ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ ШТАММ УНИИЭВ 18 В Российский патент 1997 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

Изобретение относится к вирусологии, иммунологии и биотехнологии, а именно к гибридомной технологии и представляет собой новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L, продуцирующих в клеточных культурах и асцитических жидкостях моноклональные антитела (МАт) к вирусу болезни Ауески (ВБА), которые могут быть использованы для научных исследований и приготовления средств диагностики, профилактики и лечения болезни Ауески (БА).

БА остро протекающая в виде эпизоотий и спорадических случаев вирусная болезнь сельскохозяйственных животных всех видов, пушных зверей и грызунов. Характеризуется признаками поражения нервной системы и легких, сильным зудом и расчесами (у всех видов животных, кроме свиней, норок и собак). БА типичная герпесвирусная инфекция, имеющая множество форм течения, в том числе с длительной, практически пожизненной латенцией /1/.

БА является одним из наиболее распространенных заболеваний свиней, наносящих серьезный материальный ущерб странам с развитым животноводством. В связи с интенсификацией свиноводства отмечена тенденция к широкому энзоотическому распространению БА по всей Европе, Северной и Южной Америке. Это заболевание причислено к особо опасным для свиноводства вирусным инфекциям. Все это вынуждает инфитенсифицировать работу по созданию более эффективных средств диагностики, профилактики и лечения БА. Проблема создания эффективных защитных препаратов остается весьма актуальной. Это обусловлено особенностями патологии, эпизоотологии и иммунологии герпесвирусных инфекций.

Одним из направлений исследований по созданию нового поколения вакцин против БА является поиск новых полевых и получение из них вакцинных штаммов ВБА, пригодных для изготовления эффективных вакцин.

Первым вакцинным штаммом ВБА, широко используемым в Европе, был штамм БУК, полученный серией пассажей на куриных фибробластах.

В настоящее время имеются сведения о применении живых и аттенуированных, вирулентных и авирулентных штаммов ВБА: Барта К61, МК 25 и 35, Nia 3,4 и 14, Alfort 26, Арский, ВГНКИ, К и других /2, 3, 4, 5/.

Для выявления и идентификации ВБА и противовирусных антител наиболее перспективным является иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител, которые широко используют зарубежные исследователи /6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13/. Моноклональные антитела это наиболее эффективный инструмент для изучения закономерностей взаимодействия вируса и клетки, выявления патологических, функциональных характеристик и биологических свойств возбудителя. С помощью моноклональных антител может быть изучено антигенное родство штаммов ВБА, что делает возможным прогнозирование защитных свойств вакцины, приготовленной из полевых изолятов. МАт имеют ряд преимуществ перед традиционно применяемыми поликлональными антисыворотками. Они характеризуются химической гомогенностью, строго определенной специфичностью к антигенным детерминантам вируса. Источники их получения (гибридомы) отличаются генетической стабильностью и могут длительное время сохраняться в жидком азоте. МАт могут быть наработаны в любых количествах в виде асцитической жидкости мышей или супернатантов культуры клеток. Для диагностики и идентификации ВБА широко применяются иммунофлуоресцентный и иммунопероксидазный методы с использованием моноклональных антител /7, 8, 9, 10, 11, 12, 14/.

В настоящее время уже известны штаммы гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L, продуцирующих монокдональные антитела к ВБА или к его основному иммунизирующему компоненту вириона Gp 50. В работах зарубежных исследователей приведены данные о получении моноклональных антител как на цельный вирион ВБА, так и на отдельные вирусспецифические белки вириона G I, G II, G III, Gp 50 /6, 8, 9, 10, 11, 13/.

Ben-Porat T. и др. изучили роль различных гликопротеинов ВБА в индуцировании выработки нейтрализующих антител у свиней. Авторы провели анализ антигенных свойств и иммуногенной активности гликопротеинов ВБА, идентифицированных в реакции иммунопреципитации с МАт. Вирусные изоляты, выделенные в различных географических зонах США, существенно отличались по антигенным свойствам. Изменения отмечены в белках G I и G III. Вируснейтрализующая активность МАт связана преимущественно с G III /6/.

