СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАНГЛИОЗИДА GM Российский патент 1996 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способам получения индивидуальных ганглиозидов, которые могут быть использованы при изучении структуры и функций клеточных мембран, а также при приготовлении лекарственных и диагностических средств.

Известен способ получения ганглиозида G M₃ из печени крупного рогатого скота путем экстракции суммарных ганглиозидов хлороформом и метанолом, диализом, гельфильтрацией через сефадекс G-50 с последующим выделением G M₃ препаративной тонкослойной хроматографией на силикагеле /1/. Данный способ имеет ряд существенных недостатков: длительность процесса, низкий выход целевого продукта, невозможность промышленного производства по данному способу в связи с использованием препаративной тонкослойной хроматографии, высокая стоимость конечного продукта.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения ганглиозида G M₃, включающий обработку эритроцитов водой, экстракцию смесью хлороформа и метанола, упаривание экстракта суммарных липидов с последующей хроматографией на силикагеле и очисткой на флоризиле /2/. К недостаткам способа можно отнести: низкий выход целевого продукта - ганглиозида G M₃ (40-50 мг из 1 л эритроцитарной массы), что связано с потерей продукта при проведении хроматографии на силикагеле, а также с неполной экстракцией ганглиозидов из исходного сырья.

Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта ганглиозида G M₃.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения ганглиозида G M₃ гемолиз эритроцитов проводят смесью ледяной уксусной кислоты и воды при соотношении /0,9-1,1/:/90-110/ с последующим осаждением ацетоном при соотношении раствор: ацетон 1:/2,8-3,2/, после экстракции осадка смесью хлороформ-метанол дополнительную экстракцию проводят смесью 70% пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80:20, экстракт упаривают, разбавляют водой, объединяют с хлороформметанольным экстрактом и отделяют метанольный слой, хроматографию осуществляют на Q AE-сефадексе с десорбцией целевого продукта 0,05 М раствором бикарбоната аммония в метаноле, а очистку проводят на катионите КУ-2 с концентрацией целевого продукта осаждением ацетоном. Выход целевого продукта составляет 80-100 мг с 1 л эритроцитарной массы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
ПРИМЕР 1
5 л эритроцитарной массы, полученной из крови лошади, обрабатывают 2 л смеси ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 0,9:110. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного лизиса эритроцитов. Затем к полученному раствору добавляют осажденный при -15-20^o C ацетон в соотношении 1:3,2. Смесь выдерживают в течение 3 ч при температуре 0-5^o C, и осадок отделяют фильтрацией. К полученному осадку прибавляют 7 л осажденного при -15-20^o C ацетона, и смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрацией и обрабатывают 9 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течение 3 ч. Раствор липидов отделяют фильтрацией, а к осадку прибавляют смесь хлороформа и метанола 2:1. Экстракцию повторяют. Осадок отделяют фильтрацией, прозрачные желтого цвета экстракты объединяют. К осадку прибавляют смесь 70% пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80:20. Экстракцию проводят в течение 3 ч при постоянно перемешивании. Осадок отделяют и удаляют. Полученный экстракт липидов концентрируют в вакууме при температуре не более 40-42^o C до конечного объема 1,2-1,5 л. К полученному экстракту прибавляют 3 л дистиллированной воды и объединенные хлороформ-метанольные экстракты липидов. Смесь перемешивают, и отделяют верхний водно-метанольный слой, содержащий суммарные ганглиозиды. К нижнему слою прибавляют 1 л метанола и 1 л дистиллированной воды. Смесь перемешивают, и верхний водно-метанольный слой объединяют с первым водно-метанольным слоем.

Полученный объединенный водно-метанольный слой, содержащий ганглиозиды, наносят на колонку, заполненную Q AE-сефадексом. Затем колонку промывают 5 л смеси хлороформ: метанол:вода в соотношении 30:60:8 для удаления балластных липидов. Далее проводят десорбцию ганглиозидов 4 л 0,05 М раствора бикарбоната аммония в метаноле. Полученный раствор подвергают обработке на колонке, заполненной сорбентом КУ-2. Полученный метанольный элюат ганглиозидов концентрируют в вакууме при температуре 40-42^o С до конечного объема 0,1 л. Полученный раствор ганглиозидов в метаноле осаждают до -15-20^o C ацетоном (0,5 л). Осадок отделяют фильтрацией и сушат в вакууме до постоянного веса. Полученный осадок наносят на колонку 3,0 х 25,0 см с сорбентом Лихросорб Си 60 (40-63 мкм), уравновешенную хлороформом. Пигменты элюируют 200 мл хлороформа, а ганглиозиды элюируют 1,5 л смеси хлороформ:метанол:вода (70:30:4), собирая фракции по 12-15 мл. Фракции, содержащие хроматографически чистый ганглиозид G M₃, объединяют, концентрируют в вакууме до объема 10-20 мл и осаждают охлажденным при -10-20^o C ацетоном. Полученный осадок отделяют фильтрацией, растворяют в дистиллированной воде и подвергают лиофильному высушиванию. Выход ганглиозида G M₃ составляет 500 мг. Содержание ганглиозида G M₃ 99% Препарат представляет собой белый порошок, легко растворимый в воде.

