ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК A61K31/409 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2183956C1

Изобретение относится к химии биологически активных соединений в области фотодинамической терапии (ФДТ).

Фотосенсибилизаторы (ФС) находят применение при ФДТ в качестве терапевтических средств и при фотодинамической диагностике (ФДД) в качестве флюоресцентных меток.

Известен ФС тетранатриевая соль моно-L-аспартил хлорина e6 "Npe6" [1]:

Данный ФС обладает активностью при ФДТ.

Его недостатками являются большая трудоемкость получения, чрезмерно ускоренная динамика накопления в опухоли и выведения из нее, что сокращает время эффективного воздействия на опухоль, а также сравнительно низкая степень накопления в злокачественных новообразованиях вследствие значительной гидрофильности, что задействует только один из нескольких возможных механизмов разрушения опухоли в процессе ФДТ, а именно только поражение кровеносных сосудов.

Известен ФС тринатриевая соль лизил-хлорина р6 "LCP" [2]:

Данный ФС обладает выраженной активностью при ФДТ.

Его недостатком является высокая трудоемкость получения, а также то, что он представляет собой смесь моноамидов по 13 и 15 положениям в соотношении примерно 10: 1, что может приводить к его неоднозначному биораспределению и выведению.

Известен ФС - натриевая соль феофорбида a [3]:

Данный ФС обладает способностью селективно накапливаться в злокачественных новообразованиях и активностью при ФДТ.

Его недостатками являются высокая склонность к окислению (химическая нестабильность) при хранении в растворе, неполная растворимость после хранения в твердом виде, гидрофобность и, как следствие, - медленное выведение из организма, что приводит к длительной фоточувствительности кожных покровов.

Известны ФС - производные хлорина е6 [4]:

где R = гидрофобный углеводородный заместитель, насыщенный или ненасыщенный, прямой или разветвленный, содержащий от 4 до 25 атомов углерода.

ФС, у которого R = гексил, обладает тропностью в отношении злокачественных опухолей и является эффективным средством для ФДТ.

Его недостатками являются трудоемкость выделения и очистки в препаративных количествах, высокая гидрофобность и, как следствие, медленное накопление в опухоли и низкая стабильность водных растворов лекарственных форм при хранении (прототип).

Известен способ получения ФС, а именно композиции хлоринов в виде солей со щелочным металлом, предназначенной для медицинского применения, заключающийся в том, что растительную биомассу экстрагируют смесью углеводорода, содержащего 6-12 углеродных атомов, и спирта, содержащего 2-10 углеродных атомов, взятых в объемном соотношении от 2:1 до 8:1, упаривают полученный раствор хлорофиллов при атмосферном давлении, добавляют спирт, содержащий меньшее количество углеродных атомов, чем взятый для экстракции, полностью отгоняют из смеси углеводород при атмосферном давлении, постепенно прибавляют к спиртовому раствору хлорофиллов спиртовой раствор щелочи при температуре кипения спирта, но менее 120oС, до рН 11,5-11,8, охлаждают, выдерживают 4 часа, фильтруют, экстрагируют смесь углеводородом, содержащим 6-12 углеродных атомов, отделяют спиртовую фазу, содержащую магниевые комплексы хлоринов, упаривают спирт при атмосферном давлении, прибавляют к остатку соляную кислоту до рН 3,5, выдерживают до прекращения выделения осадка хлоринов, отфильтровывают его, растворяют в метаноле, прибавляют спиртовой раствор щелочи до рН 8,5, фильтруют раствор ФС и упаривают его в вакууме [5].

Недостатком указанного способа является использование высоких температур при удалении растворителей из экстракта, использование спиртов, в особенности метилового, приводящее к алломеризации экзоцикла Е и образованию из феофитинов и феофорбидов большого числа разнообразных продуктов окисления [6] , что приводит к сложной смеси неопределенного и трудно воспроизводимого состава.

Известен способ получения ФС, а именно натриевой соли хлорина е6, согласно которому 1N раствор NaOH прибавляют к раствору триметилового эфира хлорина е6 в тетрагидрофуране, затем реакционную массу перемешивают 2 суток при комнатной температуре в атмосфере азота и добавляют воду, далее органический растворитель экстрагируют хлористым метиленом, удаляя следы последнего барботированием азота через раствор соли хлорина е6 [4].

Недостатками данного способа являются труднодоступность значительных количеств исходного триметилового эфира хлорина е6, длительность процесса получения из него ФС ввиду химической инертности сложноэфирного остатка в 13-м положении тетрапиррольного макроцикла и нестабильность лекарственных форм ФС при хранении в виде водного раствора по причине неполного омыления сложноэфирной группы в 13-м положении макроцикла.

Известен способ получения ФС, а именно фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии "LCP" (тринатриевой соли лизил-хлорина р6), заключающийся в том, что обрабатывают биомассу 2-3 раза ацетоном для извлечения хлорофилла а, отфильтровывают биомассу или центрифугируют ее, упаривают экстракт, обрабатывают экстракт кислотой для удаления из молекулы хлорофилла иона магния и гидролиза фитиловой эфирной группы с добавлением метилового спирта для одновременной этерификации, обрабатывают реакционную массу водой, экстрагируют производное феофорбида а хлористым метиленом, экстракт нейтрализуют, промывают водой, упаривают, хроматографируют на окиси алюминия, метилфеофорбид а кристаллизуют из смеси хлористый метилен-метанол и вводят полученное производное феофорбида а в реакцию с сильным неорганическим основанием в присутствии кислорода в пиридине - диэтиловом эфире - н-пропаноле, обрабатывают реакционную массу водой, подкисляют водную фазу до рН 4, экстрагируют "нестабильный хлорин" хлористым метиленом, упаривают экстракт, перерастворяют "нестабильный хлорин" в тетрагидрофуране, упаривают раствор, повторяют до прекращения роста поглощения при 700 нм, растворяют полученный пурпурин 18 в тетрагидрофуране, этерифицируют диазометаном, смешивают метиловый эфир пурпурина 18 с водным раствором лизина в хлористом метилене в присутствии пиридина, перемешивают смесь 12 часов при комнатной температуре, удаляют растворители в высоком вакууме, далее полученный сырой продукт очищают с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, удаляют растворители лиофильной сушкой, растворяют ФС в фосфатном буфере с целью получения инъекционного раствора для ФДТ, прибавляют 0,1 N раствор NaOH, доводят раствор до физиологического значения рН 7,35 с помощью 0,1 N HC1 и фильтруют через микропористый фильтр [2] (прототип).

К недостаткам данного способа следует отнести плохую воспроизводимость, трудоемкость (использование высокого вакуума, кристаллизации, колоночной хроматографии и ВЭЖХ, длительное время протекания реакции с лизином), применение высокотоксичных и огнеопасных реагентов (диазометан, пиридин, метанол, тетрагидрофуран, диэтиловй эфир), что делает его малопригодным для фармацевтического производства. Кроме того, полученный водорастворимый целевой продукт устойчив в водном растворе только 24 часа при 4oС в темноте и в твердом виде только до 4-х месяцев при 4oС в темноте, а необходимо, согласно требованиям фармакопеи, не менее 6 месяцев [7]. Более того, с точки зрения химии, данный ФС представляет собой смесь моноамидов по 13 и 15 положениям в соотношении примерно 10:1, что может приводить к его неоднозначному биологическому распределению и выведению из организма.

Задачей настоящего изобретения является ФС, характеризующийся простотой выделения и очистки в препаративных количествах, сбалансированной гидрофобностью-гидрофильностью и, как следствие, оптимальной скоростью накопления в опухоли и выведения (из опухоли и из организма в целом), а также высокой стабильностью водных растворов лекарственных форм при хранении.

Данная задача решена путем создания ФС, содержащего хлорин в виде соли со щелочным металлом, причем в качестве хлорина взяты хлорин е6 (13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил] -15-карбоксиметил-17,18- транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин)

в количестве 80-90%, пурпурин 5 (13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил]-15-формил-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин)

в количестве 5-20%, а также пурпурин 18 - хлорин р6 (13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил] -15-карбокси-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирин)

в количестве - остальное, так что указанные компоненты образуют композицию, а в качестве щелочного металла могут быть использованы натрий или калий.

Задачей настоящего изобретения также является достижение в способе получения ФС высокой воспроизводимости, простоты, отсутствия токсичных реагентов, химической стабильности лекарственных форм ФС в течение не менее 1 года, совокупности физико-химических и биологических свойств ФС, которые обеспечат его эффективность при ФДТ.

Сущность способа получения ФС заключается в том, что обрабатывают биомассу Spirulina ацетоном до полного извлечения хлорофилла а, отфильтровывают биомассу или центрифугируют ее, обрабатывают экстракт кислотой для удаления из молекулы хлорофилла иона магния, нейтрализуют экстракт и отфильтровывают выпавший феофитин а, далее гидролизуют феофитин а в смеси соляная кислота-ацетон-гексан, причем на каждый 1 г неочищенного феофитина а берут 6-16 мл ацетона, 0,6-6 мл гексана и 5-10 мл концентрированной соляной кислоты, нагревают смесь до температуры 40-60oС и перемешивают 20 мин - 1 час, далее прибавляют гексан (6-16 мл) и промывают органическую фазу смесью ацетона и концентрированной соляной кислоты (2-10):1, водную фазу промывают гексаном, далее нейтрализуют водную фазу, содержащую феофорбид а, избытком водного раствора цитрата натрия (трех-, двух- или однозамещенного), отделяют выпавший феофорбид а путем фильтрации, промывают его водой, переосаждают его из смеси ацетон-вода, сушат на воздухе до постоянного веса, далее растворяют феофорбид а в ацетоне, прибавляют сильное неорганическое основание в виде водного раствора с концентрацией 0,05-1,00%, перемешивают при 30-60oС в течение 5-30 мин, прибавляют дополнительное количество сильного неорганического основания в виде водного раствора с концентрацией 1-50%, нагревают при 40-60oС в течение 20-90 мин, нейтрализуют смесь разбавленной соляной кислотой, отделяют осадок хлорина е6 центрифугированием, промывают его дистиллированной водой до исчезновения кислой реакции, получают 55-80% хлорина е6, переосаждают хлорин е6 из ацетона для отделения линейных тетрапирролов, отфильтровывают хлорин е6 и промывают его дистиллированной водой, нагревают хлорин е6 в герметичной емкости в интервале температур 40-100oС в течение 1 часа - 30 суток, охлаждают и прибавляют раствор сильного основания до рН 7,5-8,5 и юстируют водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас.%.