У нас в России штамм УНИИЭВ 18В ВБА является производственным и используется при изготовлении вакцин и диагностических препаратов, однако в доступных нам источниках информации мы не обнаружили сведений о получении МАт к ВБА штамм УНИИЭВ 18В /15, 16, 17, 18, 19, 20, 21/.

В задачу создания изобретения входило получение штамма гибридных культивируемых клеток (гибридомы), продуцирующих МАт к ВБА штамм УНИИЭВ 18В, высокоактивных в иммуноферментном анализе и реакции нейтрализации с гомологичным вирусом.

Поставленная задача решена тем, что получен новый, ранее неизвестный штамм гибридных культивируемых клеток мыши (Mus musculus L).

GV ВАИ-94/1 продуцент МАт к ВБА штамм УНИИЭВ 18В. Культура хранится в музее клеток ВНИИ защиты животных и на 17-20 пассаже в культуре клеток, выращиваемых в пластиковых матрасах, а также после перевивания на мышах линии BA L B/С, депонирована во Всероссийской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером ВСКК(П) 647Д
Характеристика полученного штамма
1. Родословная штамма. Гибридный штамм N 1 ГВБАУ-94 (GVBAU-94/1) получен слиянием мышиных миеломных клеток линии ПАИ с клетками селезенки мыши линии BAL В/с предварительно иммунизированной ВБА штамм УНИИЭВ 18В.

2. Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования. Клетки заморожены на 17-20 пассаже в культуре клеток, выращиваемых в пластиковых матрасах, а также после перевивания на мышах линии ВА L В/С.

3. Стандартные условия выращивания. Температура культивирования +37 ^oC. Среда культивирования ДМЕМ с добавлением 15 фетальной сыворотки КРС 50 мкг/мл гентамицина, pH 7,0-7,2.

4. Культурные свойства. Штамм растет на средах для культур клеток млекопитающих JMDM, DMEM,RPMJ-1640 с добавлением 10-20 фетальной сыворотки КРС с 50 мкг/мл гентамицина. При селекции гибридных клеток в питательную среду добавляют гипоксантин-аминоптеринтимидин (ГАТ) в рабочих разведениях. Оптимальная ростовая концентрация клеток 150000 кл/мл. Оптимальная pH среды 7,0-7,2 клетки инкубируют во влажной атмосфере с 5 СО₂ при 37 ^oC. При посеве единичные клетки в процессе размножения образуют колонии округлой формы с ровными краями, затем колонии сливаются и формируют сплошной монослой. При посевной дозе 150000 кл/мл сплошной монослой формируется на 2-3 дня. Клетки обладают хорошей адгезивной способностью. Легко снимаются со стенок посуды встряхиванием без применения трипсина и версена. Жизнеспособность клеток поддерживают путем регулярных пересевов на свежую питательную среду. Частота пересева 3 раза в неделю. Краткость рассева составляет 1:2 1:5 Тип роста стационарная суспензия. При введении гибридом внутрибрюшинно у мышей линии BA L В/С образуется асцитная или твердая опухоли. Перед введением клеток за 5-20 дней этим животным вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл ангарского масла (ТУ-38-101 84-81). Титр антител в асцитической жидкости в ИФА составляет 10³-10⁵. От одной мыши получают 3-10 мл асцита. Асцит образуется через 14-20 дней.

5. Характеристика культивирования гибридомы в организме животного. Образует асцитические опухоли на мышах линии BA В/с. Доза клеток при прививке 4-10 млн/мл мышам, праймированным 0,5 мл ангарного масла за 5-20 дней до введения клеток. Срок образования асцита 10-20 дней, не теряет антителопродуцирующей способности при прививке в течение 15-20 пассажей на мышах (срок наблюдения).

