СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/08 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в производстве биомассы микроорганизмов.

Известны способы промышленного производства биомассы, включающие выращивание микроорганизмов в жидкой питательной среде и многоступенчатое концентрирование получаемых суспензий. Целью этих способов, в значительной мере, является кpупномасштабное получение источника кормового белка, для чего, как правило, используют непищевое сырье: гидролизаты растительных отходов, н-парафины нефти, природный газ и т. д. При этом суспензию выращенных микроорганизмов концентрируют с помощью двух и более ступеней сепарирования, флотации, фильтрования, центрифугирования, осаждения, упаривания или сочетаний этих приемов. Так, дрожжи рода Candida непрерывно выращивают в жидкой среде, содержащей гидролизат растительных отходов, аммиачную воду и минеральные соли в количествах, обеспечивающих концентрацию РВ на уровне 1,4-1,8% азота до 900 мг/л, фосфора в пересчете на P₂O₅ 400-450 мг/л и калия до 30 мг/л. Температура среды равна 36-38^оС, pH 4,2-4,6, скорость протока 0,2-0,25 ч^-1. В процессе культивирования при интенсивной аэрации в среде накапливается до 12-14 г/л дрожжей и образующуюся суспензию подвергают многоступенчатому концентрированию с помощью флотации и сепарирования. Содержание дрожжей в суспензии при флотации повышают до 25-35 г/л и при последующем трехступенчатом сепарировании с двукратной промывкой до 15-20% абсолютно сухих веществ. В результате промывки удаляются пигментные примеси и снижается зольность биомассы. В дальнейшем сгущенную суспензию упаривают до концентрации сухих веществ 23-25% и высушивают воздухом, нагретым до 350-450^оС. Высушенная биомасса стабильна при хранении, содержит 43-58% сырого протеина, 2,2-3,0% липидов, 11-23% углеводов, до 11% золы, не более 10% влаги и является кормовым продуктом, применяемым в качестве белковой добавки.

Известен способ производства биомассы, включающий выращивание микроорганизмов в жидкой среде с более высоким содержанием питательных веществ, что позволяет накапливать в исходной суспензии больше биомассы, и, как следствие этого, прибегать к менее сложной схеме многоступенчатого концентрирования. При получении паприна дрожжи рода Candida культивируют в жидкой среде, содержащей 3,5% очищенных н-парафинов с температурой кипения 200-340^оС и минеральные источники необходимых количеств азота, фосфора, серы, хлора, калия, натрия и микроэлементов. Среду интенсивно аэрируют, ее температуру поддерживают на уровне 32-34^оС, pH 4,0-4,5. Время выращивания составляет 8,0-8,5 ч. Суспензию выращенных дрожжей сгущают с помощью двухступенчатого сепарирования до концентрации 15-16% сухих веществ, упаривают в 1,4-1,7 раза и высушивают воздухом, нагретым до 350-450^оС (прототип). Сухая биомасса дрожжей содержит 50-60% сырого протеина, до 5% жиров, 10-20% углеводов, золы и влаги до 10% и широко используется в качестве источника кормового белка.

Наряду с этим, в известном способе выявили и ряд существенных недостатков. Часть протеина микроорганизмов, состоящая в основном из нуклеиновых кислот, не содержит в своем составе аминокислот, имеет невысокую питательную ценность и причисляется к нежелательным балластным веществам. Вместе с небелковыми компонентами нуклеиновые кислоты составляют значительную долю биомассы, что снижает процент аминокислот в продукте и, следовательно, его качество. Нуклеиновые кислоты, удельный вес которых в биомассе микроорганизмов может достигать 20% являются ценным сырьем для химико-фармацевтической и пищевой промышленности. На основе их компонентов: нуклеотидов, нуклеозидов, пуриновых и пиримидиновых оснований получены антиопухолевые и антивирусные препараты, стимуляторы метаболитических процессов, средства для лечения заболеваний крови, сеpдечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта, а также усилителя вкуса и запаха. Однако в процессе производства биомассы микроорганизмов такое сырье в виде дополнительного и экономически весьма выгодного продукта не получают. Нуклеиновые кислоты в составе биомассы без особого эффекта скаpмливают сельскохозяйственным животным и птице.

Цель изобретения повышение качества биомассы и получение дополнительного продукта.

Цель достигается тем, что в способе получения биомассы, включающем выращивание микроорганизмов в жидкой питательной среде и многоступенчатое концентрирование их суспензии в процессе концентрирования экстрагируют нуклеиновые кислоты и/или их компоненты.

Дополнительный продукт представляет собой экстракт или в случае его высушивания концентрат нуклеиновых кислот и/или их компонентов. Вместе с тем, в результате включения в указанный способ операции экстрагирования неожиданно достигают повышения качества биомассы главным образом за счет существенного увеличения в ее составе содержания аминокислот в форме истинного белка.