Кроме того, в способе получения ФС после того, как прибавят раствор сильного основания до рН 7,5-8,5, смесь может быть подвергнута гель-фильтрации до содержания хлорина е6 - 80-90%, пурпурина 5 - 5-20% и пурпурина 18 - остальное, далее прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, отъюстирован водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас. % и получен "Жидкий экстракт хлоринов".

Кроме того, в способе получения ФС, после гель-фильтрации к раствору фотосенсибилизатора может быть прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, этот осадок отфильтрован или отделен центрифугированием, прибавлены разрешенные Государственной Фармакопеей РФ добавки до рН 7,5-8,5 и вода апирогенная для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 0,1-1 мас.% и отфильтровано от бактерий.

Кроме того, в способе получения ФС после гель-фильтрации к смеси может быть прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, этот осадок отфильтрован или отделен центрифугированием, отъюстирован водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас.%, диспергируют "Жидкий экстракт хлоринов" в гелевой основе из расчета: 0,5-12 мас.% "Жидкого экстракта хлоринов", 5-20 мас.% диметилсульфоксида, остальное - вода, разрешенные Государственной Фармакопеей РФ добавки и гелевая основа.

Кроме того, в способе получения ФС после гель-фильтрации к смеси может быть прибавлен разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, этот осадок отфильтрован или отделен центрифугированием, отъюстирован водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас.%, и полученный "Жидкий экстракт хлоринов" растворен в диметилсульфоксиде из расчета: 0,5-12 мас.% "Жидкого экстракта хлоринов" и остальное - диметилсульфоксид.

Указанный способ реализуется с помощью стандартного лабораторного химического пилотного оборудования: обрабатывают биомассу в бидонах алюминиевых емкостью 10-50 л, оснащенных механической мешалкой, отфильтровывают биомассу на нутч-фильтрах емкостью 5-20 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, центрифугируют биомассу с использованием напольной центрифуги со стаканами 4х1 л с охлаждением и скоростью вращения до 6000 об/мин, обрабатывают экстракт кислотой в стеклянных бутылях емкостью 20 л, отфильтровывают выпавший феофитин а на нутч-фильтрах емкостью 5-10 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, гидролизуют феофитин а в трехгорлых круглодонных колбах емкостью 0,1-0,5 л, оснащенных обогревом, механическим перемешиванием, обратным холодильником и загрузочным отверстием с пробкой, промывают растворы с использованием делительных воронок емкостью 2 л, нейтрализуют в стаканах химических емкостью 2-5 л, отфильтровывают феофорбид а на нутч-фильтрах емкостью 2-5 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, переосаждают в колбах плоскодонных химических емкостью 0,25-1 л, растворяют феофорбид а в ацетоне и прибавляют сильное неорганическое основание в в трехгорлых круглодонных колбах емкостью 0,5-2 л, оснащенных обогревом, механическим перемешиванием, обратным холодильником и загрузочным отверстием с пробкой, отделяют осадок хлорина е6 центрифугированием с использованием напольной центрифуги со стаканами 4х0,5 л с охлаждением и скоростью вращения до 6000 об/мин, переосаждают хлорин е6 с использованием колб плоскодонных химических емкостью 0,25-0,5 л 2-5 л, отфильтровывают хлорин е6 а на нутч-фильтрах емкостью 1-2 л с вакуумным масляным насосом и охлаждаемой жидким азотом ловушкой, нагревают хлорин е6 в круглодонных химических колбах из термостойкого стекла емкостью 0,05-0,1 л, прибавляют раствор сильного основания и юстируют в химических стаканах емкостью 0,1-1 л с использованием стандартного рН-метра и спектрофотометра, смесь подвергают гель-фильтрации на колонке диаметром 50-100 мм и высотой 100-150 мм, отфильтровывают от бактерий с использованием стандартных микропористых фильтров типа Millipore с диаметром пор 0,22 мкм, диспергируют "Жидкий экстракт хлоринов" в гелевой основе с использованием ножевого или шарикового гомогенизатора, кроме того, для приготовления навесок, растворов и образцов используют конические колбы с пробками емкостью от 0,01 до 10 л, цилиндры емкостью от 0,005 до 2 л, стаканы емкостью от 0,05 до 2 л, бутыли емкостью 20 л, весы с диапазоном взвешивания 1-1000 г, магнитные мешалки; для регенерации ацетона и гексана - круглодонные колбы емкостью 5 л с термометром и прямоточным водяным холодильником; для быстрого удаления растворителей при пониженной температуре - ротационный вакуумный испаритель.

В способе получения ФС концентрированной соляной кислотой считают насыщенный раствор хлороводорода в воде при температуре 20oС, который обыкновенно содержит 36-37 мас.% хлороводорода.

При превращении феофитина а в феофорбид а диапазон количеств гексана и ацетона (6-16 мл ацетона и 0,6-6 мл гексана) связан с тем, что при меньшем количестве растворителей феофитин а растворяется не полностью, а при большем - получают раствор, недостаточно концентрированный для быстрого протекания гидролиза. Диапазон количеств соляной кислоты (5-10 мл) связан с тем, что при меньшем количестве соляной кислоты уменьшается выход феофорбида а, а при большем - селективность реакции, так как образуется много побочного продукта - пирофеофорбида а. Диапазон значений температуры 40-60oС связан с тем, что при более низкой температуре уменьшается выход феофорбида а, а при более высокой - снижается селективность реакции вследствие образования побочного продукта - пирофеофорбида а. Диапазон значений времени реакции - 20 мин - 1 час - связан с тем, что при меньшем времени уменьшается выход феофорбида а, а при более высокой - снижается селективность реакции вследствие образования побочного продукта - пирофеофорбида а. Количество прибавляемого далее гексана - 6-16 мл - связано с тем, что при меньшем его количестве от реакционной массы неэффективно отделяется один из продуктов реакции - фитол, использование же большего количества гексана нецелесообразно.

При очистке феофорбида а промывают органическую фазу смесью ацетона и концентрированной соляной кислоты, взятых в соотношении от 2:1 до 10:1. При соотношении менее 2:1 из смеси выделяется хлопьевидный осадок примесей, который плохо отделяется от водной фазы, содержащей целевой феофорбид а. При соотношении более 10:1 водная фаза пересыщается ацетоном, и в нее переходят примеси из гексановой фазы, загрязняя целевой феофорбид а.

При превращении феофорбида а в хлорин е6, концентрацию сильного основания задают в интервале 0,05-1,00%, причем нижняя его граница - минимум, необходимый для протекания реакции раскрытия циклопентанонового кольца (кольца Е) феофорбида а, a при концентрации щелочи больше 1% протекает реакция алломеризации (окисления) кольца Е, что ведет вместо целевого хлорина е6 к "нестабильному хлорину", а затем - к пурпурину 18 и далее - к хлорину р6.

Далее в способе прибавляют дополнительное количество сильного неорганического основания в виде водного раствора с концентрацией 1-50%. При концентрации щелочи менее 1% происходит неполное омыление сложноэфирного остатка в 13 и/или 15 положении. При использовании щелочи в концентрации более 50% тетрапиррольный макроцикл ФС в части случаев раскрывается.

Реакционную массу перемешивают далее при 30-60oС в течение 5-30 мин, причем меньшая температура способствует облегчению процесса алломеризации кольца Е, а большая - разложению хлорина е6 до хлорина е4. Меньшее время проведения процесса недостаточно для протекания реакции раскрытия кольца Е, а большее - увеличивает выход побочного хлорина е4. При прибавлении дополнительного количества сильного неорганического основания интервал температур - 40-60oС, а времени реакции - 20-90 мин. При меньших значениях температуры и времени не успевает гидролизоваться метиловый эфир по положению 152, при больших - увеличивается выход побочного хлорина е4.

При превращении хлорина е6 в "Жидкий экстракт хлоринов" протекает процесс окисления и последующих термолитических процессов дегидратации и декарбоксилирования ФС с окисленной метиленовой группой в положении 151 в пурпурин 5:

При превращении хлорина е6 в "Жидкий экстракт хлоринов" использование температуры ниже 40oС требует продолжительного времени проведения процесса, что технологически неоправданно. Использование температуры выше 100oС приводит к ускоренному разложению субстанции.

Проведение процесса менее чем за 1 час требует использования температур выше 100oС, либо приводит к субстанции, имеющей низкую биологическую активность.

Проведение процесса более чем за 30 суток сопровождается необратимым изменением (разложением) субстанции.

Оптимальной температурой проведения процесса является 45-70oС (фиг. 1).

Оптимальным временем проведения процесса являются 2-9 суток при 70oС (фиг. 2) или 1-48 часов при 100oС (фиг. 3), приводящие к 5-20% пурпурина 5 в смеси.

Субстанция, содержащая 5-20% пурпурина 5 и 80-95% хлорина е6 в составе действующего начала (ФС), пригодна для получения водорастворимых инъекционных лекарственных форм. Если субстанция содержит менее 5% пурпурина 5, она имеет низкую биологическую активность. Если субстанция содержит более 20% пурпурина 5, ее растворимость в воде ухудшается, что неблагоприятно сказывается на стабильности лекарственных форм при хранении и ухудшает способность к фильтрации через микропористые фильтры. Последнее свойство необходимо для стерилизации лекарственных форм, так как лекарственные формы тетрапирролов нельзя стерилизовать нагреванием или УФ-лучами ввиду высокой вероятности протекания химических реакций.

