СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛИ РОДА CHLORELLA Российский патент 1995 года по МПК C12N1/12 C12P21/00 A23J3/20 A23K1/00 

Изобретение касается микробиологической промышленности, а именно переработки биомассы, продуцируемой микроорганизмами, точнее изобретение касается способа извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли Chlorella.

Извлекаемые биологически активные вещества найдут применение в фармацевтической промышленности, при изготовлении косметических средств, в медицинской микробиологии для приготовления питательных сред, в сельском хозяйстве для получения кормовых добавок.

Известен способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли Chlorella [1] заключающийся в том, что водную суспензию сухой биомассы подвергают кипячению в течение 5 мин для увеличения проницаемости клеточных оболочек и денатурации белка, а затем осуществляют гидролитическое расщепление ферментами. Ферментолиз проводят сначала ферментом, разрушающим полисахариды, содержащиеся в биомассе, а затем ферментами, разрушающими протеины, используя при этом соответственно Целлоконингин Г-3х и протосубтилин Г-10х. После окончания гидролиза через 5-6 ч водную фазу отделяют от осадка центрифугированием при 7000 об/мин в течение 20 мин. Жидкий ферментативный гидролизат высушивают в распылительной сушилке. Указанный способ обеспечивает выход аминного азота до 8500 мг на 1 кг сухой хлореллы. Оставшийся после отделения жидкой фракции осадок содержит значительное количество веществ липидной природы (более 20%).

Однако известный способ позволяет выделить из биомассы хлореллы только один продукт белковой природы, оставляя в шроте не менее ценные биологически активные вещества липидной природы (пигменты, а том числе каротиноиды, фосфолипиды, гликолипиды), которые являются не менее ценными и используются широко в медицине (например, каротиноиды), косметологии, бытовой химии. В известном способе не предусмотрена инактивация ферментов после окончания гидролиза, в результате чего полученный белковый гидролизат может содержать некоторое количество протеолитических ферментов, что ограничивает сферу применения белкового гидролизата, так как они могут оказывать местно-раздражающее действие на кожу при использовании белкового гидролизата в составе косметических средств. Белковый гидролизат, полученный из необезжиренной биомассы, содержит примеси хлорофилла, который является ингибитором роста многих бактериальных культур. Поэтому использование белкового гидролизата, полученного по такой методике, в составе микробиологических питательных средств нежелательно.

В основу предлагаемого изобретения положена задача путем последовательной обработки биомассы микроводорослей выделить из нее два продукта, обладающих биологической активностью, и при этом повысить выход и качество белкового продукта.

Для этого в способе извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли Chlorella, включающем термообработку биомассы при 100^оС, двухстадийный ферментативный гидролиз с помощью ферментов целлюлолитического и протеолитического действия с последующим кипячением и отделением водной фазы, содержащей белковый гидролизат, и негидролизуемый остаток биомассы, согласно изобретению биомассу микроводоросли предварительно обрабатывают органическим растворителем и полученный липид-пигментный комплекс отделяют, ферментативный гидролиз ведут до достижения в водной фазе реакционной массы содержания сухого вещества от 5,0 до 5,8%
В качестве ферментов можно использовать протеолитические ферменты в сочетании с целлюлолитическими, что позволяет разрушить клеточные оболочки хлореллы и осуществить гидролиз белков.

Для достижения максимального значения выхода липид-пигментного комплекса целесообразно исходную биомассу хлореллы подвергать воздействию смеси этанола с экстракционным бензином, взятым в соотношении 1:2 соответственно.

Извлеченный липид-пигментный комплекс содержит 50,02-56,20 мас. гликолипидов и фосфолипидов, 31,4-39,8 мас. хлорофиллов и диацилглицеролов, 1,7-6,4 мас. триацилглицеролов, 2,1-5,7 мас. свободных жирных кислот, 0,4-2,2 мас. углеводов и каротиноидов, остальное неидентифицированные соединения, а извлеченный белковый гидролизат содержит, от абс. сух.вещ. свободные аминокислоты 60,62, остаточный белок 4,12, остаточные нуклеиновые кислоты 0,01, сумма углеводов 21,12.

Извлечение биологически активных веществ согласно предлагаемому изобретению осуществляют из биомассы микроводоросли рода Chlorella, полученной при выращивании на минеральной среде при освещении и подаче углекислого газа. В основном используемая биомасса имеет следующий химический состав, мас. белок 45-50, углеводы 18-20, липиды 18-20, зола 8-10.

Витамины, мг. аскорбиновая кислота 120-200, бета-каротин 30-60, тиамин 0,3-0,5, рибофлавин 2,0-3,5, пиридоксин 0,5-0,9, токоферолы 18-20.

