ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИГЛИОМНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ГЛИОБЛАСТОМЫ Российский патент 2023 года по МПК A61K35/616 A61N5/67 A61P35/00 

Настоящая группа изобретений относится к медицине и фармацевтике, а более конкретно к средствам для фотодинамической терапии (ФДТ) новообразований, в частности глиобластомы, и способам проведения ФДТ с их использованием.

В настоящее время в клинической медицине в качестве препаратов-фотосенсибилизаторов (ФС) для ФДТ используются порфирины, фталоцианины, хлорины и их производные.

Порфирины являются циклическими соединениями, образованными четырьмя пиррольными кольцами, связанными между собой метенильными мостиками. Молекулы порфиринов способны образовывать комплексы с ионами металлов, которые связываются с атомами азота пиррольных колец. Первые фотосенсибилизаторы на основе порфиринов были синтезированы из гематопорфирина. Водорастворимые порфирины могут быть получены сульфонированием, карбоксилированием или алкилированием N-пиридилзамещенных соединений.

Фталоцианины представляют собой структурно родственные порфиринам тетраазобензопорфирины, состоящие из изоиндольных колец, соединенные между собой через sp2-гибридизованный атом азота [1].

Хлорины представляют собой порфирины с одной восстановленной связью и обладают выраженным поглощением в красной области спектра (терапевтическое окно проницаемости тканей) с ε₆₈₀ = 0.4⋅10⁵ M⁻¹ см⁻¹ [2]. Хлориновые фотосенсибилизаторы получают двумя путями: модификацией хлорофилла, предварительно выделенного из растительного сырья, или химическим синтезом.

Сложные соединения, получаемые путем химического синтеза, дорогостоящие и значительно превышают затраты на ФДТ; нестабильность синтетических фотосенсибилизаторов в жидкостях организма также представляет проблему [3].

Установлено, что найденное заявителем соединение (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановая кислота (далее - ЭТФК), относится к хлоринам. По технической сущности наиболее близкими к предлагаемому фотосенсибилизатору являются производные хлоринового ряда, такие как радахлорин [4], фотолон [5], фоскан и фотодитазин [6].

Все известные соединения имеют недостатки, ограничивающие эффективность их использования для фотодинамической терапии.

Так, радахлорин является смесью хлоринов из Spirulina platensis и состоит из натриевых солей хлорина е₆ (80-90%), пурпурина-5 (5-20%) и пурпурина-18, который в щелочной среде превращается в хлорин р6. Однако полученная смесь веществ затрудняет фармацевтическую стандартизацию препарата. Радахлорин выпускается в форме раствора для внутривенного введения и геля для наружного применения и рекомендован для флуоресцентной диагностики рака кожи и ФДТ поверхностных опухолей кожи.

Фотолон, первоначально получаемый из травы крапивы и содержащий смесь более 15 производных хлорофиллов а и b, позже стали выделять из цианобактерий Spirulina, что сократило число производных хлорофилла b. Препарат представляет собой фармацевтическую композицию, состоящую из натриевых солей хлорина е₆ и поливинилпирролидона, при этом взаимное содержание хлорина е6 и ПВП может варьировать в очень широких пределах (в соотношении (масс. %): хлорина е₆ - 40-90, ПВП - 10-60% [7, 8]. Помимо хлорина е6 в препарате обнаружены хлориновые и порфириновые производные, наличие которых обусловлено выделением исходного полупродукта феофитина а из спирулины с содержанием основного вещества не выше 90-95%. Использование феофитина а как исходного сырья для синтеза из него хлорина е₆ приводит к получению конечного препарата, содержащего кроме хлорина е₆ ряд других хлоринов. Смесь компонентов в фотолоне также затрудняет стандартизацию препарата. Кроме того, наличие примесей даже хлориновой природы заметно снижает эффективность препарата как фотосенсибилизатора.

