СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 18-КАРБОКСИ-20-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-8-ЭТЕНИЛ-13-ЭТИЛ-2,3-ДИГИДРО-3,7-12,17-ТЕТРАМЕТИЛ-21Н, 23НПОРФИН-2-ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/12 C07D487/22 

Изобретение относится к органической химии, а именно к улучшенному способу получения порфиринов, в частности к способу получения хлорина е₆(18-карбокси-20-(карбоксиметил)-8-этенил-13-этил-2,3-дигид- ро-3,7,12,17- тетраметил-21н, 23н. порфин-2-пропионовой кислоты) или ее солей, которые могут найти применение в химико-фармацевтической промышленности.

Хлорин е₆ относится к классу растительных порфиринов, получаемых на основе хлорофилла . Известно, что растительные порфирины, в том числе хлорофилл и его производные, являются фармакологически активными соединениями и могут быть использованы в медицинской практике, в том числе как фотосенсибилизаторы для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний. В настоящее время известны способы получения хлорина е₆, основанные на химических превращениях хлорофилла в целевой продукт.

В частности, наиболее распространен способ получения хлорина е₆путем обработки хлорофильного экстракта, полученного из соевых бобов, 30%-ной соляной кислотой с получением смеси феофорбидов и , которую затем обрабатывают 0,5%-ным метанольным раствором щелочи в вакууме. Целевой продукт извлекают из реакционной массы с помощью эфира.

Известен также способ получения хлорина е₆ из листьев крапивы. Для этого листья крапивы заливают этанолом. В результате получают экстракт, содержащий смесь хлорофиллов и . Экстракт обрабатывают концентрированной соляной кислотой, в результате чего из каждой формы хлорофилла, содержащейся в экстракте, образуется соответствующая форма феофитина и . Последующее щелочное омыление разных форм феофитина приводит к образованию в реакционной массе как минимум двух продуктов хлорина е₆ и родина g₇. Соотношение этих продуктов составляет 4:1 соответственно. Наряду с этими основными продуктами в реакционной смеси присутствуют их эфиры, а также фитинные остатки.

Для выделения хлорина е₆ из смеси продуктов реакционную смесь сначала нейтрализуют концентрированной соляной кислотой до рН 7,0, а затем добавляют дополнительно концентрированную соляную кислоту в количестве, соответствующем солянокислому числу хлорина е₆. При этом из реакционной смеси извлекают 2/3 растворенного в ней хлорина е₆.

Расход концентрированной соляной кислоты на очистку хлорина е₆составляет 120 мл на 1 л реакционной смеси, а всего на получение 1 г хлорина расходуют 2,5 л концентрированной соляной кислоты.

По указанному способу получают 1 г хлорина е₆ из 1 кг сухих листьев крапивы, при этом чистота продукта составляет от 30% до 60% основного вещества. Для получения более чистого целевого продукта используют метод колоночной хроматографии окиси алюминия (элюент-метиленхлорид:бензол (2 к 1)).

Таким образом, в известных методах получения хлорина е₆ на первой стадии технологического цикла используются экстракты хлорофилла, полученные из хлорофиллсодержащих частей высших растений или зеленых водорослей. Известно, что все зеленые растения содержат несколько форм хлорофилла, а именно хлорофиллы и . При этом соотношение отдельных форм хлорофилла у разных растений неодинаково и зависит от приспособляемости растений к различным условиям освещения. У "светолюбивых" растений соотношение хлорофиллов и в листьях составляет в среднем 3:1, у "теневыносливых" оно уменьшается.

При обработке зеленых растений органическими растворителями извлекаются все формы хлорофилла ( и ) и при последующей обработке этих экстрактов образуется либо смесь феофорбидов и (по первому способу), либо смесь феофитинов и (как указано во втором способе), что в конечном счете приводит к образованию смеси хлорина е₆ и родина g₇.

Недостатками известных способов получения хлорина е₆ являются сложность технологического процесса, использование больших объемов концентрированной соляной кислоты (2,5 л на 1 г хлорина е₆), небольшой выход и низкая чистота целевого продукта (из 1 кг сухих листьев крапивы получают 1 г хлорина е₆, чистота которого не выше 60%), использование хроматографического способа очистки целевого продукта. Кроме того, учитывая сложную экологическую обстановку, не исключена возможность загрязнения растительного сырья пестицидами и другими ядохимикатами, и использование спонтанно выросшей биомассы зеленых растений в качестве источника хлорофилла может привести в конечном счете к загрязнению медицинских препаратов.

Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта, существенное снижение расхода коррозионно-опасной соляной кислоты и получение целевого продукта чистотой не ниже 90% без использования хроматографической очистки.