ПРИМЕР 2
5 л эритроцитарной массы, полученной из крови лошади, обрабатывают 2 л смеси ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 1:100. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного лизиса эритроцитов. Затем к полученному раствору добавляют осажденный при -15-20^o C ацетон в соотношении 1:3,0. Смесь выдерживают в течение 3 ч при температуре 0-5^o C, и осадок отделяют фильтрацией. К полученному осадку прибавляют 7 л охлажденного при -15-20^o C ацетона, и смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрацией и обрабатывают 9 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течение 3 ч. Раствор липидов отделяют фильтрацией, а к осадку прибавляют смесь хлороформа и метанола 2:1. Экстракцию повторяют. Осадок отделяют фильтрацией, прозрачные желтого цвета экстракты объединяют. К осадку прибавляют смесь 70% пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80: 20. Экстракцию проводят в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Осадок отделяют и удаляют. Полученный экстракт липидов концентрируют в вакууме при температуре не более 40-42^o C до конечного объема 1,2-1,5 л. К полученному экстракту прибавляют 3 л дистиллированной воды и объединенные хлороформ-метанольные экстракты липидов. Смесь перемешивают, и отделяют верхний водно-метанольный слой, содержащий ганглиозиды. К нижнему слою прибавляют 1 л метанола и 1 л дистиллированной воды. Смесь перемешивают, и верхний водно-метанольный слой объединяют с первым водно-метанольным слоем.

Полученный объединенный водно-метанольный слой, содержащий ганглиозиды, наносят на колонку, заполненную Q AE-сефадексом. Затем колонку промывают 5 л смеси хлороформ: метанол:вода в соотношении 30:60:8 для удаления балластных липидов. Далее проводят десорбцию ганглиозидов 4 л 0,05 М раствора бикарбоната аммония в метаноле. Полученный раствор подвергают обработку на колонке, заполненной сорбентом КУ-2. Полученный метанольный элюат ганглиозидов концентрируют в вакууме при температуре 40-42^o C до конечного объема 0,1 л. Полученный раствор ганглиозидов в метаноле осаждают охлажденным до -15-20^o C ацетоном (0,5 л). Осадок отделяют фильтрацией и сушат в вакууме до постоянного веса. Полученный осадок наносят на колонку 3,0 х 25,0 см с сорбентом Лихросорб Си 60 (40-63 мкм), уравновешенную хлороформом. Пигменты элюируют 200 мл хлороформа, а ганглиозиды элюируют 1,5 л смеси хлороформ:метанол:вода (70: 30: 4), собирая фракции по 12-15 мл. Фракции, содержащие хроматографически чистый ганглиозид G M₃, объединяют, концентрируют в вакууме до объема 10-20 мл и осаждают охлажденным при -10-20^o C ацетоном. Полученный осадок отделяют фильтрацией, растворяют в дистиллированной воде и подвергают лиофильному высушиванию. Выход ганглиозидов G M₃ составляет 405 мг. Содержание ганглиозида G M₃ 97% Препарат представляет собой белый порошок, легко растворимый в воде.

ПРИМЕР 3
5 л эритроцитарной массы, полученной из крови лошади, обрабатывают 2 л смеси ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 1,1:90. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного лизиса эритроцитов. Затем к полученному раствору добавляют охлажденный при -15-20^o C ацетон в соотношении 1:2,8. Смесь выдерживают в течение 3 ч при температуре 0-5^o C, и осадок отделяют фильтрацией. К полученному осадку прибавляют 7 л охлажденного при -15-20^o C ацетона, и смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрацией и обрабатывают 9 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течение 3 ч. Раствор липидов отделяют фильтрацией, а к осадку прибавляют смесь хлороформа и метанола 2:1. Экстракцию повторяют. Осадок отделяют фильтрацией, прозрачные желтого цвета экстракты объединяют. К осадку прибавляют смесь 70% пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80: 20. Экстракцию проводят в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Осадок отделяют и удаляют. Полученный экстракт липидов концентрируют в вакууме при температуре не более 40-42^o C до конечного объема 1,2-1,5 л. К полученному экстракту прибавляют 3 л дистиллированной воды и объединенные хлороформ-метанольные экстракты липидов. Смесь перемешивают, и отделяют верхний водно-метанольный слой, содержащий суммарные ганглиозиды. К нижнему слою прибавляют 1 л метанола и 1 л дистиллированной воды. Смесь перемешивают, и верхний водно-метанольный слой объединяют с первым водно-метанольным слоем.