Фотолон выпускается в виде лиофилизата и предназначен для ФДТ рака кожи, рака молочной железы и их внутрикожных метастазов, рака слизистых оболочек вульвы, рака пищевода и рака прямой кишки.

Химически синтезированное соединение мезо-тетра-(гидрофенил)-хлорин является активным компонентом препарата фоскан, который в Европейском союзе разрешен для лечения опухолей шеи и головы [9] и применяется для терапии базальноклеточного рака [10], рака предстательной железы [11] и рака поджелудочной железы [12]. Препарат выпускается в форме раствора.

Недостатками фоскана являются продолжительный интервал между введением препарата и облучением (4 суток) и медленная скорость выведения из организма (до 2 недель), что вызывает фототоксичность.

Известный ФС фотодитазин представляет собой ди-N-метилглюкаминовую соль хлорина е₆ и является производным хлорофилла α, выделенным из биомассы микроводоросли (цианобактерий) Spirulina platensis. Фотодитазин содержит хлорин е6, N-метил-D-глюкамин в мольном соотношении 1:2 и поливинилпирролидон с молекулярным весом от 9600 до 11500. Лекарственной формой фотодитазина является концентрат для приготовления раствора, применяемый для ФДТ плоскоклеточного и базальноклеточного рака кожи и рака легкого [6]. Более того, фотодитазин недостаточно устойчив и обладает ограниченным сроком хранения.

Общими недостатками известных вышеописанных средств для ФДТ являются недостаточно высокая селективность накопления ФС в опухоли, недостаточно высокая эффективность ФДТ, низкая стабильность ФС при длительном хранении.

Однако ни один из перечисленных препаратов не рекомендован для клинического применения в качестве фармакотерапии глиобластомы [13, 3, 14]. Глибластома, наиболее распространенная форма опухоли головного мозга, характеризующаяся низкой реакцией на лечение и крайне неблагоприятным прогнозом (медиана выживаемости < 2 лет) [15].

Следует отметить, что поиск новых эффективных лекарственных препаратов для лечения злокачественных опухолей на сегодняшний день является очень актуальным и злободневным.

Технической проблемой, поставленной перед группой изобретений, является расширение ассортимента фотосенсибилизаторов, обладающих мощной цитотоксической активностью в отношении клеток глиобластомы, и пригодных для использования в фотодинамической терапии для лечения злокачественных новообразований различного генезиса, особенно одной из агрессивных его форм - глиобластомы.

Авторами настоящего изобретения проведено интенсивное исследование в поисках соединения, обладающего хорошей противоопухолевой активностью при малом риске неблагоприятных последствий, и, в результате найдено, что природное соединение (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановая кислота, представляющее собой вещество, содержащееся в тканях морских беспозвоночных офиур Ophiura sarsii, неожиданно показало весьма перспективную потенциальную противоопухолевую активность и в то же время высокий уровень безвредности [16].

Совершенно неожиданным оказалось свойство ЭТФК проявлять цитотоксическую активность в отношении клеток глиобластомы, поскольку ни для одного известного хлорина, к классу которых и относится выделенное природное соединение, такое свойство ранее обнаружено не было. Следует отметить, что глиобластома, наиболее агрессивная форма опухолей головного мозга и центральной нервной системы, характеризуется высокими показателями пролиферации, миграции и инвазии.

Заявленная техническая проблема решается применением природного фотосенсибилизатора ЭТФК, получаемого из природного источника морского беспозвоночного выделенной из офиуры семейства Ophiuroidea, такой как офиуры рода Ophiura, такой как Ophiura sarsii, в обладающего цитотоксической антиглиомной активностью и способом фотодинамической терапии глиобластомы.