Предлагаемое техническое решение осуществляют при выращивании и концентрировании на двух и более ступенях суспензий разных микроорганизмов: дрожжей, бактерий, грибов, их ассоциаций, например, активного ила. Жидкую фазу при этом отделяют сепарированием, флотацией, фильтрованием, центрифугированием, осаждением или с помощью их сочетаний. Для интенсификации концентрирования при необходимости агрегируют микроорганизмы физическими, химическими или другими воздействиями, в частности, коагулированием или флокулированием. Экстрагирование проводят на любой из ступеней концентрирования как с применением экстрагентов в виде органических и неорганических соединений, так и без них, например, путем превращения нуклеиновых кислот в водорастворимые компоненты с помощью ферментативной деполимеризации. Наиболее полного отделения экстрагированных нуклеиновых кислот и их компонентов достигают с помощью промывок биомассы. С экономической точки зрения целесообразным является извлечение нуклеиновых кислот из суспензий, содержащих 5-15% сухой биомассы.

П р и м е р 1. Дрожжи Candida maltosa непрерывно выращивают в жидкой питательной среде при скорости протока 0,2 ч^-1, аэрации культуры 80 м³ воздуха в час на м³ среды, температура 34^оС и pH 4,3. В состав среды вводили 1,5 об. очищенных парафинов фракции 240-320^оС в качестве источника углерода, а также сернокислый аммоний, раствор аммиака, суперфосфатную вытяжку, хлористый калий, сернокислое железо и сернокислый магний из расчета на 1л водопроводной воды, г: N 0,9; Р₂O₅0,45; K 0,26; Fe 0,05 и Mq 0,03. Концентрация биомассы в среде равна 1,6% сухих веществ. Суспензию выращенных дрожжей направляют на двухступенчатое сепарирование со скоростью вращения 5,8 тыс. об./мин. После концентрирования биомассы на первой ступени содержание дрожжей в суспензии повышают до уровня 5,6% сухих веществ и осуществляют экстрагирование нуклеиновых кислот и их компонентов. С этой целью сгущенную суспензию подщелачивают едким натрием до pH 8,4, нагревают и выдерживают при 80^оС в течение 15 мин. Проэкстрагированную биомассу подают на вторую ступень сепарирования, где концентрацию дрожжей повышают до уровня 15,1% сухих веществ, затем упаривают в 1,5 раза при 85^оС и высушивают в потоке воздуха, нагретого до 320^оС. Жидкую фазу суспензии микроорганизмов после первой ступени сепарирования сбрасывают в канализацию, а экстракт после второй высушивают в потоке воздуха, нагретого до 135^оС, и получают концентрат нуклеиновых кислот и их компонентов. Характеристики исходной и проэкстрагированной биомассы, а также концентрата приведены в таблице.

П р и м е р 2. Бактерии Methylococcus capsulatus непрерывно выращивают в жидкой питательной среде, содержащей в качестве источника углерода природный газ с 82% метана, а также минеральные соли, г: KH₂PO₄, Na₂HPO₄·7H₂O, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄·7H₂O по 1,6; CaCl₂ 0,0075, FeSO₄·7H₂O 0,005 в 1 л водопроводной воды. Природный газ подают в питательную среду вместе с воздухом в соотношении 1:3 из расчета 50 см³смеси на 1 см³ среды в час. Температура выращивания 32^оС, pH 6,5 и скорость протока 0,1 ч^-1. Концентрация биомассы в среде равна 0,8% сухих веществ. Суспензию выращенных бактерий направляют на четырехступенчатое концентрирование: две ступени сепарирования со скоростью вращения 6,0 тыс об./мин и две ступени фильтрования через мембраны с диаметром пор 0,5 мкм. На первой ступени сепарирования суспензию бактерий сгущают до 3,4% сухих веществ, на второй до 12,9% После второй ступени сепарирования осуществляют экстрагирование нуклеиновых кислот, для чего в сгущенную суспензию вводят хлористый натрий до концентрации 8,5% смесь нагревают и выдерживают при 100^оС в течение 1 ч. Затем суспензию дважды фильтруют до концентрации биомассы 14,9% предварительно добавляя к ней оба раза трехкратный объем воды. Промытую суспензию бактерий после повторного фильтрования сушат в потоке воздуха, нагретого до 250^оС. Экстракт после первого и второго фильтрования объединяют и направляют на коагулирование, выделение и очистку нуклеиновых кислот. Полученные результаты приведены в таблице.

