СПОСОБ ОЧИСТКИ И СТЕРИЛИЗАЦИИ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ВИРУСА ЯЩУРА Российский патент 1996 года по МПК C12N7/02 A61K39/135 

Изобретение относится к вирусологии, а более конкретно к способам очистки вирусных суспензий от балластных белков и жиров, и может быть использовано при изготовлении биологических средств специфической профилактики и диагностики ящура у сельскохозяйственных животных.

Известные способы очистки вируссодержащих суспензий подразделяются на три группы физические, химические и физико-химические с использованием хлорированных и фторированных углеводородов в двухфазных системах полимеров [1]
Недостатком указанных методов является или низкая производительность, или высокая сложность исполнения; или незначительная степень очистки.

Известен способ очистки культурального вируса ящура от балластных белков и жиров с помощью флокулянта полиглюкина, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,7-1,0% [2]
Недостаток данного способа состоит в его низкой эффективности, так как в вируссодержащей суспензии после ее обработки полиглюкином остается значительное количество балластных веществ, которые придают вакцине нежелательную аллергенность.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату при использовании является способ очистки вируса ящура, репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, путем обработки вируссодержащей суспензии органическим растворителем хлороформом, который добавляют в объеме 2% от количества суспензии при постоянной работе мешалки и центробежного насоса, и последующего удаления денатурированных белков и жиров центрифугированием или сепарированием [3]
Способ-прототип имеет следующие недостатки:
1) низкое качество очистки вируссодержащей суспензии от балластных веществ, так как эффективность очистки зависит от количества добавляемого хлороформа и степени его эмульгирования в суспензии;
2) обработка суспензии хлороформом не устраняет обсемененности суспензии микрофлорой;
3) хлороформ обладает высокой летучестью и токсичностью, поэтому работа с хлороформом опасна и вредна для обслуживающего персонала;
4) хлороформ является экологически вредным препаратом.

В задачу создания настоящего изобретения входил поиск химического препарата, позволяющего повысить экологичность и эффективность способа очистки от балластных веществ промышленных объемов суспензии культурального вируса ящура с одновременной инактивацией контаминирующей суспензию микрофлоры и сохранением антигенных и иммуногенных свойств вируса ящура.

Поставленная задача решена тем, что в известном способе стерилизующей очистки культурального вируса ящура, включающем добавление в вирусную суспензию флокулянта и последующее отделение флокулированных балластных веществ в соответствии с изобретением в качестве флокулянта используют полигуанидин (ПГ) в конечной концентрации 0,005-0,03%
Для стерилизующей очистки суспензии культурального вируса ящура используют препараты ПГ мол.м. 20000-30000Д и 30000-100000Д, полученные из института нефтехимического синтеза АН СССР от П.А.Гембицкого и Покровского завода биопрепаратов.

ПГ-препарат эмпирической формулы (С₇Н₁₆N₃CI)_n, выпускаемый промышленностью под торговой маркой "Полисепт", представляет собой водорастворимый полимерный продукт, который благодаря качествам катионного электролита в сочетании с полимерностью, а также наличию полярной гуанидиновой и неполярной гексаметиленовой группировкам, придающим адгезивные и поверхностно-активные свойства, имеет широкий спектр применения в народном хозяйстве. ПГ обладает высокой бактерицидной и фунгицидной активностью. Растворы препарата в 0,05%-ной концентрации вызывают гибель грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в течение 5-25 мин. ПГ является абсолютно безопасным для здоровья людей и животных и экологически безвредным для окружающей среды.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ отличается тем, что в качестве флокулянта используют ПГ в конечной концентрации 0,005-0,03%
Указанные отличия являются существенными, так как они достаточны во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

В результате проведенных исследований впервые установлены новые свойства ПГ: в используемых концентрациях он не разрушает вирус, флокулирует балластные белки и жиры. Новые свойства ПГ использованы для очистки вируссодержащей суспензии с одновременной инактивацией контаминирующей суспензию микрофлоры и сохранением исходных биологических свойств вируса ящура, что позволяет повысить экологичность предлагаемого способа и качество очистки.

Признаки, отличающие предлагаемый способ от прототипа, не выявлены в других известных решениях при изучении данной и смежных областей знаний.

Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый способ, достигается технический результат, указанный в задаче создания изобретения, что подтверждено результатами многочисленных исследований, сведения с которых приведены ниже.

П р и м е р 1. По окончании культивирования вируса ящура А₂₂ в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в рубашку реактора подают хладагент.

Одновременно в вируссодержащую суспензию, стерильную или контаминированную микрофлорой, добавляют при перемешивании 5 или 10%-ный водный раствор ПГ рН 7,6-8,0 до конечной концентрации 0,005%
При обработке ПГ вируссодержащей суспензии объемом до 10 л перемешивание осуществляют вручную в течение 5 мин.

В этом случае флокулированные балластные белки отделяют в центрифуге в течение 20 мин при 1000 g. При объеме вируссодержащей суспензии до 2000 л перемешивание последней после добавления ПГ проводят с помощью мешалки реактора в течение 20 мин. После охлаждения вируссодержащей суспензии до 4-10^оС отделяют флокулированные балластные белки и микробные клетки центрифугированием, сепарированием или отстоем.

Для центрифугирования вируссодержащей суспензии используют проточную центрифугу ОТР-101К-01. Режим центрифугирования 200-300 л/ч. Для сепарирования используют сепаратор фирмы Альфа-Лаваль. Режим сепарирования 1000 л/ч. Длительность отстоя зависит от объема суспензии и определяется индивидуально для каждого случая. Очищенную таким образом вируссодержащую суспензию проверяют на количество балластных веществ, стерильность, инфекционность и компонентный состав вируса.

П р и м е р 2. Очистку вируса ящура А₂₂, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что 5 или 10%-ный водный раствор ПГ добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,01%
П р и м е р 3. Очистку вируса ящура А₂₂, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что 5 или 10%-ный водный раствор ПГ добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,03%
П р и м е р 4. Очистку вируса ящура О₁, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1.

П р и м е р 5. Очистку вируса ящура О₁, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 2.

П р и м е р 6. Очистку вируса ящура О₁, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 3.

П р и м е р 7. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 1 или 4.

П р и м е р 8. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 2 или 5.

П р и м е р 9. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 3 или 6.

Эффективность предлагаемого способа в сравнении с прототипом подтверждены результатами многочисленных экспериментов, сведения о которых представлены в табл. 1-6.

В опытах использовали 5 или 10%-ные водные растворы ПГ, рН которых устанавливали раствором уксусной кислоты или аммиака в пределах 7,6-8,0.

Исследования по обработке суспензии культурального вируса ящура различными образцами ПГ показали, что с увеличением молекулярной массы возрастала флокулирующая активность препарата в отношении нерастворенной взвеси и растворенных балластных белков. При самоосаждении флокул или при отделении их с помощью центрифугирования надосадочная жидкость становилась более прозрачной.

Предлагаемый способ очистки испытан в лабораторных и промышленных условиях. При этом определяли количество балластного белка, титр инфекционности вируса, стерильность очищенной суспензии, количество 146S компонента и иммуногенную активность вируса в составе адсорбатвакцины.

Содержание растворенного балластного белка в неочищенной суспензии, а также в суспензиях, обработанных ПГ и хлороформом, определяли по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям бычьего сывороточного альбумина. Оптическую плотность образцов суспензии измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм.

Инфекционность вируса в суспензии до и после очистки определяли методом бляшек на культуре клеток свиной почки. Наличие и количество бактериальной и грибковой микрофлоры определяли по методу высевом суспензии и ее разведений на среды МПА, МППБ, тиогликолевую среду и агар Сабуро. Анализ компонентного состава вируса ящура после его обработки хлороформом или ПГ проводили спектрофотометрическим методом. Очищенный предлагаемым способом вирус инактивировали 0,03% концентрацией аминоэтиленимина в течение 24 ч при 27-28^оС. Авирулентность инактивированного вируса проверяли, инфицируя монослой клеток свиной почки неразведенной суспензией вируса. Целостность монослоя и отсутствие цитопатических изменений подтверждали авирулентность инактивированного препарата вируса. Иммуногенную активность вируса проверяли в составе адсорбатвакцины с сапонином. Иммуногенность вакцин определяли по 50% иммунизирующей дозе для взрослых белых мышей массой 18-22 г, которую вычисляли согласно формуле Кербера-Ашмарина. Опыты проводили с использованием суспензии вируса ящура типа А, О₁ и Азия-1, контаминированной микрофлорой. Результаты исследований представлены в табл. 1-6.