Полученный объединенный водно-метанольный слой, содержащий ганголиозиды, наносят на колонку, заполненную Q AE-сефадексом. Затем колонку промывают 5 л смеси хлороформ: метанол:вода в соотношении 30:60:8 для удаления балластных липидов. Далее проводят десорбцию ганглиозидов 4 л 0,05 М раствора бикарбоната аммония в метаноле. Полученный раствор подвергают обработке на колонке, заполненной сорбентом КУ-2. Полученный метанольный элюат ганглиозидов концентрируют в вакууме при температуре 40-42^o C до конечного объема 0,1 л. Полученный раствор ганглиозидов в метаноле осаждают охлажденным до -15-20^o C ацетоном (0,5 л). Осадок отделяют фильтрацией и сушат в вакууме до постоянного веса. Полученный осадок наносят на колонку 3,0 х 25,0 см с сорбентом Лихросорб Си 60 (40-63 мкм), уравновешенную хлороформом. Пигменты элюируют 200 мл хлороформа, а ганглиозиды элюируют 1,5 л смеси хлороформ:метанол:вода (70: 30: 4), собирая фракции по 12-15 мл. Фракции, содержащие хроматографически чистый ганглиозид G M₃, объединяют, концентрируют в вакууме до объема 10-20 мл и осаждают охлажденным при -10-20^o C ацетоном. Полученный осадок отделяют фильтрацией, растворяют в дистиллированной воде и подвергают лиофильному высушиванию. Выход ганглиозида G M₃ составляет 430 мг. Содержание ганглиозида G M₃ 98% Препарат представляет собой белый порошок, легко растворимый в воде.

Зависимость экстракции ганглиозида G M₃ от соотношения воды и уксусной кислоты приведена в табл. 1.

Как видно из табл. 1, оптимальным является соотношение воды и ледяной уксусной кислоты (0,9-1,1): (90-110), так как использование соотношений, выходящих за указанные пределы, приводит к снижению выхода ганглиозида G M₃.

Зависимость выхода ганглиозидов от соотношения лизированных эритроцитов и ацетона приведена в табл. 2.

Как видно из табл. 2, оптимальным является соотношение объема лизированных эритроцитов и ацетона 1:(2,8-3,2), так как использование соотношений, выходящих за указанные пределы, приводит к снижению выхода ганглиозида G M₃.

Зависимость выхода ганглиозида GM₃ от состава смеси для экстракции приведена в табл. 3.

Как видно из приведенных данных в табл. 3, только при соотношении 70% пропанола-2 и петролейного эфира 80:20 удается экстрагировать максимальное количество G M₃. Изменение соотношений приводит к уменьшению выхода целевого продукта.

Зависимость выхода ганглиозида G M₃ от концентрации раствора бикарбоната аммония приведена в табл. 4.

Как видно из табл. 4, только при использовании 0,05 М раствора бикарбоната аммония достигается полная десорбция ганглиозида G M₃. Уменьшение концентрации приводит к неполной десорбции, а увеличение выше 0,05 М к сорбции балластных примесей, а следовательно, к уменьшению выхода целевого продукта в 1 мг полученной субстанции.

Преимущества данного способа по сравнению с прототипом приведены в табл. 5.

Приведенные данные демонстрируют высокий выход ганглиозида G M₃, полученного по предлагаемому способу (увеличение выхода в 1,5-1,7 раза по сравнению с прототипом).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, использованные при выявлении изобретения и составлении его описания.

1. Бергельсон Л.Д. Дятловицкая Э.В. Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов. М. Наука, 1981, с. 208-209.

2.Miyazaki K. Okamura N. Kishimoto Y. Lee Y.C. Determination of gangliosides as 2,4-dinitro phenylhydrazides by high-performance liguid chromatography. Biochem. Y. 1986, v. 235, p. 755-761. ТТТ1

Использование: способ получения ганглиозида G M₃ относится к способам получения индивидуальных липидов, используемых для приготовления липосомальных препаратов, изучения структуры и функций биологических мембран. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Сущность изобретения: согласно способу эритроциты гемолизируют смесью ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении (0,9-1,1) : (90-110) с последующим осаждением ацетоном при соотношении гемолизированных эритроцитов и ацетона (0,9-1,1): (2,8-3,0). Экстракцию проводят смесью хлороформа и метанола, затем смесью пропанола 2 и петролейного эфира в соотношении 80:20. Целевой продукт получают после ионообменной и адсорбционной хроматографии. Положительный эффект заключается в повышении выхода в 5-7 раз по сравнению с прототипом. 5 табл.

Способ получения ганглиозида GM₃ путем гемолиза эритроцитов, экстракции из раствора хлороформ-метанольной смесью, хроматографией экстракта, очистки и сушки, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, гемолиз эритроцитов проводят смесью ледяной уксусной кислоты и воды при соотношении (0,8-1,1):(90-110) с последующим осаждением ацетоном при соотношении раствор: ацетон 1:(2,8 3,2), после экстракции осадка смесью хлороформ-метанол дополнительную экстракцию проводят смесью 70% пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80:20, экстракт упаривают, разбавляют водой, объединяют с хлороформ-метанольным экстрактом и отделяют метанольный слой, хроматографию осуществляют на QAE-сефадексе с десорбцией целевого продукта 0,06 М раствором бикарбоната аммония в метаноле, а очистку проводят на катионите КУ-2 с концентрацией целевого продукта осаждением ацетоном.