Присутствие в субстанции 80-95% хлорина е6 необходимо для поддержания пурпурина 5 в водорастворимом состоянии.

Используемый диапазон значений рН обусловлен тем, что его нижняя граница - рН 7,5 - является нижним пределом растворимости хлоринов в водных растворах с получением концентраций, пригодных для использования в фармацевтике, без добавления солюбилизаторов. Верхняя граница этого диапазона - рН 8,5 - является пределом биологической переносимости концентраций гидроксид-ионов, [ОН-].

Интервал концентраций хлорина е6 6,5-7,5% обусловлен использованием технологических приемов центрифугирования или фильтрации на стадии отделения осадка хлорина е6, дающих продукт в этом диапазоне концентраций.

Изобретение поясняется чертежами, на которых фиг. 1 относится к способу и показывает образование пурпурина 5 в зависимости от температуры при выдерживании в течение 30 сут; фиг. 2 отражает зависимость содержания пурпурина 5 от времени выдерживания при температуре 70oС; фиг. 3 отражает зависимость содержания пурпурина 5 от времени выдерживания при температуре 100oС; фиг. 4 иллюстрирует фармакокинетику субстанции "Жидкого экстракта хлоринов", использованной в виде лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин") у опухолевых мышей при внутривенном введении в дозе 20 мг/кг; фиг. 5а показывает наличие метаболита хлорина е6 (формула I), а именно пурпурина 5 (формула II) в крови, причем кривые, обозначенные как "1", сняты для ФС в 0,01 М боратном буфере с рН 9,18, а кривые, обозначенные как "2", сняты для ФС в крови; фиг. 5б подтверждает метаболизм хлорина е6 (формула I) в пурпурин 5 (формула II) в печени; на фиг. 6 изображен ПМР-спектр субстанции "Жидкий экстракт хлоринов", полученной в примере 2; на фиг. 7 представлен масс-спектр субстанции "Жидкий экстракт хлоринов", полученной в примере 2; фиг. 8 дает спектр поглощения в видимой области субстанции "Жидкий экстракт хлоринов", полученной в примере 2, спектр снят в этаноле для 5 мкг/мл субстанции; на фиг. 9 представлен ПМР-спектр хлорина е6; фиг. 10 содержит масс-спектр хлорина е6; фиг. 11 показывает спектр поглощения в видимой области хлорина е6, спектр снят в этаноле, конц. хлорина е6, 15 мкг/мл (полоса Соре - 5 мкг/мл); на фиг. 12 приводится ПМР-спектр пурпурина 5; на фиг. 13 дается масс-спектр пурпурина 5; фиг. 14 содержит спектр поглощения в видимой области пурпурина 5; спектр снят в этаноле, конц. пурпурина 5-15 мкг/мл (полоса Соре - 5 мкг/мл): фиг. 15 дает ПМР-спектр диметилового эфира пурпурина 5; на фиг. 16 представлен масс-спектр диметилового эфира пурпурина 5; на фиг. 17 дан спектр поглощения в видимой области диметилового эфира пурпурина 5, спектр снят в этаноле, конц. ДМЭ пурпурина 5-15 мкг/мл (полоса Соре - 5 мкг/мл).

ФС иллюстрируется примером 1, примеры реализации способа даны в примерах 2, 3, частные случаи реализации способа проиллюстрированы в примерах 4-9.

ФС с точки зрения химии содержит три циклических тетрапиррола хлориновой природы (с гидрированным кольцом D) - хлорин е6 (формула I), пурпурин 5 (формула II, пример 10) и пурпурин 18, который в щелочной среде (при хранении) постепенно превращается в хлорин р6 (формула III).

ФС с точки зрения физической химии обладает способностью поглощать свет в видимой области, результатом чего является его фотоактивация и последующая релаксация возбужденного состояния с переносом энергии на растворенный в тканях молекулярный кислород и органические субстраты. Последнее приводит к окислительным и свободно-радикальным процессам в биологических тканях и их повреждению и последующему разрушению (некрозу). Наиболее предпочтительной для ФДТ полосой возбуждения является длинноволновая полоса (табл. 1), т.к. с ростом длины волны растет проникающая способность света в биологические ткани. Таким образом, ФС способен разрушать биологические объекты после возбуждения светом с длиной волны 654-670 нм на глубину до 10 мм.

ФС с точки зрения фармацевтики является субстанцией "Жидкого экстракта хлоринов" (жидкими принято считать экстракты с содержанием действующего вещества менее 20%). Экстрактом данная субстанция является в связи с необходимостью ее извлечения из биомассы с использованием органических растворителей.

Соединение формулы II обладает способностью селективно накапливаться в злокачественных новообразованиях и инфицированных очагах, но плохо растворяется в воде, а соединение формулы I, наряду с выраженной фотодинамической активностью, является солюбилизирующим средством для соединения формулы II.

С точки зрения фармакологии (фиг. 4, пример 11), однозначность фармакокинетических показателей достигается тем, что ФС формулы (I) в организме медленно превращается в ФС формулы (II), что поддерживает концентрацию последнего на постоянном уровне с момента введения в организм до момента выведения из опухоли, в течение промежутка времени, достаточного для эффективного проведения ФДТ. После введения в организм мышей-опухоленосителей предлагаемой композиции ФС, она попадает в кровоток и за счет циркуляции в крови прежде всего соединения формулы (I) в первые 3 часа после введения в районе опухоли достигается высокая и стабильная концентрация ФС - 0,27-0,32 μM, достаточная для эффективного проведения ФДТ в интервале 0,5-4 часа. Высокая контрастность в этот промежуток времени достигается за счет наличия в составе композиции 5-20% соединения формулы (II), которое обладает свойством с высокой контрастностью накапливаться в опухоли, причем максимум накопления приходится на 3 часа после введения ФС в организм животных (индекс контрастности составляет 14,5 по коже и 2,9 по мышцам). За это время соединение формулы (I) превращается в организме в соединение формулы (II), обеспечивая высокую стабильную концентрацию ФС в районе опухоли в интервале 3-5 часов после инъекции, которая постепенно снижается, оставаясь терапевтически достаточной вплоть до 18 часов после инъекции. Соединение формулы (II) далее распадается в организме до нетоксичных продуктов, которые выводятся через печень.

Превращение хлорина е6 формулы (I) в пурпурин 5 формулы (II) подтверждается спектрами флюоресценции образцов органов и тканей экспериментальных животных (фиг. 5). При добавлении лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин") к гомогенату крови [фиг. 5а, (1)] в концентрации 10 μM с последующим спектрофотометрическим исследованием наблюдается изменение спектра флюоресценции в виде уширения в 1,2 раза и сдвиг максимума интенсивности флюоресценции в длинноволновую часть спектра на 8 нм. При добавлении "Фотохлорина" в меньшей концентрации (С=1 μM) отмечен только сдвиг спектра без уширения, что демонстрирует эффект дозы при образовании метаболита [фиг. 5а, (2)].

Фиг. 5а, (3) демонстрирует результат исследования гомогената крови, полученного через 3 часа после введения "Фотохлорина" мышам. Здесь наиболее выражен показатель уширения спектра в 1,5 раза при максимальном сдвиге полосы в длинноволновую часть спектра на 4 нм, из чего следует, что в исследуемом образце крови присутствует смесь "Фотохлорина" и метаболита.

При добавлении "Фотохлорина" в пробирку с гомогенатом печени [фиг. 5б, (1)] в концентрации 10 μM изменение спектральных характеристик выражено прежде всего в сдвиге максимума интенсивности флюоресценции в длинноволновую часть спектра на 9 нм. Уширение спектра отсутствует.

Аналогичная картина наблюдается при добавлении "Фотохлорина" в меньшей концентрации С=1 μM [фиг. 5б, (2)].

При изучении гомогената ткани печени, полученного через 3 часа после введения препарата животным, спектрофотометрическая картина исследуемого образца аналогична двум предыдущим [фиг. 5б, (3)].

Таким образом, полученные данные демонстрируют наличие метаболита "Фотохлорина" в гомогенатах печени.

Оптимальное по селективности для фотодинамического действия накопление пурпурина 5 в опухолях экспериментальных животных наблюдают в интервале 3-18 часов после внутривенного или внутрибрюшинного введения. В случаях, когда необходимо также задействовать субстанцию хлоринов, циркулирующую в кровотоке, оптимальным временем облучения является 0,5-4 часа после внутривенного введения. В общем случае, для проведения ФДТ с субстанцией "Жидкого экстракта хлоринов" интервал между введением препарата и облучением составляет 0,5-18 часов.

Биологическую активность лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин"), содержащей 0,5% безводной субстанции "Жидкого экстракта хлоринов", оценивают in vitro и in vivo.

Сбалансированность ФС по амфифильности подтверждают стандартным экспериментом in vitro [8] (табл. 2, пример 12). Коэффициент распределения ФС в 1-октаноле/фосфатном буфере, рН 7,4 (Кр), равен 1,40. Это означает, что заявляемый ФС одинаково хорошо растворим как в водной, так и в липидной фазе и доказывает липофильность ФС, которая позволяет этому соединению перераспределяться из воды в комплексы с транспортными белками и липопротеинами, быстро проникать в клетки и накапливаться в цитоплазматических внутриклеточных мембранах и микросомах, либо проникать в клетки путем диффузии через плазматическую мембрану этих клеток. После лазерного облучения таким образом депонированное соединение выделяет синглетный кислород внутри клетки, убивая ее.

Противоопухолевую активность заявляемого ФС в отношении различных типов раковых клеток подтверждают результатами, полученными в эксперименте in vitro, в котором использовали 3 линии культивируемых опухолевых клеток: феохромоцитомы крысы PC 12, невриномы Гассерова узла крысы НГУК1 и крысиной гепатомы 27 (Нер27) (табл. 2, пример 13).

