ШТАММ № 1737/ГРУЗИЯ/2000 ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1 ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к штаммам вируса ящура, которые могут быть использованы в качестве продуцентов специфических антигенов при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов.

Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на 35-40%.

Вирус ящура относится к роду афтовирусов, семейству пикорнавирусов. Он имеет 7 иммунологических типов и значительное количество подтипов (1,2).

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной изменчивостью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. В последние годы считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, образующих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться от незначительных отличий между штаммами, которые улавливают только с помощью тонких методов молекулярного анализа, до появления совершенно отличающихся штаммов, которые требуют использования средств для серологической диагностики и специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами (2,3).

Известны штаммы вируса ящура типа Азия-1, которые регистрировались на территории СССР: в Армении в 1973 и 1984 гг., в Таджикистане в 1974 г., в Туркмении в 1978 г. и в Грузии в 1984 и 2000 гг., при этом изоляты, выделенные в этих регионах, значительно отличались от производственного штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 (R составляло 35-58%).

Применяемая на этих территориях в плановом порядке с профилактической и вынужденной целью вакцина из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 обеспечивала недостаточно удовлетворительную защиту иммунизированных животных и не предотвратила распространение ящура.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является производственный штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 48, который выделен в феврале 1964 года на территории Московского района Таджикской ССР. Заболевание, вызванное этим возбудителем, спорадически регистрировалось на территории СССР до 1966 года. Указанный штамм был адаптирован к организму мышат-сосунов, 1-2-дневных крольчат и морских свинок, к культуре клеток СП в течение 10-12 пассажей и накапливался в титре 7,5 Ig ЛД₅₀/мл, 7,0-8,0 Ig ЛД₅₀/мл, 5,0 Ig ИД₅₀/мл и 5,0-6,0 Ig ТЦД₅₀/мл соответственно. По антигенному соответствию этот штамм отличался от эталонных вариантов этого типа: "Пакистан"1/54 и "Израиль"3/63 (4,5).

Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 48 вируса ящура имеет следующие характеристики, представленные в табл.1.

Недостатки производственного штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности. Вакцина из этого штамма обеспечивает защиту против заражения гомологичным вирусом. Однако в последние годы на территории некоторых государств Ближнего Востока, Центральной Азии и Закавказья были зарегистрированы вспышки ящура, вызванные штаммами вируса, отличающимися от производственного штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 по показателям серологического родства.

Так, в 1999-2000 гг. этот возбудитель регистрировался в Турции, Иране, Грузии и др. странах.

Во ВНИИЗЖ лабораторными исследованиями афтозного материала, выделенного от больного крупного рогатого скота в Богдановском районе Грузии, был установлен штамм вируса ящура серологического типа Азия-1, имеющий антигенные отличия от производственного штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 в РСК (R=32%). Это свидетельствует о несоответствии используемых средств специфической профилактики и диагностики ящура серологического типа Азия-1, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в 2000 году в странах Закавказья, Центральной Азии и Ближнего Востока (Грузия, Турция, Иран).

В связи с этим назрела необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серологического типа Азия-1 для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса ящура серологического типа Азия-1, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся в странах Закавказья, Центральной Азии и Ближнего Востока.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серологического типа Азия-1, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодных для изготовления средств специфической профилактики и диагностики ящура типа Азия-1, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья, Центральной Азии и Ближнего Востока.

Указанный технический результат достигнут получением штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП. Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП выделен в июле 2000 года в Богдановском районе Грузии от больного крупного рогатого скота. Производственный штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации 26 января 2001 г. под регистрационным наименованием: штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП.

По сравнению с прототипом штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины. Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих проводить серологическую диагностику изолятов вируса ящура серологического типа Азия-1, вызывающих вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии и Ближнего Востока, и противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на:
фиг. 1. представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП;
фиг. 2 изображена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа Азия-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА и РН. При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным антигеном индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:90-1:180 и в ИФА в разведении 1:5000-1:6000.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП и из нее выведена первичная структура белка VP1 (фиг.1). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП значительно отличается от российского вакцинного штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 и имеет очень близкое филогенетическое родство с эпизоотическими изолятами Иран/1999 и Турция/1999 (фиг.2). Гомология нуклеотидных последовательностей штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000 и штаммов вируса ящура серологического типа Азия-1 48 и Иран/1999 составила соответственно 86,31% и 98,87%.

Близкородственные штамму вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП вирусы были выделены в Армении в 2000 г. и в Грузии в 2001 г.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП принадлежит к новой генетической линии вируса ящура серологического типа Азия-1. Вирусы, принадлежащие к этой генетической линии, циркулируют на территории Центральной Азии и Ближнего Востока, начиная со второй половины 90-х годов.