В результате проведенных исследований установлено, что количество растворенного балластного белка в суспензиях, обработанных ПГ м.м. 20000-30000Д и ПГ м. м. 30000-100000Д отличается между собой незначительно, но суспензии вируса, очищенные ПГ м.м. 20000-30000Д, содержат мелкую взвесь белковых флокул. Низкоскоростное центрифугирование и сепарирование не удаляет такую взвесь и очищенные суспензии обладают слабой прозрачностью. ПГ м. м. 30000-100000Д вызывает образование более крупных белковых флокул, обеспечивающих получение прозрачных суспензий при центрифугировании и сепарировании.

В табл. 1 показаны результаты обработки вируссодержащей суспензии ПГ в концентрации 0,005-0,030% Использование меньшей концентрации ПГ, а именно 0,0025% для очистки вирусной суспензии не позволяет получить удовлетворительное качество очистки суспензии. Увеличение концентрации ПГ в суспензии свыше 0,03% приводит к значительным потерям вируса. Наблюдается снижение титра инфекционности вируса и количества 146S компонента вируса. В табл. 1 показано, что обработка суспензии вируса ящура ПГ позволяет уменьшить количество растворенных балластных белков на 23% по сравнению с неочищенной суспензией, а обработка суспензии хлороформом лишь на 14%
В табл. 2 показано, что контаминированные микрофлорой суспензии вируса ящура после 5-часового контакта с ПГ в концентрации 0,01% а также после 20-часового контакта с ПГ в концентрации 0,005% при исследовании были стерильными.

В табл. 3 показано, что инфекционность вируса ящура типа А, О и Азия-1 в образцах очищенной ПГ суспензии оставалась на прежнем уровне.

В табл. 4 показано, что количество 146S компонента вируса ящура в суспензии, очищенной ПГ, не отличалось от такового при обработке суспензии 2% хлороформа.

В табл. 5 показано, что иммуногенность вакцин из вируса ящура, обработанного ПГ, была равной 0,03 мл для типа А и 0,18-0,22 для типа О и не уступала активности вакцин из вируса, обработанного хлороформом.

Данные табл. 6 показывают стабильность иммуногенных свойств культурального вируса ящура А и О типов в течение 6-12 мес при хранении вакцины при 4-8^оС.

Таким образом, предложен способ стерилизующей очистки культурального вируса ящура, использование которого обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества:
1. Количество растворенного белка в очищенной суспензии снижается в 1,6 раза.

2. Исключается выбраковка вируссодержащей суспензии, контаминированной микрофлорой в период репродукции вируса.

3. Исключается использование антибиотиков в период репродукции вируса и при составлении вакцины.

4. Технологический цикл получения очищенной суспензии культурального вируса ящура сокращается по времени на 1-1,5 ч и не требует оборудования для интенсивного эмульгирования хлороформа в суспензии вируса, например, насосов центробежного типа.

5. Замена хлороформа на ПГ при очистке вируссодержащей суспензии делает эту операцию безвредной для обслуживающего персонала, а технологию производства вакцин более экологически чистой.

6. Благодаря снижению концентрации балластного белка, отсутствию антибиотиков и микрофлоры уменьшается аллергенность и реактогенность вакцины.

Предлагаемый способ найдет промышленное применение при изготовлении средств специфической профилактики ящура сельскохозяйственных животных.

Использование: при приготовлении биологических средств специфической профилактики и диагностики ящура. Сущность применения: в суспензию культурального вируса ящура добавляют при перемешивании 5-или 10-%-ный водный раствор флокулянта полигуанидина до конечной концентрации 0,005 - 0,03%, pH 7,6 - 8,0; флокулированные балластные белки отделяют центрифугированием, сепарированием или отстоем. 6 табл.

СПОСОБ ОЧИСТКИ И СТЕРИЛИЗАЦИИ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ВИРУСА ЯЩУРА, включающий добавление в вирусную суспензию флокулянта и последующее отделение флокулированных балластных веществ, отличающийся тем, что в качестве флокулянта используют полигуанидин в конечной концентрации 0,005 - 0,03%.