6. Цитогенетическая (кариологическая) характеристика. Кариотип соответствует виду (мышиный). Модальный класс 86 хромосом. Модальный класс для родительской миеломной линии ПАИ-64 хромосомы.

7. Цитоморфологическая характеристика. Клетки круглые, различной величины. Ядра занимают большую часть клетки.

8. Онкогенность. Штамм обладает онкогеными свойствами, характеризующимися образованием асцитов или твердых опухолей у мышей линии BA L В/с.

9. Маркерные характеристики. Изоферменты ЛДГ соответствуют мышиным (одна изоформа с дополнительной полосой). Гибридные клетки продуцируют МАт к ВБА штамм УНИИЭВ 18В.

10. Данные о контаминации. Микробиологическим, цитохимическим (окраска оливоцинином, акридиновым оранжевым) и электронномикроскопческим методами контаминанты не обнаружены
11. Биотехнологическая характеристика. Штамм продуцирует МАт, относящийся к классу JgG и обладающие специфической активностью в ИФА, РН, РЗ на мышатах-сосунах. МАт обнаруживаются в асцитической жидкости в ИФА на протяжении 15-20 пассажей на мышах (срок наблюдения) в разведениях 10^-3-10^-5 и обладают специфической активностью к ВБА штамм УНИИЭВ 18В. Отмечена в РН-6, Олог₂, РЗ на мышатах-сосунах -3,2. Культуральную жидкость можно применить в качестве диагностического антительного препарата, однако для получения более высокого титра антител по 10⁵ гибридные клетки в дозе 1-10 млн/0,5 мл вводят внутрибрюшинно мышам линии BA L В/с, праймированным внутрибрюшинно ангарским маслом. Через 14-20 дней после появления у мышей асцитных или твердых опухолей собирают жидкость (3-10 мл), клетки осаждают центрифигурированием при 1000 об/мин в течении 10 мин. Недосадочная жидкость содержит МАт. Осадок, содержащий гибридные клетки, переводят в культуру или вводят мышам. Для повышения активности и специфичности МАт проводят их концентрирование и очистку, выделяя чистые иммуноглобулины. Иммуноглобулиновую фракцию получают путем двукратного осаждения 10 ПЭГ с м.м. 6000 (к антителам добавляют равный объем 20 ПЭГ и центрифугируют при 3500 об/мин в течении 30 мин).

Осадок ресуспендируют в уменьшенном количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР). Раствор диализуют против ФБР 24 ч при 4 ^oC. Культуральная жидкость содержит 10-20 мкг/мл, а асциты -20-30 мг/мл специфических иммуноглобулинов.

12. Способ криоконсервирования. Гибридомные клетки консервируют в жидком азоте в пластиковых или стеклянных ампулах в объеме 1 мл с концентрацией 4-10 млн/мл. Криозащитная среда: ДМЕМ-50 фетальная сыворотка КРС-43, диметилсульфоксид (ДМСО) 7 Выживаемость клеток после хранения 60-90
Как только среда станет жидкой, клетки переносят в конический пластиковый стакан с 50 мл холодной питательной среды и осаждают центрифигурированием при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл среды ДМЕМ с 20 фетальной сыворотки и ГАТ и высеивают в стеклянный матрас объемом 50 см³. Клетки инубируют при температуре 37 ^oC. Когда колонии заполняют 50-70 площади матраса, отбирают пробу культуральной жидкости для определения титра антител к ВБА в ИФА. Наивысший титр антител отмечен при полном монослое.

Предложенный штамм гибридных культивируемых клеток получили по ранее разработанной методике /22/ следующим образом.