Биомассу без предварительной тепловой обработки, разрушающей каротиноиды биомассы, подвергают согласно изобретению сначала воздействию органических растворителей, например этанола, бензина, смесью бензина с этанолом в соотношении 1: 2 соответственно. При этом происходит экстрагирование следующих соединений: гликолипидов и фосфолипидов в количестве от 50,02 до 56,20 мас. хлорофиллов и диацилглицеролов в количестве от 31,4 до 39,8 мас. триацилглицеролов в количестве от 1,7 до 6,4 мас. свободных жирных кислот в количестве от 2,1 до 5,8 мас. углеводов и каротиноидов в количестве от 0,4 до 2,2 мас. После окончания экстрагирования проводят разделение, например, с помощью фильтрования экстракта и обезжиренной биомассы. Отделенный экстракт сгущают, например, в вакуумном испарителе с получением комплекса биологически активных веществ, названных липид-пигментным комплексом. Выход последнего составляет от 11,0 до 15,0 мас. Обезжиренную биомассу затем подвергают тепловой обработке при 100^оС путем разваривания ее в водной среде для увеличения проницаемости клеточных оболочек в отношении применяемых в дальнейшем ферментных препаратов, после чего согласно изобретению осуществляют ферментативный гидролиз, используя протеолитические ферменты в сочетании с целлюлолитическими, а предпочтительно используя целловиридин П10х и протосубтилин Г-10х. Комбинированное действие фермента целловиридина П-10х, обладающего разнообразным ферментативным комплексом и высокой активностью в отношении разрушения компонентов, входящих в состав клеточных оболочек микроводоросли рода Chlorella, и протеолитического ферментного препарата протосубтилина Г-10х приводит к более глубокому гидролизу белков микроводоросли и соответственно более высокому выходу аминного азота из биомассы клеток. Ферментолиз осуществляют до достижения в водной фазе реакционной массы концентрации сухих веществ 5,0-5,8% По окончании ферментолиза проводят инактивацию ферментов, например, при повышенной температуре, после чего осуществляют отделение, например центрифугированием, водной фазы реакционной массы, представляющей собой белковый гидролизат от негидролизуемого остатка биомассы. После высушивания белковый гидролизат, выход которого составляет около 33 мас. представляет собой порошок светлого цвета с влажностью не более 7% и имеет следующий состав, мас. Азот общий 10,36 белковый 0,66 небелковый 9 "Свободные" аминокислоты 60,62 Остаточный белок 4,12 Нуклеотиды 6,85 Сумма углеводов 21,12
Аминокислотный состав сухого гидролизата, к сумме аминокислот: Лизин 4,50 Гистидин 1,86 Аргинин 6,23 Аспарагиновая кислота 8,22 Треонин 1,08 Серин 5,11 Глютаминовая кислота 8,84 Пролин 7,07 Глицин 10,20 Аланин 27,00 Валин 5,48 Метионин 0,67 Изолейцин 1,96 Лейцин 8,05 Тирозин 1,87 Фенилаланин 1,79
Качественно обнаружены цистеин, триптофан.

Остаток реакционной массы после отделения от нее белкового гидролизата представляет собой ферментативный деструктат клеток, так называемый шрот. В его составе содержится до 35% сырого протеина, главным образом свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды, углеводы представлены соединениями типа крахмала.

Таким образом, в результате последовательной переработки биомассы микроводорослей рода Chlorella получают не только ценные биологически активные вещества в количествах, значительно превышающих ранее достигнутые (по отношению к исходному продукту), но и шрот, который может быть использован, например, в кормовых целях для рыболовства и животноводства. Учитывая химический состав шрота, он был исследован как белковая кормовая добавка в составе кормового рациона для с/х животных (телята). Было установлено, что шрот по своим химическим и кормовым свойствам близок к шроту подсолнечника и может включаться в кормовой рацион в качестве источника белка (до 20% от общего белка рациона).

П р и м е р 1. 1 кг сухой биомассы Chlorella vulgaris ЛАРГ-3 экстрагируют 10 л экстрагента, например этанола. Экстракцию проводят в два этапа. Сначала биомассу заливают 6 л экстрагента и перемешивают в течение 6 ч при комнатной температуре. Экстракт отделяют фильтрованием, а оставшуюся биомассу заливают свежей порцией этанола в объеме 4 л, перемешивают в течение 3 ч и фильтруют. Экстракты объединяют и сгущают в вакуумном испарителе при температуре не выше 45^оС. Конечными продуктами являются липид-пигментный комплекс и обезжиренная биомасса. Выход липид-пигментного комплекса (ЛПК) при такой обработке составляет 110 г (11% от исходной биомассы). Состав полученного ЛПК приведен в табл.2. Обезжиренную биомассу подвергают ферментативному гидролизу. Для этого остаток биомассы 890 г смешивают с 10-кратным количеством воды и разваривают при температуре 100^оС в течение 5-10 мин. Затем смесь охлаждают до 50^оС, доводят рН до 4,5-5,0 и вносят фермент целлюлозу 1000 в количестве 8,9 г для разрушения полисахаридного комплекса клеток. Количество фермента составляет 1% от веса биомассы водорослей. Фермент предварительно размешивают в небольшом количестве воды (например, 100 мл). Процесс гидролиза продолжают 3 ч при перемешивании и температуре 45-50^оС. По окончании первого этапа гидролиза в реакционную смесь добавляют раствор NaOH до достижения рН 6,5, фермент ренниномезинтерин Г-20х (предварительно размещенный в небольшом количестве воды) в количестве 8,9 г и гидролиз проводят еще 6 ч при 45-50^оС. Затем реакционную смесь нагревают до 100-105^оС (для инактивации ферментов), охлаждают до комнатной температуры и сепарируют при 6000 об/мин. Полученные продукты (белковый гидролизат и шрот) высушивают на распылительной сушилке. Выход гидролизата 360 г (36% от исходной биомассы). Выход шрота 530 г (53% от исходной биомассы).