Для исследования дозовозависимой цитофототоксической (после облучения лазером) и биологической "темновой" активности ФС используют следующие методы:
1. МТТ-тест, который позволяет точно определить число живых клеток после их обработки ФС и облучения лазером для расчета цитотоксического и цитофототоксического индексов ФС. Этот же тест позволяет оценить дозовозависимую цитотоксическую и биологическую "темновую" активность ФС [9].

2. Определение числа клеток после окрашивания клеточного монослоя кристалл-виолетом в конце эксперимента. Этот метод менее трудоемкий и дорогой, чем МТТ-тест, также позволяет рассчитать цитотоксический и цитофототоксический индексы ФС [10], но он менее точный, т.к. кристалл-виолет окрашивает и мертвые клетки.

3. Сравнительное генотоксическое и генофототоксическое действие ФС оценивают по степени ингибирования синтеза ДНК в клетках. Величину синтеза ДНК определяют по уровню включения в ДНК 14С-тимидина, используя стандартные радиометрические методы [11].

Все три исследованные линии клеток высокочувствительны к действию лазерного облучения после их обработки ФС (данные МТТ-теста). По степени чувствительности к облучению лазером клеточные линии располагаются следующим образом: НГУК1>РС12>Нер27.

При длительном действии ФС в концентрации 5 на клетки в темноте выживало 96,5-86,2% PC-12, 103,7-93,0% НГУК1 и 109,7-87,9% Нер27 (МТТ-тест - кристалл-виолет, соответственно). В этих же условиях синтез ДНК практически не изменялся у клеток PC-12 и был снижен в клетках Нер27 и НГУК1 на 21,2 и 22,2% соответственно. Наблюдаемое увеличение числа клеток НГУК1 и Нер27 при действии 5 μM ФС на клетки в темноте связано скорее всего с индукцией ФС пролиферативной активности клеток. В целом для ФС в отсутствие облучения более характерно проявление цитотоксической активности, чем индукция пролиферативной.

После лазерного облучения клеток, обработанных ФС, наблюдается их гибель. Обнаружено дозовозависимое цитофототоксическое действие препарата, что позволяет рассчитать ЕС50, т.е. определить концентрацию ФС, при которой погибает 50% клеток. Эти данные приведены в таблице 2. Следует отметить, что ФС, у которых ЕС50 меньше 20 μM, считают эффективными для подавления опухолевого роста.

При определении генофототоксичности после обработки клеток 5 μM ФС и облучения лазером получают резкое снижение синтеза ДНК (на 96,5% по сравнению с только облученным контролем) у клеток PC-12. У клеток Нер27 и НГУК1 при низких концентрациях ФС после облучения лазером наблюдают стимуляцию синтеза ДНК, который значительно снижается в присутствии 5 μM BX. Наблюдаемое увеличение синтеза ДНК можно объяснить высокой способностью синтезировать ДНК и восстанавливать свою популяцию выживших при низких концентрациях ФС трансформированных клеток печени и глии.

Таким образом, ФС является высокоцитофототоксичным препаратом для разных типов опухолевых клеток. В высоких концентрациях (>5 μM) он является умеренным ингибитором опухолевого роста и без облучения. Высокая генофототоксичность ФС позволяет считать его сильным ингибитором опухолевого роста при облучении.

В экспериментах in vivo изучают токсические свойства ФС (пример 14). LD50 составляет в среднем, с учетом весового коэффициента, 210,53±22,2 мг/кг, а доза, вызывающая гибель 10% испытуемых животных (LD50), составляет 169,87 мг/кг. Проведенные исследования позволяют классифицировать ФС как "Малотоксичное вещество".

В экспериментах in vivo изучают биораспределение ФС (пример 11). При введении ФС внутрибрюшинно мышам с эмбриокарциномой Т36, перевитой в мышцу задней ноги, наблюдаются следующие закономерности в распределении соединений. После введения ФС попадает в кровь, а затем перераспределяется в органы и ткани животных (табл. 3).

Как видно из табл. 3, максимум накопления в опухоли (0,70 μM) достигается через 5 часов после внутрибрюшинного введения в дозе 40 мг/кг и длительно сохраняется (18-24 часа). Опухолевая концентрация через 18 ч после введения составляет 0,48 μM, что в 1,5 раза меньше, чем в абсолютном максимуме накопления, при высокой селективности накопления. Отношение опухоль/мышечная ткань составляет 32, а опухоль/кожа - 44.

После внутривенного введения в дозе 20 мг/кг достигнут максимум накопления в опухоли через 0,5 часа (0,32 μM), который также длительно сохраняется (до 5 часов). Максимальная контрастность накопления при внутривенном введении проявляется через 3 часа и составляет для опухоли/мышечной ткани 3, а опухоли/кожи - 4. ФС выводится из организма через сутки на 98%.

Результаты оценки эффективности действия препарата при ФДТ рака в экспериментах in vivo на мышах (пример 15) позволяют констатировать факт наличия выраженной фотодинамической активности "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") и "Радахлорина, 0,05%-ного геля".

Лекарственная субстанция "Жидкого экстракта хлоринов", включающая натриевые соли хлоринов (или соли хлоринов и иных сильных неорганических оснований), используется для получения лекарственных форм добавлением к ней различных разрешенных Государственной Фармакопеей РФ добавок: карбоната кальция, сахарозы, глюкозы, крахмала, стеарата магния, поливинилпирролидонов, полиглюканов, метилглюкамина, изотонического раствора, диметилсульфоксида, гелевых и водоэмульсионных основ и пр. (примеры 4-9).

Для наружного применения используют мази, линименты, гели, препараты на масляной основе, содержащие разрешенные Государственной Фармакопеей РФ основы, 5-20% диметилсульфоксида и 0,5-12% субстанции "Жидкого экстракта хлоринов", либо 0,8-14% субстанции "Жидкого экстракта хлоринов" и 86-99,2% диметилсульфоксида (примеры 8, 9).

Выбор диапазона значений содержания диметилсульфоксида в сочетании с основами связан с тем, что при его концентрации менее 5% проникновение субстанции в ткани мало, что уменьшает эффективность ФДТ. При концентрации диметилсульфоксида более 20% лекарственные формы на других основах теряют стабильность при хранении. Выбор диапазона значений содержания субстанции связан с тем, что при его концентрации менее 0,5% содержание субстанции в ткани недостаточно для эффективного проведения ФДТ. При концентрации субстанции более 12% ткань теряет прозрачность для светового излучения, весь свет поглощается в верхнем слое ткани, что приводит к ожогу при низкой эффективности процедуры ФДТ.

При наружном применении экспозиция субстанции на коже перед облучением составляет 0,5-24 часа. За время менее 0,5 часа субстанция не успевает проникнуть в ткань на необходимую глубину. За время более 24 часов наблюдается падение величины абсолютного накопления препарата вследствие его перераспределения и выведения. Кроме того, длительные экспозиции наружных лекарственных форм на коже неудобны с клинической точки зрения.

При внутривенном использовании препарат вводят в виде 0,1-1%-ного раствора в любых разрешенных Государственной Фармакопеей РФ средах (апирогенная вода для инъекций, диметилсульфоксид, физиологический раствор и т.п.) капельно или струйно. Использование растворов субстанции, разбавленных более чем до 0,1%, нерационально с точки зрения объемов вводимой в организм жидкости. Использование растворов концентрированнее 1% невозможно в связи с плохой фильтруемостью таких растворов на стадии стерилизации через антибактериальные фильтры.

Для активации субстанции ФС "Жидкий экстракт хлоринов" используют полупроводниковый лазерный диодный модуль для фотодинамической терапии МЛ-662-СП, разработанный фирмами ЗАО "МИЛОН" (г. Санкт-Петербург) и ООО "СИГМ ПЛЮС" (г. Москва). Этот модуль имеет следующие выходные данные [12]:
- мощность 2,5-3 Вт в волокне 200 мкм с апертурой 0,22;
- высокояркие лазерные диоды совместного производства фирмы "Полароид" (США) и ООО "СИГМ ПЛЮС" с максимумом длины волны излучения 662±3 нм.

Для активации субстанции ФС могут использоваться модули меньшей мощности (с меньшим количеством диодов) с максимумом длины волны излучения 662±3 нм, а также твердотельный лазер с накачкой на второй гармонике иттрий-алюминиевого граната YAG:Nd+3 с максимумом длины волны излучения 670 нм.

Величину подаваемой энергии варьируют от 30 до 3000 Дж. При световых дозах менее 30 Дж процедура ФДТ становится чрезмерно продолжительной, т.к. для достижения оптимального эффекта сканирование приходится осуществлять по крайне малым площадям. При световых дозах более 3000 Дж и наиболее часто встречающихся в клинической практике размерах опухолей наблюдается значительное повреждение здоровой ткани, ведущее к увеличению периода ее регенерации.

Поверхностную плотность подаваемой энергии варьируют от 50 до 2500 Дж/см2. При поверхностных световых дозах менее 50 Дж/см2 эффекта не наблюдается. При поверхностных световых дозах более 2500 Дж/см2 наблюдается значительное повреждение здоровой ткани, ведущее к увеличению периода ее регенерации.

Диапазон длин волн возбуждающего излучения связан с технической характеристикой используемого лазера (662±3 нм), сдвигом максимума поглощения препарата в зависимости от полярности среды (654-662 нм) и содержанием пурпурина 5 в субстанции (5-20%, полуширина длинноволновой полосы поглощения при 663-670 нм) (табл. 1).

Пример 1. Описание физико-химических свойств ФС.

ФС представляет собой густую массу черного цвета, в тонком слое приобретающая зеленый оттенок, с запахом водорослей.

Для подтверждения подлинности свойств ФС, "Жидкий экстракт хлоринов", 7,5% тщательно перемешивают, навеску экстракта (1 мг) растворяют в 10 мл спирта этилового ректификационного, 95%, медицинского или высшей очистки и измеряют оптическую плотность на длине волны 662 нм (D). Получают значение 0,23. Рассчитывают молекулярную экстинкцию ε (М-1см-1) по формуле ε =D•597/(0,004). Полученное значение должно находиться в диапазоне 33300-35100. Подставляя, получают ε =0,23•597/(0,004)= 34328. Следовательно, "Жидкий экстракт хлоринов" содержит 7,5% ФС.