Это достигается предлагаемым способом получения хлорина е₆, заключающимся в том, что в качестве исходного сырья используют биомассу цианобактерий обычно рода Spirulina, преимущественно выращенных на свету в контролируемых условиях на искусственных питательных средах, имеющих водородный показатель от 8,0 до 12,0. Биомассу цианобактерий обрабатывают водно-спиртовым раствором щелочи, преимущественно при соотношении вода:спирт как 1 к 2-3 и концентрацией щелочи 10^-2-10^-3 н. отфильтровывают и экстрагируют хлорофилл "а" этиловым спиртом. Объединенные экстракты обрабатывают органической или соляной кислотой, образовавшийся феофитин отфильтровывают, промывают неполярным органическим растворителем, обычно гексаном.

Щелочной гидролиз феофитина проводят в отсутствие кислорода воздуха в спиртовой среде при нагревании. При этом образуются щелочные соли хлорина. После охлаждения реакционную смесь доводят соляной кислотой до рН 6,0-7,0 (расход кислоты 50-55 мл на 1 л реакционной массы, образовавшийся осадок хлорина е₆ отфильтровывают, промывают и сушат до постоянного веса. Хлорин е₆ может быть переведен в соли обычными приемами.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить выход целевого продукта по меньшей мере в 3 раза и получить продукт с чистотой не ниже 90% Кроме того, расход концентрированной соляной кислоты сокращен приблизительно в 10 раз.

Для удаления водорастворимых белков, углеводородов и других примесей биомассу цианобактерий предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором щелочи, например, при соотношении воды и спирта 1 к 2-3 и концентрации щелочи 10^-2-10^-3 н. Для повышения выхода целевого продукта целесообразно согласно заявляемому изобретению использовать биомассу цианобактерий, содержащую (по сухому остатку) 2,0-4,5 мас. хлорофилла формы , 46-62 мас. белков, 4-9 мас. липидов, 10-20 мас. углеводов, 10-12 мас. зольных элементов.

Дальнейшие цели и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания способа получения хлорина е₆ и конкретных примеров осуществления этого способа.

В соответствии с заявленным изобретением получение 18-карбокси-20-(карбоксиметил)-8-этенил-13-этил-2,3-дигидро-3,7,12, 17- тетраметил-21н.23н. порфин-2-пропионовой кислоты, называемой хлорин е₆, осуществляют из вещества, содержащего хлорофилл только формы из биомассы цианобактерий, получаемой при их культивировании на искусственных питательных средах, в условиях солнечного или искусственного освещения.

Монокультуру цианобактерий выращивают в специальных ферментерах закрытого типа, исключающих заражение зелеными водорослями, а следовательно, и попадание в биомассу хлорофилла формы .

Использование хлорофиллсодержащего растительного сырья стандартного состава, выращенного в альгологически и экологически чистых условиях, гарантирует получение высокой чистоты хлорина е₆, свободного от следов тяжелых металлов и других примесей, вызванных загрязнением окружающей среды. Это обстоятельство особенно важно при производстве медицинских препаратов.

Биомассу цианобактерий целесообразно обрабатывать горячим водно-спиртовым раствором щелочи, например, при температуре 40-60^оС, соотношении воды и спирта 1 к 2-3 и концентрации щелочи 10^-2-10^-3 н. При такой обработке происходит разрушение клеточных оболочек, удаляются низкомолекулярные фракции углеводов и водорастворимые белки, которые затрудняют последующую экстракцию хлорофилла и загрязняют экстракт, а следовательно, целевой продукт. Биомассу после обработки экстрагируют этиловым спиртом, извлекая хлорофилл . На полученный экстракт воздействуют минеральной или органической кислотой, например уксусной или соляной, для образования в реакционной массе феофитина , который выделяют фильтрованием.

Полученный феофитин , выход которого составляет 10 г из 1 кг биомассы цианобактерий, промывают неполярным растворителем, например гексаном, для удаления каротиноидов и липидов с поверхности кристаллов феофитина .

Затем очищенный феофитин растворяют и подвергают омылению щелочью в отсутствие кислорода, например, в токе азота. При этом в реакционной массе образуется целевой продукт хлорин е₆. Для выделения хлорина е₆ реакционную смесь нейтрализуют соляной кислотой, взятой согласно изобретению в количестве 50-55 мл на 1 л реакционной массы до выпадения кристаллов хлорина е₆, которые отделяют фильтрованием.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать из 1 кг биомассы цианобактерий 3,5 г хлорина е₆ с чистотой не менее 90% при расходе концентрированной соляной кислоты в количестве 220 мл на 1 г целевого продукта, что в 10 раз меньше количества кислоты, используемого в способе-аналоге.

П р и м е р 1. Биомассу цианобактерий рода Spirulina выращивают в закрытом стеклянном ферментере в условиях солнечного или искусственного освещения на жидкой питательной среде, представляющей собой водный раствор солей, содержащих макро- и микроэлементы, необходимые для интенсивного культивирования цианобактерий. Питательная среда имеет водородный показатель от 8,0 до 12,0. Источником углерода служит углекислый газ, периодически вводимый в питательную среду. После достижения в суспензии определенной концентрации клеток (2,5-3,0 г/л) биомассу цианобактерий отделяют от питательной среды фильтрованием. 1 кг полученной таким образом биомассы цианобактерий с влажностью 75-80% заливают 2,5 л подогретого до 60^оС щелочного раствора этилового спирта, полученного при растворении 4 г NaHCO₃ в 1 л дистиллированной воды и последующем смешении с этиловым спиртом в соотношении 1:3 соответственно.

