СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1999 года по МПК A23J1/18 C12N1/06 A23L1/28 A61K35/66 A61K35/72 C12N1/06 C12R1/00 

Изобретение относится к микробиологической, медицинской, пищевой и комбикормовой промышленности и может быть использовано при микробиологическом синтезе целевых продуктов и их вторичной переработке, для повышения биологической ценности микробной биомассы, получения пищевых и вкусовых добавок, производства фармацевтического сырья и лекарственных препаратов.

Известен способ получения биологически активных веществ (БАВ) путем нагревания дрожжевой суспензии до температуры 60-100^oC последовательно в нейтральном, щелочном и кислом водных экстрагентах с последующим осаждением из объединенных экстрактов белков в изоэлектрической точке и их высушиванием (1). Недостатками способа являются высокая ресурсозатратность за счет трехкратного подогревания и сепарации, а также низкий выход аминокислот вследствие термоинактивации протеаз.

Известен способ получения биологически активных веществ, предусматривающий разрушение клеток замораживанием-оттаиванием и экстракцию БАВ, с целью повышения их выхода, последовательно изопропиловым спиртом и щелочным водным раствором (2). Недостатками способа являются необходимость очистки получаемых продуктов от химического экстрагента и нерациональное использование сырья.

Наиболее близким к данному изобретению является способ получения биологически активных веществ, предусматривающий двукратное замораживание клеточной массы до температур (-16)-(-40)^oC В течение 0,5-2,0 ч и (-5)-(-15)^oC в течение 1,0-7,0 ч, последующее оттаивание, двукратную экстракцию водой в течение 3-120 мин каждая при подогревании до температуры 50-100^oC, отделение от экстрактов остатков клеток, концентрирование объединенных экстрактов и их высушивание (3).

К недостаткам указанного способа относятся: 1) высокая энергоемкость процесса, обусловленная необходимостью создания длительного гетеротермического режима; 2) повышение трудоемкости и удорожание процесса из-за загрузочно-разгрузочных работ при трехкратной сепарации (цетрифугировании); 3) узкий ассортимент продукции, что снижает рентабельность производства; 4) опасность инфицирования конечного продукта, в том числе патогенной микрофлорой, ввиду ведения процесса без создания асептических условий.

Сущность изобретения состоит в том, что биомассу микроорганизмов замораживают при температуре (-4)-(-50)^oC, затем размораживают для разрушения клеточных мембран и суспендируют в водопроводной воде до содержания массы сухих клеток 3-20%. К суспензии добавляют антисептик или консервант пищевого или кормового достоинства для предотвращения заражения посторонней микрофлорой. В суспензию вносят ингибитор нуклеодеполимераз при получении высокомолекулярных нуклеиновых кислот, или стабилизаторы протеаз и автолизинов при получении белковых продуктов, или смеси низкомолекулярных пептидов и нуклеотидов. Суспензию подогревают и выдерживают при температуре 40-58^oC, при поддержании pH 4,5-8,0 и перемешивании в течение 1-2 ч. Затем суспензию плазмолизируют при температуре 90-100^oC в течение 0,5-1,0 ч, разделяют экстракт и остатки клеток сепарацией или центрифугированием, или ультрафильтрацией, или седиментацией и высушивают раздельно любым из известных способов или концентрируют до состояния пасты.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Прессованные дрожжи Saccharomyces cerevisiae с содержанием массы сухих клеток (МСК) 25% замораживают при температуре (-4)^oC, выдерживают 30 мин, размораживают и суспендируют в водопроводной воде до содержания МСК 13%. В суспензию вносят в качестве антисептика-консерванта 5н-метилрезорцин в количестве 0,05% (в/об), а в качестве ингибитора нуклеодеполимераз фосфат-ионы в количестве 0,15 М. Суспензию нагревают до температуры 56(±2)^oC и выдерживают в течение 4 ч при периодическом перемешивании и поддержании pH 6,5- 7,0. Затем суспензию плазмолизируют в течение 1 ч при температуре 90-100^oC. Экстракт (жидкая фаза) и остатки клеток разделяют сепарированием и высушивают по отдельности на распылительной сушилке.

Показатели выхода БАВ из клеток в экстракт (в % к исходной МСК): растворимого белка (Б) - 30,3%; аминокислот (АК) - 6,4%: нуклеотидов (НК) - 0,53%. В твердофазной части (в % от исходной): МСК - 40,1%; белка (Б) - 25,3%.