П р и м е р 2. 1 кг сухой биомассы микроводоросли рода Chlorella смешивают с 10 л экстрагента и проводят экстракцию при комнатной температуре. В качестве экстрагента используют этанол. После окончания экстракции проводят разделение липидов и обезжиренной биомассы путем фильтрования. Полученный экстракт сгущают в вакуумном испарителе при температуре не выше 45^оС. Конечными продуктами являются липид-пигментный комплекс и обезжиренная биомасса. Выход липид-пигментного комплекса при такой обработке составляет 110 г (11% от исходной биомассы). Состав полученного липид-пигментного комплекса приведен в табл.2.

Обезжиренную биомассу подвергают ферментативному гидролизу. Остаток биомассы 890 г смешивают с 10-кратным количеством воды, разваривают и проводят ферментативный гидролиз с последовательным использованием двух ферментов целловиридина П-10х и протосубтилина Г-10х. Первый фермент осуществляет разрушение полисахаридного комплекса клеток. Длительность процесса гидролиза 3 ч. С использованием второго фермента осуществляют гидролиз белков. Длительность процесса гидролиза 15 ч. После достижения в водной фазе содержания сухого вещества, равного 5% осуществляют инактивацию ферментов путем кипячения реакционной массы. Затем проводят разделение жидкого гидролизата и негидролизуемого остатка (шрота) на сепараторе при 6000 об/мин. Полученные продукты (белковый гидролизат и шрот) высушивают на распылительной сушилке. Выход гидролизата 250 г (25% от исходной биомассы). Выход шрота 640 г (64% от исходной биомассы).

П р и м е р 3. 1 кг сухой биомассы микроводоросли рода Chlorella смешивают с 10 л экстрагента, в качестве которого берут бензин экстракционный и проводят экстракцию липидов при комнатной температуре. После окончания процесса экстракции проводят разделение экстракта и обезжиренной биомассы. Полученный экстракт сгущают в вакуумном испарителе при 45-50^оС. Конечными продуктами являются липид-пигментный комплекс и обезжиренная биомасса. Выход липид-пигментного комплекса составляет 120 г (12% от исходной биомассы). Химический состав липид-пигментного комплекса приведен в табл.2.

Обезжиренную биомассу (880 г) смешивают с 10-кратным количеством воды, разваривают, подвергают ферментативному гидролизу, проводят разделение и сушку в условиях, аналогичных описанным в примере 1. Выход сухого гидролизата при этом составляет 270 г (27% от исходной биомассы).

П р и м е р 4. 1 кг сухой биомассы микроводоросли рода Chlorella смешивают с 10 л экстрагента, в качестве которого используют смесь этанола и бензина в соотношении 1:2. Экстракцию проводят при комнатной температуре. После окончания процесса экстракции экстракт и обезжиренную биомассу разделяют путем фильтрования. Экстракт сгущают в вакуумном испарителе при 45-50^оС. Конечными продуктами являются липид-пигментный комплекс и обезжиренная биомасса. Выход липид- пигментного комплекса составляет 150 г (15% от исходной биомассы). Состав липид-пигментного комплекса, полученного данным способом, приведен в табл.2.

Обезжиренную биомассу подвергают ферментативному гидролизу, разделению и сушке в условиях, аналогичных описанным в примере 1. Выход гидролизата при этом составляет 330 г (33% от исходной биомассы).

Использование: биотехнология, микробиология, получение БАВ. Сущность изобретения: биомассу микроводоросли Chlorella экстрагируют органическим растворителем и выделяют липид-пигментный комплекс. Оставшуюся биомассу подвергают ферментативному гидролизу ферментами целлюлолитического и протеолитического действия, проводят термообработку для инактивации ферментов и отделяют белковый гидролизат в виде водной фазы. Остаток биомассы, не представляющий собой деструктат клеток, может быть использован как белковая добавка для приготовления корма для животных. Способ позволяет извлечь биологически активные вещества из биомассы водоросли Chlorella и получить несколько продуктов различного назначения. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛИ РОДА CHLORELLA, включающий термообработку биомассы при 100^oС, двустадийный ферментативный гидролиз с помощью ферментов целлюлолитического и протеолитического действия с последующим кипячением и отделением водной фазы, содержащей белковый гидролизат, и негидролизуемого остатка биомассы, отличающийся тем, что биомассу микроводоросли предварительно обрабатывают органическим растворителем и полученный липидпигментный комплекс отделяют, ферментативный гидролиз ведут до достижения в водной фазе реакционной массы содержания сухого вещества 5,0 5,8%
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют смесь этанола с бензином в соотношении 1:2.