Смесь биомассы с указанным раствором перемешивают в течение 3-5 мин, после чего фильтруют. Биомассу на фильтре трижды экстрагируют этиловым спиртом, экстракты, содержащие хлорофилл , суммируют и обрабатывают ледяной уксусной кислотой из расчета 1,5 мл на 1 л экстракта. Образовавшиеся при этом кристаллы феофитина фильтруют и промывают гексаном. Выход феофитина составляет 10 г.

Феофитин в количестве 10 г растворяют в 3 л спирта при кипячении в токе азота, добавляют 400 г КОН и проводят реакцию омыления в течение 10 мин. После этого смесь нейтрализуют раствором, содержащим 45 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л реакционной смеси, до образования кристаллов хлорина е₆.

Реакционную смесь фильтруют. Кристаллы сушат на воздухе без доступа света. Чистота полученного продукта 92%
П р и м е р 2. Используют биомассу цианобактерий, полученную в условиях, аналогичных указанным в примере 1.

1 кг названной биомассы цианобактерий заливают 1,5 л щелочного раствора этилового спирта, который получают при растворении 40 мл 1 н. NaOH в 1 л дистиллированной воды и последующем смешивании с этиловым спиртом в соотношении 1 к 2 соответственно.

Смесь биомассы с указанным раствором перемешивают в течение 3-5 мин, фильтруют, биомассу трижды экстрагируют этиловым спиртом для извлечения хлорофилла . Экстракты объединяют и добавляют по 1,2 мл концентрированной HCl на каждый литр экстракта. Образующиеся при этом кристаллы феофитина фильтруют и промывают на фильтре гексаном. Выход феофитина составляет 10 г. 10 г феофитина растворяют в 3,3 л этилового спирта при кипячении, затем добавляют 400 г КОН и проводят реакцию омыления в течение 10 мин в вакууме. После этого реакционную смесь нейтрализуют раствором соляной кислоты до рН 6-7. Расход концентрированной соляной кислоты при этом составляет 55 мл.

Кристаллы хлорина е₆ из реакционной смеси фильтруют и сушат. Вес полученного хлорина 3,6 г. Чистота полученного продукта 91%
П р и м е р 3. Используют биомассу цианобактерий, полученную в условиях, аналогичных указанным в примере 1, при культивировании штамма Spirulina species Fr-A 127.

Спиртовой экстракт хлорофилла получают, как указано в примере 1. На 1 л этого экстракта добавляют 2 мл 1,0 н. щавелевой кислоты. Образующиеся при этом кристаллы феофитина фильтруют и промывают на фильтре гексаном. Выход феофитина составляет 9,7 г.

Полученный феофитин омыляют, как указано в примерах 1 и 2. Выход хлорина е₆ составляет 3,3 г при чистоте 90%

Использование: биотехнология, химико-фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: получение 18-карбобкси-20(карбоксиметил)-8-этенил -13- этил-2,3-дигидро-3,7,12,17 - тетраметил-21Н,23Н порфин -2- пропионовой кислоты или ее солей. Получение хлорина e₆ осуществляют при использовании в качестве сырья биомассы цианобактерий, например, рода Spirulina, полученной путем выращивания в условиях искусственного или солнечного освещения на питательных средах, имеющих рН 8,0 - 12,0, с предварительной обработкой биомассы спиртовым раствором щелочи. Полученный спиртовой экстракт хлорофилла обрабатывают кислотой с получением феофитина a. Феофитин промывают неполярным растворителем, например гексаном, и подвергают омылению до образования целевого продукта, который осаждают обработкой соляной кислотой. 4 з.п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 18-КАРБОКСИ-20-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-8-ЭТЕНИЛ-13-ЭТИЛ-2,3-ДИГИДРО-3,7-12,17-ТЕТРАМЕТИЛ-21Н, 23НПОРФИН-2-ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ, включающий экстракцию хлорофилла из растительного сырья, обработку экстракта кислотой с последующим щелочным гидролизом и выделением целевого продукта в виде кислоты или соли, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют биомассу цианобактерий, которую предварительно обрабатывают водно-спиртовым раствором щелочи, после обработки экстракта хлорофилла кислотой получаемый продукт отфильтровывают и промывают неполярным органическим растворителем и подвергают щелочному гидролизу в вакууме. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют биомассу цианобактерий рода Spirulina. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что используют биомассу цианобактерий рода Spirulina, выращенных на свету в контролируемых условиях на питательных средах, имеющих pH 8,0 - 12,0. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве щелочи используют гидроксиды или карбонаты щелочных металлов. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве неполярного органического растворителя используют гексан.