульсии, содержит масляную основу и эмульгатор при следующем соотношении компонентов, мас. Масляная основа 85 Эмульгатор 15 При этом в качестве масляной основы можно использовать вазелиновое масло, парфюмерное, вакцинное, минеральное масло для противоящурных биопрепаратов, а в качестве эмульгатора безводный ланолин (Инструкция по изготовлению и контролю эмульсионной вакцины против ящура О₁ для свиней. Утверждена ГУВ МСХ 1984 ).

Предлагаемый способ от прототипа отличается тем, что для иммунизации в качестве доноров используют морских свинок весом 400-500 г. Гипериммунизацию доноров осуществляют эмульсией, содержащей равное соотношение инактивированного концентрированного антигена вируса болезни Ауески, репродуцированного в культуре клеток, и масляного адъюванта. Первую инъекцию указанного препарата проводят в бедренную группу мышц, вторую на 20-22-й день, третью на 28-30-й день после первой, отбор крови осуществляют на 39-40-й день после начала иммунизации. Указанные отличия являются существенными, так как они достаточны во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Повышение специфической активности полученных сывороток достигается за счет того, что в качестве доноров используют морских свинок, для которых не характерны болезни, обычно регистрируемые на свиньях, овцах и кроликах и, как следствие, нет и антител к их возбудителям. Использование инактивированного антигена позволяет избежать попадания в организм вирусов-контаминантов культур клеток. Введение донорам концентрированного антигена, эмульгированного с масляным адъювантом, позволяет значительно повысить иммунологический ответ доноров. Использование в качестве неспецифического стимулятора иммуногенеза масляного адъюванта, а также введение больших концентраций антигена приводит к синтезу антител, относящихся, в основном, к IgG. Это особенно важно для иммунохимических реакций, используемых для диагностических целей. Полученные диагностические сыворотки пригодны для постановки РСК, РН, РДП, ИФМ, а также для изготовления диагностических препаратов для ИФМ и ЭИА. При постановке иммунохимических реакций использование полученной сыворотки ведет к снижению возможных ложных реакций.

Использование в качестве доноров морских свинок дает возможность получить гипериммунную сыворотку на 39-40-й день и снизить ее себестоимость за счет уменьшения затрат на содержание доноров. К снижению себестоимости способа получения диагностической сыворотки ведет также иммунизация инактивированным антигеном. Отпадает необходимость в специализированных виварных помещениях, пригодных для работы с животными зараженными вирусом.

П р и м е р 1. Для изготовления антигена используют вирус болезни Ауески, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21, положительно реагирующий в РСК со специфическими сыворотками в цельном виде или в разведении до 1:4 и обладающий инфекционной активностью 7,5-8,0 ТЦД 50/мл. После удаления клеточного детрита в суспензию добавляют 20% (по объему) 50%-ного стерильного раствора полиэтиленгликоля мол.м. 6000. После тщательного перемешивания суспензию выдерживают 16-18 ч при 4^оС и затем центрифугированием отделяют осадок. Последний ресуспендируют в 1/100 исходного объема в растворе Хенкса. К полученному препарату концентрированного вируса добавляют формалин до конечной концентрации 0,2% и инкубируют при 37^оС в течение 48 ч. Для нейтрализации формальдегида в суспензию инактивированного вируса добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного формальдегида. Полученный антиген проверяют на вирулентность и активность в РСК и ИФМ.

Инактивированный концентрированный антиген с активностью в РСК не менее 1: 16 в равном соотношении эмульгируют с масляным адъювантом и полученную эмульсию вводят морским свинкам в бедренную группу мышц в объеме по 1,0 мл. Через 20-22 дня этот же препарат вводят аналогично, но в другую конечность. Третью инъекцию проводят через 28-30 дней после первой. Доноров обескровливают спустя 39-40 дней после первой иммунизации. Из полученной крови известным способом отделяют сыворотку.

П р и м е р 2. Подготовку эмульсии и иммунизацию морских свинок проводят так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что вирус репродуцируют в культуре клеток ПСГК-30, а инактивацию проводят аминоэтилэтиленимином в конечной концентрации 0,15% при температуре 26-28^оС в течение 24 ч.

П р и м е р 3. Подготовку материалов и иммунизацию морских свинок проводят так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что вирус репродуцируют в культуре клеток ППК-66.

П р и м е р 4. Подготовку материалов и иммунизацию морских свинок проводят так, как описано в примере 2. Отличие состоит в том, что вирус репродуцируют в культуре клеток IB-RS-2.

Эффективность предполагаемого способа в сравнении с прототипом подтверждена результатами многочисленных экспериментов, сведения о которых представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что сыворотки, полученные предлагаемым способом, более активны, чем сыворотки полученные способом-прототипом и пригодны для постановки более широкого диапазона иммунохимических реакций с целью идентификации вируса болезни Ауески.

Таким образом предложен способ получения диагностической сыворотки к вирусу болезни Ауески, использование которого обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества:
ускорение процедуры получения целевого продукта, что одновременно приводит к снижению его себестоимости;
повышение специфичности и активности диагностической сыворотки;
расширение области применения целевого продукта получаемая сыворотка пригодна дополнительно для использования в реакциях ИФМ и РСК;
обеспечивание как производственной так и ветеринарно-санитарной безопасности производства целевого продукта.

Предлагаемый способ может найти промышленное применение при изготовлении средств для диагностики болезни Ауески.

Использование: в медицине, в медицинской промышленности для получения диагностикумов к вирусу болезни Ауески. Сущность изобретения: в качестве доноров используют морских свинок, которых многократно иммунизируют внутримышечно эмульсией, содержащей в равном соотношении инактивированный концентрированный специфический антиген, репродуцированный в культуре клеток, и масляный адъювант, причем вторую инъекцию производят на 20 - 22-й день, а третью - на 28 - 30-й день после первой, отбор крови осуществляют на 39 - 40-й день после начала иммунизации. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ, включающий многократную иммунизацию доноров специфическим антигеном с адьюватом, отбор крови с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве доноров используют морских свинок массой 400 500 г, а иммунизацию доноров осуществляют внутримышечно эмульсией, содержащей в равном соотношении инактивированный концентрированный специфический антиген, репродуцированный в культуре клеток, и масляный адьюват, причем вторую инъекцию производят на 20 22-й день, а третью на 28 30-й день после первой, отбор крови осуществляют на 39 40-й день после начала иммунизации.