Заявителем, прежде всего, было подтверждено, что ЭТФК обладает мощной цитотоксической активностью в отношении клеток глиобастомы, (Пример 1), антиглиомной цитотоксичностью (Пример 2). Использование в качестве сырьевого источника для получения фотосенсибилизатора морских беспозвоночных Ophiura sarsii позволило не только получить новый природный фотосенсибилизатор ЭТФК, обладающий отличными цитотоксичными свойствами простым способом, но и использовать его для ФДТ глиобластомы. Обилие ЭТФК в офиуре O. sarsii, легкость ее выделения и очистки, а также многообещающие приложения в ФДТ делают привлекательными возможности масштабирования производства этого натурального продукта. Указанные офиуры широко распространены от Северной Атлантики до Арктики, вплоть до северной части Тихого океана, обитающие в водах от мелководья до больших глубин, легко добываются и являются доступным сырьем для получения [17].

Заявленный технический результат достигается также способом ФДТ глиобластомы. Способ фотодинамической терапии глиобластомы, характеризующийся тем, что внутривенно вводят фотосенсибилизатор (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановую кислоту в количестве 40 мг/кг массы тела, а затем через 6 часов облучают патологический участок в течение 30 минут лазерным источником света с длиной волны от 580 нм до 780 нм.

Установлено экспериментально, что заявленный технический результат достигается при при проведении облучения глиостомы после введения ЭТФК длиной волны от 580 нм до 780 нм.

Заявленная группа изобретений иллюстрируется:

Таблицей, в которой представлена выживаемость клеток глиомы линии С6 при различных концентрациях (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановой кислоты (ЭТФК) после облучения светом (580-780 нм) и примерами, представленными ниже.

Для проведения испытания на антиглиомную активность и способа ФДТ получали ЭТФК в соответствии со способом, разработанным авторами и представленным в статье [16].

Конечный продукт представляет собой аморфное твердое вещество темно-коричневого цвета. Продукт может быть подвергнут лиофильной сушке с последующим хранением при температуре не выше 7°C.

Пример 1. Определение антиглиомной цитотоксичности (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановой кислоты (ЭТФК) после облучения in vitro.

Клетки глиомы линии С6 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% антибиотика-антимикотика и выращивали в СО₂-инкубаторе, снабженном системами мониторинга и жизнеобеспечения, при 37°C и 5% СО₂. Для оценки фототоксичности ЭТФК растворяли в ДМСО. Клетки глиомы С6 высевали в 96-луночных планшетах для микрокультур с плотностью 3000 клеток/лунку. В каждую лунку добавляли 50 мкл фосфатного буфера с серийными разведениями ЭТФК и оставляли на 2 часа. Конечные концентрации ЭТФК составляли 0,3, 0,6, 1,2, 2,3, 4,6, 9,3 и 18,6 мкМ. Конечная концентрация ДМСО в лунках < 0,2%. Далее клетки облучали светом в диапазоне длин волн от 580 до 780 нм с использованием светодиодной лампы 2000-4000 люкс в течение 30 мин. Плотность фотосинтетического фотонного потока может варьировать от 217 до 580 мкмоль/м²/с. 200 мкл питательной среды добавляли в каждую лунку для дополнительной инкубации в течение 72 часов в СО₂-инкубаторе при 37°С. Для оценки гибели клеток культуральную среду удаляли и добавляли 50 мкл МТТ (тиазолил синий тетразолия бромид) реагента, растворенного в фосфатном буфере (0,5 мг/мл), и инкубировали в течение 3 часов при 37°C. После аспирации жидкости 100 мкл ДМСО добавляли в каждую лунку и через 5 мин измеряли оптическую плотность при длинах волн 580 и 780 нм с использованием многофункционального планшет-ридера. Для установления светонезависимой цитотоксичности ЭТФК процедуру МТТ проводили в темноте. Темновую цитотоксичность определяли при концентрациях ЭТФК от 0,3 до 400 мкМ. Темновая цитотоксичность ЭТФК в отношении клеток С6 отсутствовала при всех исследованных концентрациях. После облучения клеток С6 светодиодной лампой наблюдали дозозависимое увеличение цитотоксичности ЭТФК (Таблица 1). Полуингибирующая концентрация (IC₅₀) ЭТФК составила 1,9 ± 0,07 мкМ; индекс фототоксичности (ФИ), вычисляемый как отношение темновой IC₅₀ к световой IC₅₀, составил более 210, что свидетельствует об очень высокой цитотоксической эффективности ЭТФК в отношении клеток глиобластомы. Результаты по выживаемости клеток глиомы представлены в таблице.