П р и м е р 3. Биомассу бактерий получают в процессе биосинтеза аминокислот. Готовят стерильную питательную среду следующего состава, сахароза 10; кукурузный экстракт 2; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,06; калий фосфорнокислый двузамещенный 0,14; магний сернокислый 0,1; натрий хлористый 0,05; мочевина 0,5; пропинол Б-400 0,1; водопроводная вода остальное. В приготовленную среду вносят 10% посевного материала в виде суспензии Bacillus subtilis с оптической плотностью 0,25. Биосинтез аминокислот, преимущественно смеси триптофана, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, ведут при 37 ± 1^оС, pH 7,4 ± 0,2 и подаче 1,5 ± 0,2 объема воздуха на объем среды в минуту. Через 48 ч биосинтез заканчивают и жидкостной поток с 0,9% взвесью выращенных бактерий и синтезированными аминокислотами направляют на двухступенчатое сепарирование со скоростью вращения 6,0 тыс. об./мин. На первой ступени биомассу сгущают до концентрации 3,2% и на второй до 11,3% после чего сгущенную суспензию подщелачивают едким аммонием до pH 8,3 и выдерживают при 80^оС в течение 10 мин. Биомассу и экстракт разделяют центрифугированием при скорости вращения 4,5 тыс. об./мин. Осадок биомассы сушат при 105^оС до влажности 5,7% и используют в качестве белкового модификатора синтетических полимеров. Экстракт подвергают переработке с целью получения нуклеотидов и нуклеозидов. Жидкую фазу после обеих ступеней сепарирования направляют на ионообменные колонки и последующее получение чистых аминокислот. Характеристики исходной и проэкстрагированной биомассы, а также экстракта приведены в таблице.

П р и м е р 4. Ассоциацию бактерий, дрожжей, грибов и микроводорослей (активный ил) выращивают в процессе биологической очистки сточных вод дрожжевого производства. В полученную суспензию с концентрацией микроорганизмов 0,5% вводят при перемешивании 0,06% FeCl₃· 6H₂O; 0,001% полиакриламида и едкий натрий до pH 8,5. Затем суспензию, обработанную коагулянтом и флокулянтом, фильтруют через мембрану с диаметром пор 1 мкм и по достижении концентрации сухих веществ 11,3% прогревают в течение 15 с при 60^оС, охлаждают и при 39^оС выдерживают в течение 5 ч. На второй ступени концентрирования экстракт с продуктами гидролиза нуклеиновых кислот отделяют центрифугированием со скоростью вращения 4,5 тыс. об./мин. Осадок биомассы сушат при 105^оС до влажности 9,0% Полученные результаты приведены в таблице.

Как видно из примеров, включение в известный способ получения биомассы операции экстрагирования нуклеиновых кислот и их компонентов наряду с отделением ценных веществ в виде их экстракта или концентрата позволило одновременно повысить в основном продукте содержание аминокислот на 6-12% и снизить в 1,5-2,3 раза уровень нуклеиновых кислот.

Использование: микробиологическая промышленность, производство биомассы микроорганизмов. Сущность изобретения: способ, включающий выращивание микроорганизмов в жидкой питательной среде и многоступенчатое концентрирование их суспензии, дополнен операцией экстрагирования нуклеиновых кислот и их компонентов. В биомассе микроорганизмов при использовании предлагаемого технического решения содержание аминокислот в форме истинного белка повышали на 6 - 12%. Получаемый экстракт содержит 9 - 38% нуклеиновых кислот и их компонентов. 8 з. п. ф-лы, 1 табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ, включающий выращивание микроорганизмов в жидкой питательной среде и следующее за ним многоступенчатое концентрирование их суспензии, отличающийся тем, что в процесс концентрирования экстрагируют нуклеиновые кислоты и/или их компоненты. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве суспензии микроорганизмов концентрируют суспензию дрожжей Candida maltosa сепарированием на первой и второй ступенях и упариванием на третьей. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве суспензии микроорганизмов концентрируют бактерии Methylococcus capsulatus сепарированием на первой и второй ступенях и фильтрованием на третьей и четвертой. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве суспензии микроорганизмов концентрируют бактерии Bacillys subtilis сепарированием на первой и второй ступенях и центрифугированием на третьей. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве суспензии микроорганизмов концентрируют ассоциацию бактерий, дрожжей, грибов и микроводорослей - активный ил - фильтрованием на первой стадии и центрифугированием на второй. 6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты и/или их компоненты экстрагируют после первой ступени концентрирования при рН 8,4, температуре 80^oС и экспозиции 15 мин. 7. Способ по п. 3, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты и/или их компоненты экстрагируют после второй ступени концентрирования при концентрации хлористого натрия в суспензии 8,5%, температуре 100^oС и экспозиции 1 ч. 8. Способ по п. 4, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты и/или их компоненты экстрагируют после второй ступени концентрирования при рН 8,3, температуре 80^oС и экспозиции 10 мин. 9. Способ по п.5, отличающийся тем, что перед концентрированием микроорганизмы агрегируют коагулянтом и флокулянтом и нуклеиновые кислоты и/или их компоненты экстрагируют 5 ч при 39^oС после нагревания суспензии 15 с при 60^oС.