Мышам линии BA L В/с в возрасте 1,5-2 мес вводили интраперитонально ВБА штамм УНИИЭВ 18В в количестве 100 мкг/ мышь в смеси с полным адъювантом Фрейда в соотношении 1: 1. Через 21 день проводили гипериммунизацию мышей интраперитонеально этим же антигеном в дозе 100 мкг/мышь без адъюванта. Спустя три дня после повторного введения антигена проводили тестирование сыворотки крови мышей на наличие специфических антител в ИФА. В опыт отбирали доноров с титром антител в сыворотке крови менее 10³.

Для гибридизации у иммунизированных мышей стерильно брали селезенку и ресуспендировали в 50 мл культуральной среды ДМЕМ без сыворотки. Клетки миеломы линии ПАИ в логарифмической фазе роста отмывали в среде ДМЕМ от сыворотки, смешивали с иммунными клетками селезенки в соотношении от 1:1 до 1:5 и осаждали центрифигурированием при 1000 об/мин 10 мин. К осадку по каплям в течение минуты добавляли 50 -й раствор ПЭГ м.м. 4000, содержащий 5 ДМСО. Клетки оставляли на 5 мин с ПЭГ. Затем добавляли 5 мл среды ДМЕМ без сыворотки и оставляли на контакт еще на 5 мин. Полученную суспензию клеток разбавляли средой ДМЕМ, содержащей 20 фетальной сыворотки и ГАТ в количестве 13,6 мг/л; 0,176 мг/л и 3,78 мг/л соответственно в рабочих концентрациях. Клетки вносили в 96-24-луночные пластины фирмы "Flow Laboratories" (Великобритания) по 0,2-1,0 мл с концентрацией 100-20 тыс/лунка соответственно. Через 10-14 дней супернатанты гибридных клонов тестировали на наличие антител в ИФА. Позитивные клоны составляли 5-20 от общего количества клонов. Эти клоны дважды субклонировали методом предельных разведений. Стабильный клон с наивысшим титром антител (МАт-1В4) заложили на хранение в клеточный банк ВНИИЗЖ под авторским названием N 1 ГВБАУ-94 (GV ВАИ-94/1) и депонировали во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) под регистрационным номером ВСКК(П) N 642 Д.

Пример. Антиген ВБА штамм УНИИЭВ 18В индентифицируют в ИФА с помощью МАт. Для этого МАт, разведенные в 0,-2-молярном карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,5 в количестве 200 мкл/лунка в концентрации 1-10 нг/мл, вносят в лунки пластин из полистирола для серологических реакций и инкубируют в течение 2-14 ч при температуре 20-4 ^oC. Раствор антител удаляют и 3-5 раз промывают лунки ФБР. Затем в лунки вносят по 200 мкл испытуемого антигена в ФБР с 10 фетальной сыворотки КРС. Антиген готовят путем пяти- или десятикратных разведений в этом же растворе. Антиген инкубируют в лунках планшета 2 ч при 37 ^oC и 3-5 раз отмывают в ФБР. Затем в лунки вносят конъюгат (МАт, меченные пероксидазой хрена) в рабочем разведении. Конъюгат разводят на ФБР с 10 фетальной сыворотки КРС до концентрации 1-5 мкг/мл в расчете на JgG и инкубируют 1-2 ч при комнатной температуре. Затем лунки 3-5 раз промывают в ФБР и в них вносят субстрат, содержащий ортофенилендиамин 0,4 мг/мл в 0,1 м цитрат-фосфатном буфере pH 5,0 и 0,01 H₂ О₂. После инкубации при комнатной температуре в течение 1-5 мин проводят учет реакции путем определения оптической плотности раствора на автоматическом 1-канальном фотометре фирмы "Dyna". Реакцию можно учитывать и визуально по интенсивности окраски оранжевого цвета. Установлено, что штамм гибридных клеток стабилен как по культуральным и морфологическим признакам, так и по титру специфических антител в ИФА, РН и РЗ.