Раствор ФС в этиловом спирте имеет желто-зеленый цвет. При прохождении через слой раствора световых лучей от лампы медицинской синей марки МДС 220-75 (ТУ 16.535.376-79) в защищенном от света месте, раствор приобретает рубиново-красную окраску.

Для количественного определения "Жидкий экстракт хлоринов" тщательно перемешивают, навеску экстракта (5 мг) растворяют в 10 мл спирта этилового ректификационного, 95%, медицинского или высшей очистки и измеряют оптическую плотность на длине волны 662 нм (D). Получают значение 2,15. Рассчитывают содержание ФС по формуле: c,%=(D•597•10•100)/(34230•5). Полученное значение должно соответствовать заданному. Подставляют с,%= (2,15•597•10•100)/(34230•5)=7,5% (соответствует заданному).

Для дальнейших анализов к 100 мг "Жидкого экстракта хлоринов" прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, который отфильтровывают, высушивают в вакууме над пятиокисью фосфора в течение 12 ч и снимают ПМР-, масс-спектры и спектр поглощения в диапазоне длин волн 360-720 нм.

Спектр ПМР ФС (фиг. 6): (в ДМСО-D6, конц. раствор): 9,64, 9,55, 9,52, 9,39, 8,90, 8,79 (с, мезохлорина e6 и пурпурина 5), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2д, хлорина e6 и пурпурина 5), 6,84 (с, γ-мезо - пурпурина 5), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2д, ), 5,43 (2s, γ-мезо-), 4,60 (м, ), 4,45 (м, , 3.80, 3,56 (кх2, ), 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (с, ядерные хлорина е6 и пурпурина 5), 2,38, 2,32 (2 м, 7-), 2,71, 2,20 (2м, ), 1,76 (д, ), 1,72 (т, ), 1,63,-1,91 (2с, ) м.д.

Масс-спектр ФС (фиг. 7): e. i. , M+ (%), 596 (16,0), 566 (9,4), 508 (100,0), 494 (7,3), 447 (9,4), 435 (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

Спектр поглощения ФС в видимой области: λ(ε) (этанол), 386 (22310), 406 (113040), 506 (14870), 536 (8925), 608 (7437), 662 (34220).

Согласно спектру ПМР, в субстанции содержится 80% хлорина е6, 15% пурпурина 5 и 5% пурпурина 18 (минорные сигналы при 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 м.д.), что соответствует патентуемой композиции. Согласно масс-спектру, присутствуют пики молекулярных ионов 596 от хлорина е6 и 566 от пурпурина 5. В спектре поглощения имеется полоса 662 нм с величиной поглощения, хорошо соотносящейся с молекулярной экстинкцией эталона ФС (34230).

Следовательно, изученный образец является "Жидким экстрактом хлоринов", 7,5%.

Пример 2. Получение ФС в виде "Жидкого экстракта хлоринов", 6,5%.

Обрабатывают биомассу Spirulina (2 кг) ацетоном (3х2 л) до полного извлечения хлорофилла а, отфильтровывают биомассу, обрабатывают экстракт соляной кислотой (30 мл) для удаления из молекулы хлорофилла иона магния, нейтрализуют экстракт и отфильтровывают выпавший феофитин а (8 г), далее гидролизуют феофитин а в смеси соляная кислота-ацетон-гексан, для чего растворяют феофитин а в смеси 50 мл ацетона, 5 мл гексана и 40 мл соляной кислоты (37%), нагревают смесь до температуры 40oС и перемешивают 1 час, далее прибавляют гексан (50 мл) и промывают органическую фазу смесью ацетона и концентрированной соляной кислоты 2:1 (3х50 мл), водную фазу промывают гексаном (5х40 мл), далее нейтрализуют водную фазу, содержащую феофорбид а, избытком водного раствора цитрата натрия (трех-, двух- или однозамещенного), отделяют выпавший феофорбид а путем фильтрации, промывают его водой (3х50 мл), переосаждают его из смеси ацетон-вода, сушат на воздухе до постоянного веса (выход феофорбида а - 4,2 г, 7,1 мМ, 77%), далее растворяют феофорбид а (2,7 г, 4,56 мМ) в ацетоне (100 мл), прибавляют сильное неорганическое основание в виде водного раствора с концентрацией (0,05%, 25 мл), перемешивают при 60oС в течение 5 мин, прибавляют дополнительное количество сильного неорганического основания (20%, 25 ml) в виде водного раствора, нагревают при 40oС в течение 90 мин, нейтрализуют смесь разбавленной соляной кислотой (2%, около 250 мл), отделяют осадок хлорина е6 центрифугированием, промывают его дистиллированной водой (5х10 мл) до исчезновения кислой реакции, получают 1,85 g (2,96 мМ, 65%) хлорина е6, переосаждают хлорин е6 из ацетона для отделения линейных тетрапирролов, отфильтровывают хлорин е6 и промывают его 3 раза дистиллированной водой, нагревают хлорин е6, в герметичной емкости при 40oС в течение 30 суток, охлаждают и прибавляют 1%-ный раствор гидроксида натрия до рН 7,5, получая ФС с содержанием 15% пурпурина 5, 80% хлорина е6 и 5% пурпурина 18 (хлорина р6), который юстируют дистиллированной водой до 6,5%-ного содержания ФС, получая 14,2 г (50%) ФС в виде 6,5%-ного "Жидкого экстракта хлоринов".

Спектр ПМР полученного "Жидкого экстракта хлоринов" (фиг. 6): (в ДМСО-D6, конц. раствор): 9,64, 9,55, 9,52, 9,39, 8,90, 8,79 (с, мезо хлорина е6, и пурпурина 5), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2д, хлорина е6 и пурпурина 5), 6,84 (с, γ- мезо пурпурина 5), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2д, ), 5,43 (2s, ), 4,60 (м, ), 4,45 (м, ), 3,80, 3,56 (кх2, ), 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (с, ядерные хлорина е6 и пурпурина 5), 2,38, 2,32 (2м, ), 2,71, 2,20 (2м, 7-), 1,76 (д, ), 1,72 (т, ), 1,63, -1,91 м. д.

В субстанции содержится 80% хлорина е6, 15% пурпурина 5 и 5% пурпурина 18 (хлорина р6) (сигналы при 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 м.д.).

Масс-спектр полученной субстанции (фиг. 7): e.i., М+ (%), 596 (16,0), 566 (9,4), 508 (100,0), 494 (7,3), 447 (9,4), 435 (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

Спектр поглощения в видимой области (фиг. 8): λ (ε) (этанол), 386 (22320), 406 (113110), 506 (14880), 536 (8930), 608 (7440), 662 (34230).

Пример 3. Получение ФС в виде субстанции "Жидкого экстракта хлоринов", 7,5%.

Обрабатывают биомассу Spirulina (2 кг) ацетоном (3х2 л) до полного извлечения хлорофилла а, отделяют биомассу центрифугированием, обрабатывают экстракт соляной кислотой (30 мл) для удаления из молекулы хлорофилла иона магния, нейтрализуют экстракт и отфильтровывают выпавший феофитин а (8 г), далее гидролизуют феофитин а в смеси соляная кислота-ацетон-гексан, для чего растворяют феофитин а в смеси 100 мл ацетона, 50 мл гексана и 80 мл соляной кислоты (37%), нагревают смесь до температуры 60oС и перемешивают 20 мин, далее прибавляют гексан (100 мл) и промывают органическую фазу смесью ацетона и концентрированной соляной кислоты 5:1 (3х50 мл), водную фазу промывают гексаном (5х40 мл), далее нейтрализуют водную фазу, содержащую феофорбид а, избытком водного раствора цитрата натрия (трех-, двух- или однозамещенного), отделяют выпавший феофорбид а путем фильтрации, промывают его водой (3х50 мл), переосаждают его из смеси ацетон-вода, сушат на воздухе до постоянного веса (выход 3,8 г, 6,4 мМ, 67%), далее растворяют феофорбид а (2,7 г, 4,56 мМ) в ацетоне (100 мл), прибавляют сильное неорганическое основание в виде водного раствора с концентрацией (1%, 25 мл), перемешивают при 30oС в течение 30 мин, прибавляют дополнительное количество сильного неорганического основания (20%, 25 мл) в виде водного раствора, нагревают при 60oС в течение 20 мин, нейтрализуют смесь разбавленной соляной кислотой (2%, около 250 мл), отделяют осадок хлорина е6 центрифугированием, промывают его дистиллированной водой (5х10 мл) до исчезновения кислой реакции, получают 1,67 g (2,67 мМ, 55%) хлорина е6, переосаждают хлорин е6 из ацетона для отделения линейных тетрапирролов, отфильтровывают хлорин е6 и промывают его 3 раза дистиллированной водой, нагревают хлорин е6 в герметичной емкости при 100oС в течение 1 часа, охлаждают и прибавляют 1%-ный раствор гидроксида калия до рН 8,5, в результате чего получают ФС с 2% пурпурина 5, 82% хлорина е6 и 16% пурпурина 18 (хлорина р6), юстируют дистиллированной водой до 7,5%-ного содержания ФС, получая 11,1 г (50%) ФС в виде 7,5%-ной пасты.

Спектры полученной субстанции аналогичны спектрам, приведенным для примера 2, и представляют собой суперпозицию спектров хлорина е6 (фиг. 9-11) и пурпурина 5 (фиг. 12-14).

Пример 4. Частный случай получения ФС - получение "Жидкого экстракта хлоринов", 7,5%.

ФС с 2% пурпурина 5, 82% хлорина е6 и 16% пурпурина 18 (хлорина р6) в виде 7,5%-ной пасты из предыдущего примера подвергают гель-фильтрации на колонке с Sephadex G10 диаметром 50 мм и высотой 100 мм, элюируя 1%-ным раствором гидроксида калия до содержания хлорина е6 - 90%, пурпурина 5 - 5% и пурпурина 18 - 5%. Прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, юстируют водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 7,5 мас.% и получают 6,8 г "Жидкого экстракта хлоринов", 7,5%. Электронный спектр продукта см. на фиг. 8.

