СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ Российский патент 1996 года по МПК A61K35/48 

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способу получения ферментов, которые могут быть использованы в медицине для приготовления лекарственных средств и в научно-исследовательской работе.

Известен способ получения гиалуронидазы из Streptomyces путем выращивания продуцента на питательной среде, отделения культуральной жидкости, концентрирования раствора, осаждения фермента органическими растворителями и высушивания (авт.св. СССР N 974816, кл. С 12 9/26, 1982).

Данный способ имеет ряд существенных недостатков: длительность процесса, низкий выход целевого продукта, большие объемы культуральной жидкости и органических растворителей, что затрудняет промышленное внедрение препарата.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения препарата из семенников крупного рогатого скота путем экстракции водой, двухкратного осаждения ацетоном при температуре от 0 до -2^оС, выдерживания раствора при температуре 6-10^оС, обработки эфиром и ацетоном (Лидаза. Регламент производства N7-91 Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов. 1991, Харьков).

Данный способ также имеет ряд недостатков: значительная потеря активности фермента за счет тепловых стадий и обработки органическими растворителями, недостаточная очистка от низкомо- лекулярного балласта, большие объемы органических растворителей, низкий выход целевого продукта, длительность технологии.

Изобретение направлено на решение следующих задач: повышение выхода целевого продукта за счет сокращения длительности технологии, удаления балластных белков без обработки агентами, приводящими к денатурации фермента, удаления низкомолекулярных балластных веществ, стандартизация технологии.

При использовании изобретения длительность процесса составляет 6-7 сут (по прототипу 12-14 сут), увеличен выход целевого продукта в 2,5-3,5 раза, что связано с отсутствием обработок ацетоном и сокращением длительности процесса; уменьшено содержание низкомолекулярных примесей: цветность препарата, полученного по предлагаемому способу, при 400 нм не более 0,1 (по прототипу 0,25-0,3) при одинаковом содержании фермента.

Это достигается тем, что полученный экстракт фермента подвергают очистке и концентрации до 1/8-1/10 от исходного объема путем ультрафильтрации через полые волокна, пропускающие белковые молекулы молекулярной массы не более 10000 а. е. м. и осаждения балластных белков при помощи хлороформа и натрия хлористого.

Способ осуществляют следующим образом.

Семенники крупного рогатого скота очищают от оболочек и подвергают измельчению. Полученную массу экстрагируют водным раствором уксусной кислоты при рН 4,5-4,7 в течение 6 ч при температуре 6-10^оС. Затем экстракт подвеpгают центрифугированию и полученный прозрачный раствор концентрируют путем ультрафильтрации на полых волокнах (ВПУ 15) до конечного объема 1/8-1/10 от исходного. Раствор охлаждают до 4-8^оС и смешивают с охлажденным до температуры от -10 до -15^оС хлороформом. Смесь интенсивно перемешивают, прибавляют натрий хлористый и выдерживают в течение 1,5-2 ч, а затем осадок отделяют центрифугированием. Прозрачный фильтрат очищают от хлористого натрия путем ультрафильтрации. Очищенный и концентрированный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофилизации.

П р и м е р 1. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10^оС в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10^оС с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрированию до конечного объема 2,75 л (1/8 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6^оС, медленной струей приливают 110 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа 4 об.) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 159,5 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8^оС в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 мас. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,0 г с активностью 128 условных единиц (УЕ) в 30 мг/мл.

П р и м е р 2. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10^оС в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10^оС с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрируют до конечного объема 2,45 л (1/9 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6^оС, медленной струей приливают 123 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа 5 об.) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 142,1 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8^оС в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 мас. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,3 г с активностью 256 УЕ в 30 мг/мл.

П р и м е р 3. 10 кг очищенных семенников крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и экстрагируют 20 л дистиллированной воды с рН 4,5-4,7 (за счет подкисления уксусной кислотой). Экстракцию проводят при температуре 6-10^оС в течение 6 ч. Полученный экстракт подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин при температуре 6-10^оС с целью отделения прозрачного раствора, содержащего гиалуронидазу, от ткани семенников. Полученный экстракт в объеме 22 л подвергают ультрафильтрации и концентрированию до конечного объема 2,2 л (1/10 от исходного). Полученный концентрированный и очищенный раствор охлаждают до 4-6^оС, медленной струей приливают 132 мл хлороформа (конечная концентрация хлороформа 6 об.) и перемешивают. Затем к полученной смеси прибавляют хлористый натрий в количестве 127,6 г до конечной концентрации 1 моль/л. Раствор выдерживают при температуре 4-8^оС в течение 1 ч и центрифугируют при указанной температуре в течение 20 мин и 3000 об/мин. Осадок удаляют, а прозрачный раствор светло-желтого цвета подвергают очистке на полых волокнах аппарата ВПУ-15 до конечной концентрации натрия хлористого не более 0,05 мас. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливу в ампулы и лиофильному высушиванию. Выход целевого продукта составляет 5,5 г с активностью 256 УЕ в 30 мг/мл.

Выбранные соотношения подтверждаются данными, приведенными в табл. 1 и 2.

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, оптимальным является концентрация раствора 1/8-1/10 от первоначального объема. Использование соотношений, отличающихся от указанных, приводит к снижению активности препарата, что, в свою очередь, снижает выход целевого продукта. Как видно из данных, приведенных в табл. 2, оптимальным является содержание хлороформа в растворе продукта 4-6 об. Использование соотношений, отличающихся от указанных, приводит к снижению активности фермента.

Данные, подтверждающие преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом, приведены в табл. 3.

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способу получения ферментов. Полученные ферменты могут быть использованы в медицине для приготовления лекарственных средств и в научно-исследовательской работе. Изобретение направлено на повышение выхода целевого продукта и улучшение качества препарата. При производстве гиалуронидазы полученный из семенников крупного рогатого скота экстракт фермента очищают. Концентрируют на полых волокнах. Волокна отсекают вещества с молекулярной массой более 10000 а. е. с. до 1/8 - 1/10 от исходного объема. Затем добавляют 4 - 6 об.% хлороформа в присутствии 1 моль/л натрия хлористого. 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ из семенников крупного рогатого скота, включающий измельчение сырья, экстракцию водным раствором уксусной кислоты, обработку органическим растворителем, перемешивание, инкубацию с последующим отделением целевого продукта, его ампулирование и высушивание, отличающийся тем, что после экстракции сырье центрифугируют, надосадочную жидкость подвергают ультрафильтрации и концентрированию до 1/8 - 1/10 от исходного объема, после охлаждения добавляют 4 - 6 об.% хлороформа в присутствии 1 моль/л хлористого натрия, центрифугируют, а супернатант повторно подвергают ультрафильтрации.