Сухой экстракт (продукт с товарным названием "Александрина - идеал"), полученный вышеописанным способом - порошкообразный продукт светло-кремового цвета, приятного вкуса, без запаха, обогащен полипептидами с минимальным содержанием нуклеотидов. Предназначен для использования в качестве пищевой добавки для балансирования питательной ценности разнообразных пищевых продуктов. Продукт из твердофазной части характеризуется высоким содержанием легко усваиваемого белка (до 50% от общего клеточного) предназначен для использования в качестве белково-витаминной добавки (БВД) в составе комбикормов для с/х животных, птицы, а также пушных зверей.

Пример 2.

Технология получения БАВ аналогична приведенной в примере 1, но замораживание дрожжей проводят при температуре (-50)^oC, время прогревания суспензии сокращают до 2 ч, и с целью повышения экстрактивной способности среды в нее вносят NaCl в качестве 0,6% (в/об). Состав экстрактивной части (в % от исходной МСК): растворимого белка - 24,5%, аминокислот - 8,8%, нуклеотидов - 0,47%. В твердофазной части остатки клеток составляют 54,0% от исходной МСК.

Пример 3.

Технология получения БАВ аналогична приведенной в примере 1, но ингибитор нуклеодеполимераз не добавляют. В качестве стабилизатора протеаз и автолизинов в суспензию вносят MgCl₂ и CaCl₂ в количестве 0,05%, а также NaCl в количестве 0,4% для повышения экстрактивности среды. Состав экстрактивной части (в % от исходной МСК): растворимого белка - 34,3%, аминокислот - 9,2%, нуклеотидов - 0,97%. Продукт используют в качестве вкусовых добавок к пищевым продуктам.

Пример 4.

Технология получения БАВ аналогична приведенной в примере 3, но в суспензию не вносят NaCl с цепью снижения зольности продукта, а для повышения выхода низкомолекулярных веществ прогретую до температуры 50(±2)^oC суспензию выдерживают при pH 4,5 в течение 2 ч, затем подщелачивают до pH 8,0 и выдерживают при той же температуре еще 6 ч. Состав экстрактивной части (в % от исходной МСК): растворимого белка - 36,3%, аминокислот -19,4%, нуклеотидов - 1,65%. Продукт используют в качестве источника белка или факторов роста в составе микробиологических питательных сред.

Пример 5.

Прессованные дрожжи S. cerevisiae замораживают при температуре (-15)^oC, размораживают и суспендируют в водном 0,25 М растворе фосфатов до содержания МСК 20%. В суспензию вносят антисептик, нагревают до температуры 40^oC и выдерживают при pH 8,0 в течение 1 ч, затем суспензию плазмолизируют при температуре 90^oC в течение 0,5 ч. Клетки отделяют от экстракта сепарированием и высушивают на распылительной сушилке. Полученный твердофазный продукт - клетки, используют в качестве сырья для получения полинуклеотидов и нуклеотидов медицинского назначения.

Экстракт упаривают в вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ 8-10%, добавляют к нему равный объем молочной сыворотки и высушивают или упаривают до состояния густой пасты. Полученный продукт используют как комбинированную белково-углеводную добавку к пищевым (кондитерским) продуктам.

Пример 6.

Дрожжи S. cerevisiae обрабатывают как и в примере 2, но в суспензию вносят не только фосфаты и NaCl, но также MgCl₂ и CaCl₂ в количестве 0,025% и прогретую суспензию выдерживают в течение 3 ч. Полученные после сепарации остатки клеток последовательно обрабатывают растворами додецилсульфата, (1%) NaOH (5%), HCl (7%) для удаления остатков внутриклеточных биополимеров. Затем полученные клеточные стенки промывают водой и высушивают. Полученный продукт используют в качестве сорбента тяжелых металлов и ксенобиотиков в процессах приготовления соков и виноматериалов.

Пример 7.

Технология обработки дрожжей Candida guilliermondii аналогична приведенной в примере 2, но в суспензию дополнительно вносят в качестве стабилизаторов протеаз MgCl₂ и CaCl₂ в количестве 0,025%, для ингибирования нуклеодеполимераз добавляют фосфаты в количестве 0,25 М. После плазмолиза не разделяют экстракт и твердую фазу, а высушивают их вместе. Состав полученного продукта (в % к сухому весу): растворимого белка - 23,3%, аминокислот - 6,3%, нуклеотидов - 0,61%. Продукт используют в качестве белково-витаминной добавки в составе кормов для с/х животных, птицы, и пушных зверей.

Пример 8.