Таблица Концентрация ЭТФК Выживаемость (%, М ± m) 0,3 мкМ 100 0,6 мкМ 100 1,2 мкМ 96,0 ± 3,30 2,3 мкМ 18,0 ± 2,63 4,6 мкМ 1,1 ± 0,46 9,3 мкМ 0,79 ± 0,48 18,6 мкМ 0

Таким образом, настоящий эксперимент с высокой степенью вероятности доказывает, что тестируемое вещество ЭТФК обладает сильной фотоцитотоксичностью в отношении клеток глиобластомы.

Пример 2. Противоопухолевая активность (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановой кислоты (ЭТФК) при экспериментальной глиобластоме при облучении лазерным светом с длиной волны 650 нм.

Культуральные клетки глиомы С6, находящиеся в логарифмической фазе роста, собирали с трипсин/версеном и готовили клеточную суспензию (1 × 10⁶ клеток/мл) для проведения внутричерепной стереотаксической имплантации мышам линии C57BL/6 (массой 18 ± 3 г). Под изофлурановой ингаляционной анестезией (2-2,5 об.%) мышей помещали в стереотаксическую рамку, череп обнажали по средней линии, разрез очищали от соединительной ткани и подсушивали. Имплантацию клеток глиомы C6 (5 × 10⁵ на мышь) проводили с помощью микрошприца со скоростью 3 мкл/мин в 10 мкл фосфатного буфера. Фотодинамическую терапию (ФДТ) проводили через 7 дней после внутричерепной имплантации клеток глиомы и подтверждали рост опухоли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга.

Способ ФДТ осуществляли следующим образом. Мышам с опухолями внутривенно в яремную вену вводили ЭТФК предварительно растворенный в воде для инъекций в дозе 40 мг/кг массы тела за 6 ч до ФДТ. Аппликацию ЭТФК и ФДТ проводили под анестезией изофлураном. Мозговой череп в зоне инсоляции истончали фрезой и освещали в течение 30 мин лазерным источником света (650 нм, выходная мощность 100 мВт), создающим световой пучок диаметром 1,5 мм, на области, соответствующие стереотаксическим координатам предшествующей инъекции опухоли. Поверхность черепа охлаждали физиологическим раствором для избегания термического повреждения головного мозга. Ректальную температуру поддерживали постоянной на уровне 37,0 ± 0,2°C с использованием грелки. После ФДТ животных возвращали в клетки, снабженные водой и едой ad libitum. Действие ФДТ на опухоль у мышей оценивали через 5 дней после процедуры ФДТ с помощью магнитно-резонансной томографии и гистологического исследования ткани опухоли. МРТ анализ T2W-изображений выявил гиперинтенсивный сигнал в областях мозга, подвергшихся лазерному облучению, свидетельствующий о накоплении молекул воды в этих областях, т. е. отек тканей в результате их фотодинамического повреждения. Гистологический анализ подтвердил, что эти участки соответствовали участкам некроза. Площадь зон некроза достигала 15-25% площади ткани опухоли на разрезе. На гистологических препаратах опухоли обнаруживали многочисленные формы (кариорексис, кариопикноз, апоптотические тельца) апоптотических клеток. Описанные изменения в ткани опухоли не были выявлены у облученных лазером мышей без введения ЭТФК.

Пример 3. Противоопухолевая активность (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановой кислоты (ЭТФК) при экспериментальной глиобластоме при облучении лазерным светом с длиной волны 580 нм.