Активность и специфичность МАт к ВБА определяли в ИФА, РН и РЗ как с гетерологичными антигенами (ящур, ВБС, ВЭС, диарея, КРС), так и с гомологичными антигенами ВБА.

Проведенные испытания показали, что МАт к ВБА не реагируют с возбудителями ящура (А₂₂и Азия-1), ВБС, ВЭС и диареи КРС.

Данные определения специфической активности асцитической жидкости, содержащей МАт, полученные от штамма N 1 ГВБАИ-94 (GVВАИ-94/1) регистрационный номер ВСКК (П) 642Д, с гомологичным антителами ВБА представлены в таблице.

Штаммы ВБА Арский, Бран, БУК, Женевский, Мараштанский любезно предоставлены д.в.н. Камаловым Г.Х. (КазНИВИ, г.Казань).

Штамм Верблюжий выделен проф. д.в.н. Мищенко В.А. во время вспышки заболевания у верблюдов в Туркмении в 1992 году.

Штамм МК получен от доктора Тереклекова П. (Болгария).

Согласно таблице наиболее высокая специфическая активность МАт отмечена со штаммами УНИИЭВ 18В и БРАН, что, вероятно, свидетельствует о большой степени родства вышеуказанных штаммов. С другими гомологичными антигенами установлена более низкая активность.

Полученные в соответствии с изобретением МАт как химически чистые реагенты могут применяться в ИФА, РН и РЗ для обнаружения ВБА, противовирусных антител в сыворотке крови восприимчивых сельскохозяйственных животных, а также при генно-инженерной и молеккуляно-биологической характеристике возбудителя.

МАт против ВБА могут быть весьма полезны в ветеринарной вирусологии в практических и чисто научных областях при:
идентификации антигенных сайтов на уровне аминокислотных последовательностей;
характеристике антигенных сайтов с использованием различных модификации ИФА;
идентификации иммунологически важных антигенных сайтов;
использовании МАт для ускорения идентификации вирусных изолятов;
контроле технологии изготовления вакцин;
выделении и очистке вируса;
иммунизации и терапии животных.

Использование МАт в ветеринарной практике при диагностике, профилактике и лечении сельскохозяйственных животных позволит оптимизировать эпизоотическую ситуацию в стране по болезни Ауески.

Источники информации:
1. Малеев В. В. Сюрин В.Н. Болезнь Ауески. БМЭ, 1975, изд. 3, т. 2, с. 362.

2. Guadagnini P.F. Gelmett D. Malatia di Aujeski, ove strategie di profalassi Selez Veter. 1985, 26, 4, 534-541.

3. Oirschot J.T. Van Ctielkens A.L.J. Some characteristies of four attenuated Vaccine Virus strains and a virulent strain of Anijeszky's disease virus Veter. Q, 1984 г. 6, 4, 225-229.

4. Мищенко В.А. Дудников А.И. Бондаренко А.Ф. Оценка иммуногенной активности инактивированной вакцины против болезни Ауески на кроликах. Матер. науч. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 1992 г. 1, 194.

5. Прохорова Э.М. Посабцева Л.А. Активность трех вирулентных штаммов болезни Ауески. Специфическая профилактика и диагностика болезней животных, 1986 г. 16-18.

6. Ben-Porat T. De Marchi J.M. and all Role of glycoproteins of psendorabis virus in eliciting neutralizing antibodies Virologi, 1986, 154, 325-324.

7. Chang-Hee Kweon, Dong-Sup Lul, Moo Huyng Jun. Serological diagnosis of pseudorabies uting monoclonal antibody Veterinary Viral diseases, 1985, 478-479.

8. Eliоt M. Bourghaia H. and all. Identification of antigenic sites on pseudorabies virus glycoprotein gp 50 implicated in virus penetration of the host cell J.Gen Virol, 1990, 71,9, 2179-2183.

9. Eliot M. Fageaud D. Vannier P. Toma B. Development of an ELJSA to differentiable between animals either vacianated with or infected by Anjeszky's disease virus veter. Res, 1989, 4, 91-94.