Пример 5. Частный случай получения ФС - получение лекарственной формы "Радахлорин, 0,1%-ный раствор для инъекций".

После гель-фильтрации к раствору ФС из примера 4 прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, этот осадок отфильтровывают, прибавляют концентрированный раствор гидроксида натрия в воде апирогенной для инъекций до рН 7,5 и воду апирогенную для инъекций до содержания ФС 0,1%, после чего раствор отфильтровывают от бактерий через антибактериальный микропористый фильтр "Millipore" с диаметром пор 0,22 μм. Выход - 500 мл раствора. Электронный спектр продукта см. на фиг. 8.

Пример 6. Частный случай получения ФС - получение лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин").

После гель-фильтрации к раствору ФС из примера 4 прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, этот осадок отфильтровывают, прибавляют концентрированный раствор гидроксида калия до рН 7, после чего при контроле по рН-метру доводят раствор N-метил-D-глюкамином до рН 8,5, прибавляют воду апирогенную для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 0,5 мас.% и отфильтровывают от бактерий через антибактериальный микропористый фильтр "Millipore" с диаметром пор 0,22 μм. Выход - 100 мл раствора. Электронный спектр продукта см. на фиг. 8.

Пример 7. Частный случай получения ФС - получение лекарственной формы "Радахлорин, 1%-ный раствор для инъекций".

После гель-фильтрации к раствору ФС из примера 4 прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, этот осадок отфильтровывают, прибавляют концентрированный раствор гидроксида натрия до рН 8,5, после чего прибавляют воду апирогенную для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 1 мас. % и отфильтровывают от бактерий через антибактериальный микропористый фильтр "Millipore" с диаметром пор 0,22 μм. Выход - 50 мл раствора. Электронный спектр продукта см. на фиг. 8.

Пример 8. Частный случай получения ФС - получение лекарственных форм "Радахлорин, гель".

После гель-фильтрации к раствору ФС из примера 4 прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, этот осадок отделяют центрифугированием, юстируют водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 6,5 мас.%, и далее поступают согласно вариантам:
Вариант (а). К 75 мл воды и 5 г диметилсульфоксида прибавляют при комнатной температуре 0,3 г Pemulen TR1 или Carbopol 2020 (BF Goodrich, UK) и перемешивают в течение 1/4-8 часов. Прибавляют водный раствор щелочи до рН 5. Ресуспендируют гель с добавлением "Жидкого экстракта хлоринов", 6,5% и воды так, чтобы содержание хлорина е6 в готовом геле составляло 0,05%, и вакуумируют 5 мин при 10-50 мм рт. ст. Выход - 100 г геля.

Вариант (б). К 70 мл воды прибавляют при комнатной температуре 5 г диметилсульфоксида и "Жидкий экстракт хлоринов", 6,5%, так, чтобы содержание хлорина е6 в готовом геле составляло 0,05%, а затем добавляют 15 г Aculyn 33A (ISP, USA). Перемешивают до однородности и прибавляют водный раствор щелочи до рН 5. Вакуумируют 5 мин при 10-50 мм рт. ст. Выход - 100 г геля.

После гель-фильтрации к раствору ФС из примера 4 прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, этот осадок отделяют центрифугированием, юстируют водой апирогенной для инъекций до содержания фотосенсибилизатора 7,5 мас.%, и далее возможны варианты:
Вариант (в). К 60 мл воды и 20 г диметилсульфоксида прибавляют при комнатной температуре 0,7 г Pemulen TR1 или Carbopol 2020 (BF Goodrich, UK) и перемешивают в течение 1/4-8 часов. Прибавляют водный раствор триэтаноламина до рН 8,5. Ресуспендируют гель с добавлением "Жидкого экстракта хлоринов", 7,5% и воды так, чтобы содержание хлорина е6 в готовом геле составляло 1%, и вакуумируют 5 мин при 10-50 мм рт. ст. Выход - 100 г геля.

Вариант (г). К 55 мл воды прибавляют при комнатной температуре 20 г диметилсульфоксида и "Жидкий экстракт хлоринов", 7,5%, так, чтобы содержание хлорина е6 в готовом геле составляло 1%, а затем добавляют 15 г Aculyn 33A (ISP, USA). Перемешивают до однородности и прибавляют водный раствор триэтаноламина до рН 8,5. Вакуумируют 5 мин при 10-50 мм рт. ст. Выход - 100 г геля.

Пример 9. Частный случай получения ФС - получение лекарственных форм "Радахлорин, раствор в диметилсульфоксиде для наружного применения".

Вариант (а). После гель-фильтрации в примере 4 к смеси прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, этот осадок отфильтровывают, юстируют водой апирогенной для инъекций до содержания ФС 7,5 мас.%, и 14 г полученного "Жидкого экстракта хлоринов" прибавляют к 86 г диметилсульфоксида при комнатной температуре, чтобы содержание хлорина е6 в готовом растворе составляло 1%, и перемешивают до однородности. Выход - 100 г раствора.

Вариант (б). После гель-фильтрации в примере 4 к смеси прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка ФС, этот осадок отфильтровывают, юстируют водой апирогенной для инъекций до содержания ФС 7,5 мас.% и 0,8 г данного "Жидкого экстракта хлоринов" при комнатной температуре прибавляют к 99,2 г диметилсульфоксида, чтобы содержание хлорина е6 в готовом растворе составляло 0,05%, и перемешивают до однородности. Выход - 100 г раствора.

Пример 10. Для идентификации пурпурина 5 реакционную массу из примера 2 подвергают гель-фильтрации на колонке с Sephadex G10, элюируя 1%-ным раствором N-метил-D-глюкамина. Получают 3 фракции, из которых первая и вторая содержат пурпурин 5. Их нейтрализуют, осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе-метаноле 1:1 и этерифицируют диазометаном. Промывают водой, органическую фазу отделяют, сушат безводным сульфатом магния, концентрируют упариванием в вакууме и хроматографируют на силикагеле Merck, Kieselgel, 0,04-0,063, собирая последнюю (наименее подвижную) фракцию. Полученный диметиловый эфир пурпурина 5 (10,1% в пересчете на сухую реакционную массу, взятую для этерификации) при необходимости хроматографируют повторно.

ПМР-спектр (фиг. 15): (ДМСО-D6, конц. раствор): 9,64, 9,46, 8,82 (с, ), 8,06 (2д, ), 6,82 (с, γ- мезо ), 6,34, 6,31, 6,19, 6,16 (2д, ), 4,54 (м, ), 4,46 (м, ), 3,61 (к, ), 4,20, 3,81, 3,57, 3,53, 3,47 (5с, и ядерные ), 2,38, 2,35 (2м, ), 2,68, 1,85, (2м, ), 1,73 (д, ), 1,70 (т, ) м.д.

Масс-спектр (фиг. 16): e.i., М+ (%), 594 (8,6), 566 (100,0), 505 (5,1), 491 (9,8), 475 (8,2), 463 (1,7), 447 (1,4), 433 (1,7), 403 (2,0), 262 (5,0).

Спектр поглощения в видимой области (фиг. 17): λ (ε) (хлороформ), 408 (117200), 501 (11380), 542 (9830), 617 (6720), 668 (35200).

Диметиловый эфир пурпурина 5 растворяют в ацетоне и прибавляют конц. соляную кислоту (37%) в соотношении 1:2. Перемешивают 2 часа при 25oС, нейтрализуют, пурпурин 5 отфильтровывают, промывают водой, растворяют в 10%-ном растворе N-метил-D-глюкамина и подвергают гель-фильтрации на колонке с Sephadex G10, элюируя 1%-ным раствором N-метил-D-глюкамина, собирая вторую фракцию, нейтрализуют, осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат над пятиокисью фосфора до постоянного веса. Получают пурпурин 5 (5,2% в пересчете на сухую реакционную массу, взятую для этерификации).

ПМР-спектр (фиг. 12): (ДМСО-D6, конц. раствор): 9,55, 9,39, 8,79 (с, ), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2д, ), 6,84 (с, ), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2д, ), 4,60 (м, ), 4,45 (м, ), 3,55 (к, ), 3,75, 3,46, 3,23 (с, ядерные ), 2,38, 2,32 (2м, ), 2,71, 2,20 (2м, ), 1,76 (д, ), 1,72 (т, 4-) м.д.

Масс-спектр (фиг. 13): e.i., M+ (%), 566 (8,2), 494 (100,0), 447 (9,1), 435 (49,6), 421 (12,7), 405 (6,6), 254 (7,1).

Спектр поглощения в видимой области (фиг. 14): λ (ε) (этанол), 408 (116900), 501 (11320), 540 (9790), 615 (6710), 665 (35090).

Пример 11. Изучение фармакокинетики и метаболизма, субстанции "Жидкого экстракта хлоринов" и лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин").

Мышам линии Bulb/c внутрибрюшинно вводят 769,2 мг/кг 6,5%-ной субстанции "Жидкого экстракта хлоринов" из примера 2 (50 мг/кг в расчете на безводную субстанцию хлоринов). Через 3 часа после введения производят забой мышей (в каждой группе по 3 мыши). Материал печени, почек, селезенки, легких, тонкого кишечника, опухоли, окружающей мышечную ткань, а также крови, мочи, кала из толстого кишечника весом по 100 мг подвергают тщательной гомогенизации в стеклянных гомогенизаторах с добавлением 4 мл физиологического раствора. Для исследования биологических жидкостей (кровь, моча) берут по 0,1 мл каждой с последующим растворением в 4 мл физиологического раствора. Полученные гомогенаты исследуют на спектрофлоуриметре фирмы " Perkin-Elmer" (модели MPF-44A).

Аналогично проводят изучение лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин"), в гомогенатах органов и тканей мышей, которым препарат вводится внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг, с забоем животных через 3 ч после введения.