Дизайн эксперимента был аналогичен описанному в примере 2. Мозговой череп освещали в течение 30 мин лазерным источником света (580 нм, выходная мощность 100 мВт). Площадь зон некроза достигала 5-7% площади ткани опухоли на разрезе.

Пример 4. Противоопухолевая активность (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановой кислоты (ЭТФК) при экспериментальной глиобластоме при облучении лазерным светом с длиной волны 780 нм.

Дизайн эксперимента был аналогичен описанному в примере 2. Мозговой череп освещали в течение 30 мин лазерным источником света (780 нм, выходная мощность 100 мВт). Площадь зон некроза достигала 8-10% площади ткани опухоли на разрезе.

Проведенные испытания позволяют утверждать о возможности применения ЭДФК, обладающего цитотоксической антиглиомной активностью в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ глиобластомы. По существу, предлагается новое природное соединение, расширяющее ассортимент хлориновых фотосенсибилизаторов, при этом высокоэффективного в отношении клеток глиобластомы.

Следует отметить, что заявленное соединение наряду с высокой уникальной антиглиомной активностью, которая крайне необходима для нейрофармакологии, также обладает противораковой активностью, и, как следствие, полученное природное соединение (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановая кислота после проведения клинических испытаний может найти применение в качестве фотосенсибилизатора при лечении других форм рака.

Источники литературы, использованные в описании

1. [Wöhrl, 1993]. Wöhrle D. Phthalocyanines: Properties and applications. Edited byC. C. Leznoff andA. B. P. Lever, VCH, Weinheim. Volume 1, 1989, 436 pp., ISBN 3-527-26955-X; Volume 2, 1993, 305 pp., DM 268, ISBN 3-527-89544-2 // Adv. Mater. 1993. Vol. 5, № 12. P. 942- 943.

2. [Jori G. Far-red-absorbing photosensitizers: their use in the photodynamic therapy of tumours. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 1992. Vol. 62, № 3. P. 371-378.

3. Baskaran, R.; Lee, J.; Yang, S.G. Clinical development of photodynamic agents and therapeutic applications. Biomater. Res. 2018, 22, 25. https://doi.org/10.1186/s40824-018-0140-z.

4. пат. РФ № 2183956, МПК A61K 31/409, A61P 35/00, опубл. 27.06.2002.

5. пат. РФ № 2152790, МПК A61K 31/79 , G01N 33/52 опубл. 20.07.2000.

6. пат. RU №2276976, кл. А61K 31/409, от 10.08.2004.

7. Petrov P.T., Tsarenkov V.M., Meshcheryakova A.P. et al. Agent for photodynamic treatment of malignant tumors - photolon. Republic of Belarus Patent. 1999. № 5651.

8. Petrov P.T., Trukhacheva T., Isakov G.A. et al. Photolon™ an agent for photodynamic diagnosis and therapy: non-clinical and clinical experience. Acta Biooptic Inform. Med. 2004. Vol. 10. P. 6-7. Petrov, 1999, 2004.

9. Kostron H. Photodynamic treatment of malignant brain tumors. In: Spinelli P, Dal Fante M, Marchesini R, eds. Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers. Excerpta Medica, 1992. P. 386-90.

10. Bown S.G., Rogowska A.Z., Whitelaw D.E. et al. Photodynamic therapy for cancer of the pancreas. Gut. 2002. Vol. 50(4). P. 549-57.

11. Moore C.M., Nathan T.R., Lees W.R. et al. Photodynamic therapy using meso tetra hydroxy phenyl chlorin (mTHPC) in early prostate cancer// Lasers Surg. Med. 2006. Vol. 38(5). P. 356-63.

12. Brandis A., Salomon Y., Scherz A. Bacteriochlorophyll sensitizers in photodynamic therapy. In: Grimm B., Porra R.J., Rudiger W. and Scheer H. (eds.) Chlorophylls and Bacteriochlorophylls: Biochemistry, Biophysics and Biological Functions. - Dordrecht, NL, Kluwer, 2005. - P. 461-82.