Технология получения БАВ аналогична приведенной в примере 3, но в качестве сырья используют 3% суспензию бактерий, выращенных на метане Metnylococcus capsulatus. Состав экстрактивной части (в % от исходной МСК): растворимого белка - 36,3%, аминокислот - 10,3%, нуклеотидов - 0,92%. Полученный продукт используют в качестве белковой основы или факторов роста в составе микробиологических питательных сред. Остатки клеток, содержащие до 50% клеточного белка, используют как кормовую белковую добавку.

Пример 9.

Технология получения БАВ аналогична приведенной в примере 7, но в качестве сырья используют 8% суспензию водородокисляющих бактерий Pseudomonas carboxydoflava. Показатели продукта (в % к сухому весу): растворимый белок - 22,2%, аминокислоты - 7,4%, нуклеотиды - 0,53%. Полученный продукт используется как белковая добавка в составе кормов.

Применение предлагаемого способа получения БАВ по сравнению с известным позволяет:
- снизить энергозатраты за счет одноразового замораживания-оттаивания биомассы;
- снизить общие трудозатраты за счет сокращения технологических операций по разделению жидкой и твердой фаз с трех до одного;
- повысить эффективность производства за счет расширения ассортимента продуктов, включающего в экстрактивной части растворимые БАВ, обогащенные либо лимитированные нуклеотидами, а в твердофазной части - легкоусваиваемый белок кормового назначения или сырье для получения высокомолекулярных нуклеиновых кислот, нуклеотидов и (или) модифицированных клеточных стенок;
обеспечить стерильность производства и избежать опасности инфицирования обрабатываемой биомассы посторонней микрофлорой, в том числе патогенной, за счет введения в инкубационную среду консерванта пищевого или кормового достоинства.

Список литературы
1. Патент Франции N 2363996, кл. A 23 J 1/18, 1979.

2. Авторское свидетельство СССР N 1034688, кл. A 23 J 1/18, 1979.

3. Патент Российской Федерации N 2003262, кл. A 23 J 1/18, A 61 К 35/66, 35/78, 1993.

Изобретение относится к микробиологической, медицинской, пищевой и комбикормовой промышленности и может быть использовано при микробиологическом синтезе целевых продуктов и их вторичной переработке для повышения биологической ценности микробной биомассы, получения пищевых и вкусовых добавок, производства фармацевтического сырья и лекарственных препаратов. Биомассу микроорганизмов замораживают, размораживают, суспендируют в воде до содержания массы сухих веществ 3 - 20%, добавляют консервант и ингибитор нуклеодеполимераз или стабилизаторы протеаз и автолизинов, подогревают до 40 - 58^oC, выдерживают при этой температуре, pH 4,5 - 8,0 в течение 1 - 8 часов, затем плазмолизируют, разделяют экстракт и остатки клеток и высушивают. В качестве ингибитора нуклеодеполимераз используют фосфаты в количестве 0,15 - 0,25%, в качестве стабилизатора используют MgCl₂ и CaCl₂ в количестве 0,025 - 0,05%. В суспензию целесообразно добавлять NaCl в количестве 0,4 - 0,6%. Применение способа позволяет снизить энерго- и трудозатраты, повысить эффективность способа, обеспечить стерильность производства. 4 з.п.ф-лы.

1. Способ получения биологически активных веществ, предусматривающий замораживание-оттаивание биомассы микроорганизмов, приготовление суспензии клеток в воде, нагревание, выдерживание нагретой суспензии с последующим получением целевого продукта, отличающийся тем, что замораживание проводят однократно при температуре (-4) - (50)^oC, суспензию готовят с массой сухих клеток 3 - 20%, добавляют консервант пищевого или кормового достоинства и ингибиторы или стабилизаторы внутриклеточных деполимераз, нагревание суспензии осуществляют до 40 - 58^oC и выдерживают при этой температуре, pH 4,5 - 8,0 и перемешивании в течение 1 - 8 ч, затем плазмолизируют в течение 0,5 - 1 ч при 90 - 100^oC, а целевой продукт получают в виде экстракта и/или остатков клеток. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракт и остатки клеток раздельно высушивают или концентрируют. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении целевого продукта, содержащего высокомолекулярные нуклеиновые кислоты, а также микробного белка пищевого или кормового назначения в качестве ингибитора нуклеодеполимераз добавляют фосфаты в количестве 0,15 - 0,25%. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении целевого продукта в виде экстракта, содержащего смесь низкомолекулярных пептидов и нуклеотидов, в качестве стабилизатора внутриклеточных деполимераз - протеаз и автолизинов - в суспензию вносят MgCl₂ и CaCl₂ в количестве 0,025 - 0,05%. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в суспензию биомассы дополнительно вносят NaCl в количестве 0,4 - 0,6%.