В обоих случаях имеется смещение максимума интенсивности флюоресценции в тканях печени, тонкого кишечника, селезенки и почек к 670 нм (на 10-12 нм по сравнению с 0,01 М боратным буферным раствором, рН 9,2 и на 5-6 нм по сравнению с 0,01 М боратным буферным раствором, рН 9,2 с добавлением 1% сывороточного альбумина человека), что свидетельствует о метаболизме "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") (фиг. 5).

Это явление в спектрах флюоресценции выглядит иначе, чем обыкновенное уширение спектра и сдвиг в длинноволновую область вследствие влияния гидрофобности среды (например, после гидрофобного взаимодействия с белками, липопротеинами). Смещение максимума интенсивности наблюдается без уширения полосы или с небольшим уширением, что характерно для образования нового соединения. Спектры флюоресценции пурпурина 5 в 0,01 М боратном буферном растворе, рН 9,2 с добавлением 1% сывороточного альбумина человека характеризуются наличием в них полосы 670 нм.

В крови, легочной паренхиме, а также в коже и опухоли наблюдается уширение спектров в 1,4-1,5 раза на длине волны 669 нм, что свидетельствует о наличии в гомогенатах смеси "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") (его комплекса с белками) и метаболита.

При добавлении "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") непосредственно в пробирки с гомогенатами тканей интактных животных в концентрациях 0,5-1,0 μM, в крови, тонком кишечнике, печени, селезенке и легких тестируется метаболит "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") (смещение в длинноволновую область без уширения спектра), и только в гомогенате кожи наблюдается незначительное увеличение полуширины спектра в 1,15 раз, что свидетельствует о присутствии в образце смеси "Фотохлорин" - метаболит.

При увеличении концентрации "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") до 5-10 μM в гомогенатах органов, практически во всех образцах регистрируется наличие смеси хлорин е6 - пурпурин 5 (смещение спектров в длинноволновую область при увеличении полуширины спектров в 1,15-1,05 раз).

Таким образом, можно считать, что образование метаболита при добавлении "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") в гомогенаты зависит от концентрации препарата и активности ферментов гомогенизированной ткани.

Данные эксперименты наглядно свидетельствуют о превращении хлорина е6 в пурпурин 5 в условиях in vivo и ex vivo. Это превращение подобно превращению хлорина е6 в пурпурин 5 при нагревании.

Пример 12. Коэффициент распределения н-октанол/фосфатный буфер, рН 7,4. Встряхивают в течение 20 с 300 мл н-октанола и 300 мл фосфатного буферного раствора, рН 7,4 и для расслаивания центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. В подготовленных таким образом буферном растворе (2 мл) и н-октаноле (8 мл) растворяют аликвоту ФС объемом 0,1 мл с концентрацией ФС 5 мг/мл и определяют максимум поглощения на длине волны 406 нм. Получают значения Dкo и Dкб, где о - н-октанол, б - фосфатный буфер, к - контроль. Равновесного распределения н-октанол/фосфатный буфер добиваются, встряхивая при 20oС 2 мл фосфатного буфера и 8 мл н-октанола с 0,1 мл ФС в течение 20 сек с последующим центрифугированием 10 мин при 10000 об/мин. Измеряя оптическую плотность каждой из фаз при 406 нм, получают значения Dо и Dб, где о - н-октанол, б - фосфатный буфер.

Кр определяют по формуле:
Kp=(DoVoDкoVкo)/(DбVбDкбVкб), где Vо - объем октанола, взятый для определения равновесного распределения (8 мл), Vок - объем октанола, насыщенного водой, взятый для контрольного определения поглощения аликвоты (8 мл), Vб - объем буфера, взятый для определения равновесного распределения (2 мл), Vкб - объем буфера, насыщенного октанолом, взятый для контрольного определения поглощения аликвоты (2 мл). Эксперимент проводят в 3-х повторах и полученные значения Кр усредняют.

Получают значение 1,4±0,3.

Пример 13. Определение фотоцитотоксичности (биологической активности) и цитотоксичности (клеточной токсичности) in vitro лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин").

В работе используют ламинар фирмы "Flow Lab" (UK), СО2-инкубатор "Flow Lab" (UK), мультискан "Bio-Tek Instruments" (USA), среды и сыворотки фирмы "ПанЭко" (Россия).

На один опыт клетки одной линии пассируют в два 48-луночных планшета: для облучения лазером и для "темнового" опыта. На следующий день к клеткам в состоянии конфлюента добавляют препарат и планшеты далее термостатируют в черной бумаге. Исследуют концентрации препарата 0,1, 0,5, 2,0 и 5,0 μM. Через 3 часа после добавления препарата облучают клетки лазером, причем экспозиционная доза облучения составляет 50 Дж/см2, и через 39 часов после этого проводят МТТ-тест и инкубацию с 14С-тимидином для оценки величины синтеза ДНК (и в "темновом" планшете тоже). Во всех случаях верхняя часть планшета используется для МТТ-теста, а нижняя для измерения величины синтеза ДНК, а также числа клеток после их окрашивания кристалл-виолетом.

Приведенные в табл. 2 результаты являются средними из 4-х параллельных опытов.

Пример 14. Изучение токсических свойств субстанции "Жидкий экстракт хлоринов" и лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин") in vivo.

Токсичность изучают при внутривенном введении ФС лабораторным белым мышам массой тела 19-21 г (питомник РАМП, отделение Крюково). Животных содержат в стандартных условиях вивария и кормление проводят в соответствии с Приказом Минздрава СССР 1179 от 10.10.83 года "Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения".

Токсичность определяют по гибели животных, после расчета среднесмертельной дозы - LD50. Расчет проводят статистическими методами, рекомендованными Государственной Фармакопеей XI издания (1,3). На основании LD50 определяют принадлежность исследуемого вещества к определенному классу токсичности по Hodge и Sterner. Также проводят учет реакций интоксикации в ходе эксперимента.

В опыт отбирают мышей в количестве 12 особей (6 самцов и 6 самок) на каждую испытуемую дозу ФС. Для определения LD50 ФС исследуют следующие дозы: 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 мг/кг. Раствор с концентрацией 5 мг/мл ФС вводят мышам внутривенно, варьируя дозу объемом введенного ФС.

Получают значение LD50, равное 210,53±22,2 мг/кг, LD10, равное 169,87 мг/кг.

Пример 15. Биологическая активность in vivo с использованием лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин").

Изучение фотодинамической активности лекарственной формы "Радахлорина, 0,5%-ного раствора для инъекций" ("Фотохлорина") проводят на мышах линии Balb/c с перевитой в мышцу задней лапы эмбриокарциномой Т36. Вес мышей - 20-21 г. Процедуру облучения осуществляют диодным лазером МЛ-662-СП через 2 недели после перевивки опухоли. Перед началом облучения проводят предварительную депиляцию кожи в области облучения.

Препарат вводят внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг веса, что соответствует достаточной терапевтической дозе. Для проведения процедуры облучения мышей вводят в эфирный наркоз. Вес опухолей в контрольной и опытной группе в момент эксперимента варьирует от 0,9 до 1 г. Облучение проводят через 5-6 часов после введения ФС. Каждое животное, за исключением контрольных, подвергается однократной процедуре облучения, затем проводятся наблюдения в течение месяца после проведенного воздействия, регистрируется площадь некроза опухолей и общее физиологическое состояние.

Средняя плотность экспозиционной дозы облучения составляет 150 или 300 Дж/см2.

Наилучшие результаты в виде полного некроза опухоли, образования корочки через 1 неделю после ФДТ и ее отпадания через 1,5 мес после ФДТ наблюдают в группе, получившей световую дозу 300 Дж/см2.

Пример 16. Лечение базально-клеточного рака кожи с использованием лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор для инъекций" ("Фотохлорин").

При цитологическом исследовании соскоба устанавливают диагноз: базально-клеточный рак кожи. Препарат вводят внутривенно капельно из расчета 0,7 мг/кг веса больного после разведения его в 100 мл 0,9% стерильного физиологического раствора NaCl. Через 2-3 часа без анестезии проводят облучение опухоли диодным лазером МЛ-662-СП с длиной волны 662 нм с поверхностной дозой 50 Дж/см2. Во время введения препарата и лазерного облучения не отмечают каких-либо нежелательных побочных реакций. Через 2 часа после облучения на месте опухоли наблюдают очаг темно-коричневого цвета с зоной покраснения кожи вокруг до 1-2 см. К концу первых суток на месте опухоли формируется некроз в виде сухой корочки темно-коричневого цвета (струп). Спустя 2-3 недели происходит отторжение струпа и через 2 недели после отторжения струпа на месте бывшей базалиомы происходит полная эпителизация дефекта кожи на месте опухоли с хорошим косметическим эффектом.

Пример 17. Лечение базально-клеточного рака кожи с использованием лекарственной формы "Радахлорин, 0,05%-ный гель".

При цитологическом исследовании соскоба устанавливают диагноз: базально-клеточный рак кожи. Гель наносят тонким слоем на опухоль, по возможности не задевая здоровую часть кожи. Облучение проводят через 20-40 минут после нанесения геля. Процедуру облучения осуществляют диодным лазером ML-662-SP (производство "Милон-Сигм Плюс", Россия) с длиной волны 662 нм. Плотность экспозиционной дозы облучения составляет 2500 Дж/см2. Через 2 часа после облучения на месте опухоли наблюдают очаг темно-коричневого цвета с зоной покраснения кожи вокруг до 1-2 см. Через 1 неделю на месте опухоли формируется некроз в виде сухой корочки темно-коричневого цвета (струп). Спустя 2 недели происходит отторжение струпа и через 2 недели после отторжения струпа на месте бывшей базалиомы происходит полная эпителизация дефекта кожи на месте опухоли с хорошим косметическим эффектом.