13. Quirk, B.J.; Brandal, G.; Donlon, S.; Vera, J.C.; Mang, T.S.; Foy, A.B.; Lew, S.M.; Girotti, A.W.; Jogal, S.; LaViolette, P.S.; et al. Photodynamic therapy (PDT) for malignant brain tumors-where do we stand? Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2015, 12, 530-544. https://doi.org/10.1016/j.pdpdt.2015.04.009.

14. Li, X.; Lovell, J.F.; Yoon, J.; Chen, X. Clinical development and potential of photothermal and photodynamic therapies for cancer. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2020, 17, 657-674. https://doi.org/10.1038/s41571-020-0410-2.

15. Tan, A.C.; Ashley, D.M.; Lopez, G.Y.; Malinzak, M.; Friedman, H.S.; Khasraw, M. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA Cancer J. Clin. 2020, 70, 299-312. https://doi.org/10.3322/caac.21613.

16. Antonina Klimenko, Robin Huber, Laurence Marcourt, Estelle Chardonnens, Alexey Koval1, Yuri S. Khotimchenko, Emerson F. Queiroz , Jean-Luc Wolfender, and Vladimir L. Katanaev, A cytotoxic porphyrin from North Pacific brittle star Ophiura sarsii, Marine Drugs, 2020, 18, p. 13.

17. Harris, J.L.; MacIsaac, K.; Gilkinson, K.D.; Kenchington, E.L. Feeding biology of Ophiura sarsii Lutken, 1855 on Banquereau bank and the effects of fishing. Mar. Biol. 2009, 156, 1891-1902.

Сообщаем экспертизе, что основные положения изобретений были опубликованы авторами 8 января 2022 г.

Antonina Klimenko, Elvira E. Rodina, Denis Silachev, Maria Begun, Valentina A. Babenko, Anton S. Benditkis, Anton S. Kozlov, Alexander A. Krasnovsky, Yuri S. Khotimchenko, Vladimir L. Katanaev, «Chlorin Endogenous to the North Pacific Brittle Star Ophiura sarsii for Photodynamic Therapy Applications in Breast Cancer and Glioblastoma Models», Biomedicines 2022, 10(1), 134;

https://doi.org/10.3390/biomedicines10010134

Группа изобретений относится к медицине и фармацевтике, а именно к применению средства для фотодинамической терапии (ФДТ) новообразований и способу проведения ФДТ с его использованием. Применение природного соединения (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановой кислоты, выделенной из офиуры семейства Ophiuroidea, такой как офиуры рода Ophiura, такой как Ophiura sarsii, в качестве фотосенсибилизатора, обладающего цитотоксической антиглиомной активностью. Способ проведения фотодинамической терапии, характеризующийся тем, что внутривенно вводят фотосенсибилизатор (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановую кислоту в количестве 40 мг/кг массы тела, а затем через 6 часов облучают патологический участок - мозговой череп в течение 30 минут лазерным источником света мощностью 100 мВт с длиной волны от 580 до 780 нм. Вышеописанное средство обладает мощной цитотоксической антиглиомной активностью и пригодно для использования в фотодинамической терапии. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

1. Применение природного соединения (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановой кислоты, выделенной из офиуры семейства Ophiuroidea, такой как офиуры рода Ophiura, такой как Ophiura sarsii, в качестве фотосенсибилизатора, обладающего цитотоксической антиглиомной активностью.

2. Способ проведения фотодинамической терапии, характеризующийся тем, что внутривенно вводят фотосенсибилизатор (3S,4S)-14-этил-9-(гидроксиметил)-4,8,13,18-тетраметил-20-оксо-3-форбинпропановую кислоту в количестве 40 мг/кг массы тела, а затем через 6 часов облучают патологический участок - мозговой череп в течение 30 минут лазерным источником света мощностью 100 мВт с длиной волны от 580 до 780 нм.