10. Jacobs L. Meloen R.N. Gielkeus A.L. Van Oirschot J.T. Epitope analisi's of glycoprotein 1 psendorafies virus J Gen Virol, 1990, 71, 4, 381-387.

11. Mastuda Asami, Okada Nobutaka, Katayama Shigeyi e.a. Characterizaton of protective viral glycoproteins for pseudorabies virus infection. J Vet. Med. Sci. 1991, 53, 4, 734-741.

12. Osorio F.A. Doster A.R. Rapid diagnosis on pseudorabies EC (extension curcular) Nebraska cooperative extension service, Nebraska agr. -res. div. 1987, 87-219, 14-15.

13. Wather M.W. Wather L.M.K. Isolation, characterization and physical mapping of a psendorabie virrus mutant containing antigenically altered gp 50. J. Virol. 1984, 51, 1, 57-62.

14. Quist R. Sorensen K.J. Meiling A. Monoclonal blocking ELJSA detecting serum antibodies to the glycoprotein g.2 of Anjeszky's disease virus. J. Virol. Meth. 1989, 24, 169-180.

15. Моренков О.С. Манцыгин Ю.А. Сергеев В.А. и др. Получение и характеристика моноклональных антител к гликопротеину G2 вируса болезни Ауески и их использование для эпитопного картирования G2. Вопросы вирусолог. 1994, 4, 174-177.

16. ЕПВ N 0231641, МПК³ А 61 К 39/42, С 12 Р 21/00, С 07 К 15/00, С 12 5/00, С 12 R 1:91, 19.12.86, пр. США 09.01.86, авторы: Marchidi C.C. Jancey R.J. Вакцина против болезни Ауески.

17. Цымбал А.М. и др. Инактивированная культуральная вакцина УНИИЭВ против болезни Ауески свиней, овец и пушных зверей. Тез. докл. 3 Всесоюз. конф. "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов". М. 21-23 окт. 1987 г. 49-50.

18. Цымбал А.М. Лысенко И.П. Конаржевский К.Е. и др. Лабораторное и производственное испытание инактивированной культуральной вакцины УНИИЭВ против болезни Ауески. Научн. основы профил. и борьбы с забол. с.-х жив-ых, 1987 г. 17-23.

19. Цымбал А.М. Конаржевский К.Е. Белоконь В.С. и др. Вирулентные и иммуногенные свойства вируса болезни Ауески, репродуцированного на перевиваемых клетках линии СПЭВ, культивируемых на различных питательных средах. Ветеринария (Киев), 1989 г. вып. 64, 3-4.

20. Наставление по применению эмульсионной инактивированной конценратвакцины против болезни Ауески из культурального вируса. Утв. 05.10.92 г.

21. Эмульсионная инактивированная вакцины ВНИЯИ-УНИИЭВ против болезни Ауески из культурального вируса. ТУ, утв. ГУВ Украины 25.01.92 г.

22. Методика получения и поддержания гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела к вирусу ящура Азия-1. Утверждена директором ВНИИЗЖ 22.06.94 г.

Использование: ветеринарная биотехнология, разработка препаратов для диагностики, профилактики и лечения болезни Ауески. Сущность: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцирующего моноклональные антитела (МА) к вирусу болезни Ауески (ВБА) штамма УНИИЭВ 18В. Штамм получают гибридизацией миеломных клеток мыши линии ПАИ со спленоцитами мышей линии Balb/c, имунизированных ВБА штамма УНИИЭВ 18В. Штамм GVBAU-94/1 продуирует МА изотипа Ig G, культуральная жидкость содержит 10-20 мкг/мл, асцитная - 20-30 мг/мл. 1 табл.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П) N 642Д продуцент моноклональных антител к вирусу болезни Ауески штамм УНИИЭВ 18В.