Пример 18. Удаление татуировки с использованием лекарственной формы "Радахлорин, 0,5%-ный раствор в диметилсульфоксиде для наружного применения". Наносят раствор на салфетку и накладывают ее поверх татуировки, закрывают черной бумагой или тонкой алюминиевой фольгой и фиксируют на 30 мин. Удаляют излишки раствора с поверхности ваткой, смоченной спиртом. Процедуру облучения осуществляют диодным лазером ML-662-SP (производство "Милон-Сигм Плюс", Россия) с длиной волны 662 нм, причем облучение ведут, повторяя линии рисунка, стараясь не затрагивать окружающие линии рисунка ткани. Плотность экспозиционной дозы облучения составляет 120 Дж/см2. Через 1 час после облучения на месте рисунка наблюдают покраснение и припухание. К концу 2-х суток формируется "рисунок" темно-коричневого цвета с зоной покраснения кожи вокруг до 1 мм. Через 2 недели на месте рисунка формируется некроз в виде сухой корочки темно-коричневого цвета. Спустя 2 недели происходит отшелушивание корочки вместе с рисунком. При меньших световых дозах процедура идет без некроза путем обесцвечивания красителя, но при этом требуются повторные сеансы. В результате ФДТ на месте татуировки через 6 недель формируется нежно-розовая ткань, мало отличающаяся от окружающей кожи, с хорошим косметическим эффектом.

Похожие патенты RU2183956C1

название год авторы номер документа
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2013
  • Пономарёв Гелий Васильевич
  • Койфман Оскар Иосифович
  • Шестаков Владислав Николаевич
RU2523380C1
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2004
  • Пономарев Гелий Васильевич
  • Тавровский Леонид Даниилович
  • Зарецкий Александр Михайлович
  • Ашмаров Вячеслав Владимирович
  • Баум Рудольф Филиппович
RU2276976C2
СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ГНОЙНОГО ГАЙМОРИТА 2002
  • Наседкин А.Н.
  • Решетников А.В.
  • Грачев С.В.
  • Залевский И.Д.
  • Зенгер В.Г.
  • Кемов Ю.В.
  • Селин В.Н.
  • Абакумова О.Ю.
  • Исаев В.М.
  • Неугодова Н.П.
  • Тюкин В.Ю.
  • Решетников Е.В.
  • Ашуров З.М.
  • Гончаров С.Е.
  • Страховская М.Г.
RU2228775C1
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2008
  • Борисов Виктор Александрович
  • Пономарёв Гелий Васильевич
  • Дерновский Валентин Иванович
RU2367434C1
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2014
  • Батомункуев Андрей Владимирович
  • Ашмаров Вячеслав Владимирович
  • Дауэ Сергей Сергеевич
RU2568597C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИСНАТРИЕВОЙ СОЛИ ХЛОРИНА Е6 2019
  • Жаров Евгений Валерьевич
  • Жаров Илья Евгеньевич
  • Логинов Федор Викторович
RU2705199C1
Средство на основе липосомной формы фотосенсибилизатора и способ его получения для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта, носоглотки и верхних дыхательных путей 2021
  • Решетников Андрей Валентинович
  • Каличкин Алексей Олегович
  • Панина Лариса Анатольевна
RU2770517C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ХЛОРИНОВ 1998
  • Пономарев Г.В.
  • Решетников А.В.
  • Гусева-Донская Т.Н.
  • Швец В.И.
  • Баум Р.Ф.
  • Ашмаров В.В.
RU2144538C1
ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИГЛИОМНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ГЛИОБЛАСТОМЫ 2022
  • Катанаев Владимир Леонидович
  • Силачев Денис Николаевич
  • Хотимченко Юрий Степанович
RU2794666C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУРПУРИНА-18 1992
  • Козырев А.Н.
  • Миронов А.Ф.
  • Брандис А.С.
  • Некрасова В.Б.
  • Никитина Т.В.
  • Курныгина В.Т.
  • Фрагина А.И.
RU2054944C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 183 956 C1

Реферат патента 2002 года ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к медицине и касается фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии и способа его получения, включающего щелочные соли хлорина е6, пурпурина 5 и хлорина р6, характеризующегося оптимальной скоростью накопления в опухоли и выведения его из опухоли, а также высокой стабильностью. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 18 ил., 3 табл.

Формула изобретения RU 2 183 956 C1

1. Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии, характеризующийся тем, что он включает щелочную соль 13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил] -15-карбоксиметил-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирина (хлорина е6) формулы

в количестве 80-90%; щелочную соль 13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил] -15-формил-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфирина (пурпурина 5) формулы

в количестве 5-20%; а также щелочную соль 13-карбокси-17-[2-карбоксиэтил] -15-карбокси-17,18-транс-дигидро-3-винил-8-этил-2,7,12,18-тетраметилпорфорина (хлорина р6) формулы

в количестве - остальное.
2. Фотосенсибилизатор по п. 1 в форме водного раствора или геля. 3. Фотосенсибилизатор по пп. 1 и 2, характеризующийся тем, что в качестве щелочного металла используют натрий. 4. Фотосенсибилизатор по пп. 1 и 2, характеризующийся тем, что в качестве щелочного металла используют калий. 5. Способ получения фотосенсибилизатора по пп. 1-4, согласно которому обрабатывают биомассу Spirulina ацетоном до полного извлечения хлорофилла a, отфильтровывают биомассу или центрифугируют ее, обрабатывают экстракт кислотой до удаления из молекулы хлорофилла иона магния и гидролиза фитиловой эфирной группы, экстракт нейтрализуют буферным раствором, отфильтровывают выпавший феофитин a и гидролизуют его смесью соляная кислота-ацетон-гексан, причем на 1 г неочищенного феофитина a берут 6-16 мл ацетона, 0,6-6 мл гексана и 5-10 мл концентрированной соляной кислоты, нагревают смесь до температуры 40-60oС, перемешивают 20 мин - 1 ч, прибавляют гексан 6-16 мл и органическую фазу промывают смесью ацетона и концентрированной соляной кислоты (2-10): 1, водную фазу промывают гексаном, нейтрализуют объединенную водную фазу, содержащую феофорбид a, избытком водного буферного раствора, отделяют выпавший феофорбид a путем фильтрации, промывают водой, переосаждают из смеси ацетон-вода, сушат на воздухе до постоянного веса, растворяют феофорбид a в ацетоне, добавляют водный раствор сильного неорганического основания с концентрацией 0,05-1,00%, после чего перемешивают при 30-60oС в течение 5-30 мин, прибавляют дополнительное количество водного раствора сильного неорганического основания с концентрацией 1-50%, нагревают при 40-60oС в течение 20-90 мин, нейтрализуют смесь разбавленной соляной кислотой, отделяют осадок центрифугированием, промывают дистиллированной водой до исчезновения кислой реакции, переосаждают из ацетона для отделения линейных тетрапирролов, отфильтровывают и промывают его дистиллированной водой, нагревают в герметичной емкости в интервале температур 40-100oС в течение 1 ч - 30 сут и охлаждают с последующим, в случае необходимости, добавлением воды и основания. 6. Способ получения фотосенсибилизатора по п. 5, отличающийся тем, что после охлаждения и добавления воды и основания фотосенсибилизатор подвергают гель-фильтрации до содержания хлорина е6 80-90%, пурпурина 5 5-20% и хлорина р6 - остальное, прибавляют разбавленный раствор соляной кислоты до выпадения осадка фотосенсибилизатора, отфильтровывают его, промывают водой, юстируют раствором основания до рН 7,5-8,5 и водой апирогенной до содержания фотосенсибилизатора 6,5-7,5 мас. %. 7. Способ получения фотосенсибилизатора по пп. 5 и 6, отличающийся тем, что к фотосенсибилизатору прибавляют фармацевтически приемлемые добавки, раствор юстируют и отфильтровывают от бактерий. 8. Способ получения фотосенсибилизатора по пп. 5 и 6, отличающийся тем, что фотосенсибилизатор диспергируют в гелевой основе, прибавляют фармацевтически приемлемые добавки и воду и юстируют. 9. Способ получения фотосенсибилизатора по пп. 5 и 6, отличающийся тем, что фотосенсибилизатор смешивают с диметилсульфоксидом.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2002 года RU2183956C1

СРЕДСТВО ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 1999
  • Альбицкая О.Н.(Ru)
  • Журавкин Иван Никифорович
  • Каплан М.А.(Ru)
  • Кочубеева Нина Даниловна
  • Мещерякова А.Л.(Ru)
  • Петров Петр Тимофеевич
  • Саржевская Марина Васильевна
  • Тюрин Виталий Иванович
  • Царенков Валерий Минович
RU2152790C1
RU 99117522 А, 10.06.2001
ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОЙ ИНАКТИВАЦИИ КЛЕТОК В КРОВИ И ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ИММУННОЙ ДИСФУНКЦИЕЙ 1995
  • Саймон Леонг
  • Агнес Хоу-Чинг Чан
  • Дэвид Уилльям Кэри Хант
  • Мартин Ренке
  • Джулия Леви
  • Джанис Норт
RU2166331C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 18-КАРБОКСИ-20-(КАРБОКСИМЕТИЛ)-8-ЭТЕНИЛ-13-ЭТИЛ-2,3-ДИГИДРО-3,7-12,17-ТЕТРАМЕТИЛ-21Н, 23НПОРФИН-2-ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЛИ ЕЕ СОЛЕЙ 1993
  • Альбицкая О.Н.
  • Ашмаров В.В.
  • Мещерякова А.Л.
RU2054476C1
Торфодобывающая машина с вращающимся измельчающим орудием 1922
  • Рогов И.А.
SU87A1
US 5216012 А, 01.06.1993
US 5330741 А, 19.07.1994
US 5534506 А, 09.07.1996.

RU 2 183 956 C1

Авторы

Решетников А.В.

Залевский И.Д.

Кемов Ю.В.

Иванов А.В.

Карменян А.В.

Градюшко А.Т.

Лаптев В.П.

Неугодова Н.П.

Абакумова О.Ю.

Привалов В.А.

Лаппа А.В.

Романов В.А.

Даты

2002-06-27Публикация

2001-03-30Подача