Антигенное родство штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП с производственным штаммом вируса ящура серологического типа Азия-1 48 и штаммами, ранее выделенными на территории Ирана, Пакистана и других стран, изучено в РСК. Результаты этих исследований представлены в табл. 2. Результаты, приведенные в табл.2, свидетельствуют о том, что штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП идентичен штамму вируса ящура типа Азия-1/Иран/58/99 и отличается от всех вышеуказанных штаммов вируса ящура типа Азия-1.

Биотехнологические характеристики
Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус ящура серологического типа Азия-1 штамма 1737/Грузия/2000-ДЕП репродуцируется в монослойных культурах первично-трипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) IBRS-2, ВНК-21, и в течение 22-24 ч инкубирования накапливается до 7,2-8,2 Ig ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 ч. После 3-5 пассажей инкубирования накапливается до 6,2-8,2 Ig ТЦД₅₀/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7•10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,8•10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства
Масса вириона 8,4•10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам
Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, крольчат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа Азия-1.

Для снижения его эпизоотической опасности необходимо обеспечить своевременную лабораторную диагностику и вакцинопрофилактику вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антительные и антигенные диагностикумы и вакцина, полученные с использованием данного штамма в качестве производственного.

По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1
Штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ 11.07.2000 г. в виде эпителия афт от КРС, подозреваемого в заболевании ящуром. При проведении лабораторной диагностики этого заболевания был установлен вирус ящура типа Азия-1. При изоляции вируса был использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов. Указанные методы включали интрадермолингвальную инокуляцию материала полевого изолята КРС (1 пассаж) и последующую адаптацию вируса, выделенного от заболевшего животного, к культурам первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IBRS-2 и ВНК-21. Первичные и перевиваемые культуры клеток для постановки биопробы выращивали на соответствующих питательных средах во флаконах емкостью 50 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной на растворе Хенкса с 0,5% ГЛА и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом (10%). После 30-минутного инкубирования при +37^oС во флаконы вносили по 8-10 мл поддерживающей среды и инкубировали при +37^oС до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ВНИИЗЖ.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в табл.3.

Данные, приведенные в табл.3, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура, везикулярного стоматита с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в табл.4.

Данные, приведенные в табл.4, свидетельствуют о том, что в материале экспертизы 1737 выявлен комплементсвязывающий антиген вируса ящура типа Азия-1 в разведении 1:2.

Пример 2
Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП, репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% раствора полигексаметиленгуанидина (ПГМГ). Очищенный вирус концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,01-0,05% рН 7,8-8,0.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта вводят морским свинкам в объеме 1 мл внутримышечно. Спустя 21 день иммунизацию повторяют и через 10 дней животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК. После этого готовят серию путем смешивания типоспецифических индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при +4^oС в течение 25-30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 0,5-1 мл.

Была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в табл.5.

Данные, приведенные в табл.5, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3
Для получения антигена для иммунохимических реакций используют штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и ВНК-21. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10%-ной суспензии афт КРС. Адаптацию проводят в течение 5 последовательных пассажей. Полученную матричную расплодку вируса используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Полученную вируссодержащую жидкость концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют прогреванием при +58^oС в течение 40 мин, фасуют в ампулы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом было приготовлено 2 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в табл.6.

Результаты исследований, приведенные в табл.6, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 4
Для изготовления адсорбат-вакцины штамм вирус ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,01-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре 35-36,5^oС. Через 8-10 ч инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то инкубирование продолжают еще 1-3 ч. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S+75S компонентов. Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20% раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 ч при 36-37^oС и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 ч в течение 3-5 мин. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до 4-8^oС. В охлажденную суспензию добавляют 10% раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка и 146S+75S компонентов вируса, стерильность. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем ГОА.

Расчетный объем геля ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 мин. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/мл, р<0,01, n=10, a концентрация 146S+75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 2,0 мкг/мл. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации, по меньшей мере, 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТу 28085-89 "Препараты биологические. Метод биологического контроля стерильности".

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 мл, затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

В табл. 7, 8, 9 и 10 отражены результаты культивирования штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП и штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 в культиваторах КС-40 и KM-2000, из которых следует, что штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП имеет более короткий срок репродукции, что обусловило необходимость выбора оптимальных условий культивирования вируса и множественности дозы заражения.

В табл.11 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные компоненты штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП и штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48. Приведенные в табл.11 данные свидетельствуют о том, что иммуногенные компоненты нового штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП не уступает в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства иммуногенным компонентам штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48. Особенно важен тот факт, что в процессе инактивации и очистки вирусной суспензии, содержащей штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП, не произошло изменений в количестве 146S+75S компонентов, полученных при репродукции вируса.

Пример 5
Проведены сравнительные испытания на морских свинках иммуногенной активности противоящурной сорбированной культуральной вакцины из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП и противоящурной сорбированной культуральной вакцины из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48 (прототип).

Для определения иммуногенной активности каждого препарата использовали по 40 морских свинок, при этом по 8 голов каждой группы животных были контрольными. Вакцины разбавляли фосфатным буферным раствором в соотношении 1:3; 1: 9; 1: 27 и 1:81. На каждое разведение вакцин брали по 8 морских свинок. Каждую группу из 8 свинок содержали в отдельном вольере, на котором закрепляли этикетку с указанием серии вакцины, ее разведения, даты начала испытаний и количества морских свинок, привитых данным разведением.

Каждую вакцину вводили 4 группам морских свинок внутримышечно в объеме 2 см³ в область правого и левого бедра по 1 см³. Невакцинированные группы морских свинок использовали для проверки активности контрольных серотипов вируса ящура.

За вакцинированными свинками вели наблюдение в течение 15-17 суток. После этого всех привитых и контрольных животных заражали адаптированным к ним вирусом ящура, гомологичным вакцинному, интрадермально в плантарную поверхность одной из задних лапок в дозе 10⁴ГД₅₀/0,1 см³. Учет результатов заражения проводили через 3, 5 и 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса на передних и одной задней лапках. Генерализацией считали образование вторичных афт хотя бы на одной лапке, в которую не вводили вирус. Контроль вакцины считали действительным, если из 8 невакцинированных свинок генерализованной формой ящура заболевало не менее 7 животных.

Сыворотки крови от морских свинок, отобранные через 30 дней после вакцинации, проверяли на напряженность иммунитета в реакции микронейтрализации (РМН) и иммуноферментном анализе (ИФА). Результаты этих исследований, представленные в табл.12, свидетельствуют о том, что сыворотки от морских свинок, иммунизированных вакциной из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 48, по реакциям ИФА и РМН имеют более высокие титры антител на гомологичный штамм и менее низкие на эпизоотический штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000.

Сыворотки от морских свинок, иммунизированных вакциной из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП, по реакциям ИФА и РМН имеют довольно высокие титры как на гомологичный штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737//Грузия/2000, так и на производственный штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 48.

Таким образом, вакцина из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП может быть рекомендована для вакцинации животных на территориях, где этот штамм является актуальным.

Пример 6
Проведены испытания адсорбат-вакцины из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП на КРС массой 140-180 кг. Из результатов, представленных в табл.13, можно заключить, что адсорбат-вакцина из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП типа индуцирует достаточный иммунный ответ, защитивший животных от контрольного заражения. Кроме того, необходимо отметить увеличение количества ВНА в сыворотке крови КРС уже на 10 день после вакцинации.

Пример 7
Для изготовления эмульсионной вакцины штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют, очищают от балластных примесей и контролируют полученный антиген на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S+75S компонентов вируса и стерильность так, как описано в примере 1.

Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией. Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Фильтрование ведут под давлением 1,5 атм.

Полученный концентрат антигена хранят при 4-6^oС до момента использования в вакцине. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно. В результате получают инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа Азия-1, которая представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, не вызывает общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 1 мл, для КРС - в дозе 5 мл и для овец - в дозе 1 мл через 3-21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S+75S компонентов.

Пример 8
Эмульсионную вакцину против ящура серологического типа Азия-1 готовят из штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП так, как описано в примерах 1, 2, 3. Отличие состоит в том, что необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена осаждением ПЭГ-115.

Пример 9
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа Азия-1, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей 6,8 мкг иммуногенных компонентов в прививной дозе.

Представленные в табл.14 данные свидетельствуют о способности предлагаемой вакцины защитить всех 15 привитых свиней от контрольного заражения. Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови на 21 день после вакцинации (ДПВ) составил 5,5 лог₂. Объем прививной дозы вакцины должен содержать не менее 7 ИмД₅₀. Опытная вакцина индуцировала высокий уровень гуморального иммунитета у свиней и обеспечила достижение 40 ИмД₅₀ в прививном объеме.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- штамм вируса ящура серологического типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригоден для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение "Штамм 1737/Грузия/2000 вируса ящура типа Азия-1 для изготовления диагностических и вакцинных препаратов"
1. Ререр X. Ящур. / Пер. с нем. Г.А. Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. М.: Колос, 1971, 432с.

2. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. М: Агропромиздат, 1990. 320с.

3. Сюрин В. Н. и др. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998. С. 532-548.

4. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.91г. (прототип).

5. Собко А.И. Идентификация штаммов вируса ящура в комплексе противоэпизоотических мероприятий. Докт. дисс., 1972.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Новый штамм вируса ящура типа Азия-1 1737/Грузия/2000-ДЕП получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм репродуцируется в чувствительных культурах клеток и в течение 22-24 ч инкубирования накапливается до 7,2-8,2 IgTЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 ч. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток в течение 10 пассажей. Полученный штамм обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Штамм может быть использован для изготовления средств специфической профилактики и диагностики ящура типа Азия-1, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья, Центральной Азии и Ближнего Востока. 2 ил., 14 табл.

Штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, вид Aphtae, тип Азия-1, коллекция ВГНКИ №1737/Грузия/2000-ДЕП, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.