СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА Российский патент 2001 года по МПК A61K38/48 A61K35/16 

Изобретение относится к технологии получения фермента крови человека - церулоплазмина и может быть использовано при производстве медицинских препаратов.

Известны способы получения церулоплазмина Vox Sang. 1962, v.7, p.394-405 и Vox Sang., 1963, v.8, p.641-659.

Способы заключаются в выделении церулоплазмина из спиртового осадка IV-1 сыворотки крови человека путем хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе.

Недостатком методов является то, что они предназначены в основном для лабораторного, но не для промышленного применения.

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату, выбранным в качестве прототипа, является способ получения церулоплазмина, защищенный авторским свидетельством SU 1826193, опубликованное 10.09.95.

Способ заключается в гомогенизации спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-сорбенте, элюции раствором хлористого натрия, осаждении примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении целевого продукта этиловым спиртом, растворении осадка, стерилизующей фильтрации и лиофилизации.

Недостатком способа является отсутствие стадии противовирусной обработки. Использование этилового спирта и хлороформа приводит к гибели некоторых видов вирусов, но для обезвреживания вирусов, лишенных липидной капсулы, необходима пастеризация препарата. Недостатком известного способа является неполное связывание целевого продукта на сорбенте в связи с наличием большого количества примесей, а также необходимость длительной промывки сорбента. Превышение концентрации хлористого натрия в буферном растворе, используемом для промывки сорбента, ведет к потере целевого продукта. Задача, решаемая предлагаемым изобретением - совершенствование способа получения церулоплазмина.

Технический результат заключается в повышении вирусологической безопасности препарата, увеличении выхода конечного продукта из 1 кг сырья, сокращении длительности процесса выделения церулоплазмина.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения церулоплазмина из плазмы крови человека путем гомогенизации спиртовой фракции по Кону в растворе гористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-сорбенте, элюции раствором хлористого натрия, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации, лиофилизации, гомогенизацию спиртовой фракции по Кону и элюцию примесей проводят раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, после получения гомогената проводят тепловую денатурацию белковых примесей, а после стерилизующей фильтрации осуществляют пастеризацию церулоплазмина.

Способ осуществляется следующим образом. В качестве исходного сырья используют спиртовую фракцию IV-1 по Кону плазмы крови. Фракцию гомогенизируют в растворе, содержащем не выше 0,1 М хлористого натрия. Устанавливают pH раствора равным 6,0-6,5 и проводят тепловую денатурацию белковых примесей, прогревая раствор в течение не менее 2 часов при температуре 60^oC. Это позволяет избежать связывания данных примесей с сорбентом, сокращает время отмывки сорбента. В полученный раствор, охлажденный до 20^oC, вносят сорбент ДЭАЭ-сефадекс ("Pharmacia- Biotek", Швеция). Корректируют pH смеси до 6,0-6,5. Смесь перемешивают около 2 часов при температуре 20^oC. Таким образом, продолжительность сорбции церулоплазмина сокращается с 18 до 2 часов по сравнению с прототипом. Сорбент отмывают 500 л охлажденного 0,1 М раствора хлористого натрия (из расчета 50 л на 1 кг сырья) до достижения оптической плотности промывных вод, измеряемой при длине волны 280 нм, не выше 1,0. Таким образом, количество раствора для отмывки сокращается в 4 раза по сравнению с прототипом. Отмытый от балластных белков сорбент помещают в емкость и заливают охлажденным 0,3±0,05 М раствором хлористого натрия, перемешивают и отделяют полученный раствор церулоплазмина от сорбента. Корректируют pH полученного раствора до 5,2-5,3 и добавляют хлороформ до конечной концентрации 2-4% и этиловый спирт до 24-26%. Устанавливают температуру раствора равной 24-26^oC и перемешивают, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Концентрацию этилового спирта доводят до 45-55% добавлением охлажденного до 0^oC этилового спирта, выдерживают раствор в течение 12-18 часов при температуре -10 - 15^oC. Осадок отделяют центрифугированием, разводят в 0,15 М растворе хлористого натрия, устанавливают pH 6,5-7,5 и концентрацию белка 20-25 мг/мл. Проводят стерилизующую фильтрацию раствора церулоплазмина и пастеризацию путем инкубации при температуре +60^oC в течение 24 часов. Препарат разливают во флаконы и подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 1. К 1 кг спиртовой фракции IV-1 по Кону прибавляют 10 литров 0,1 М раствора хлористого натрия и гомогенизируют. Устанавливают pH 6,0 и нагревают до температуры 60^oC. Прогревают 2 часа при непрерывном перемешивании. Раствор охлаждают до температуры 20^oC и добавляют 1 литр суспензии ДЭАЭ-сефадекса. Устанавливают pH 6,0 и инкубируют суспензию 2 часа при непрерывном перемешивании. Отделяют сорбент от раствора и промывают 50 литрами 0,1М раствора хлористого натрия до снижения оптической плотности промывных вод при длине волны 280 нм до 1,0. Отмытый сорбент переносят в емкость, добавляют 1 литр 0,3 М раствора хлористого натрия и перемешивают. Отделяют раствор от сорбента, устанавливают pH 5,2, температуру 25^oC. Добавляют хлороформ до конечной концентрации 2% и этиловый спирт до 25%. Перемешивают в течение 30 минут.

Отделяют выпавший осадок примесей центрифугированием. К полученному центрифугату добавляют охлажденный до 0^oC этиловый спирт до конечной концентрации 50%. Выдерживают раствор при температуре -10^oC в течение 18 часов. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, гомогенизируют в 0,15 М растворе хлористого натрия, устанавливают pH 7,0 и концентрацию белка 22 мг/мл. Проводят стерилизующую фильтрацию раствора церулоплазмина. Выдерживают емкость со стерильным раствором при температуре 60^oC в течение 24 часов. Проводят розлив и лиофильное высушивание препарата. Выход препарата составляет 3 г из 1 кг сырья. Его оптический коэффициент 0,040, биологическая активность - 16,0 усл.ед., т.е. не отличается от прототипа.

Использование в качестве исходного сырья осадка IV-1 позволяет увеличить выход из 1 кг сырья в 10 раз. Применение тепловой денатурации балластных белков и использование в качестве ионообменного сорбента ДЭАЭ-сефадекса позволяет сократить технологический процесс на 1,5 суток. Введение стадии пастеризации позволяет повысить вирусологическую безопасность препарата.

Изобретение относится к медицине, а именно к производству медицинских препаратов из крови человека. Церулоплазмин получают из плазмы крови человека путем гомогенизации осадка IV-I спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, тепловой денатурации белковых примесей, сорбции полученного раствора на ДЭАЭ-сефадексе, элюции раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделения их центрифугированием, осаждения целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации и пастеризации раствора церулоплазмина и лиофильного высушивания его. Технический результат: увеличение выхода конечного продукта, сокращение времени технологического процесса, повышение вирусологической безопасности препарата.

Способ получения церулоплазмина из плазмы крови человека путем гомогенизации спиртовой фракции по Кону в растворе хлористого натрия, сорбции полученного гомогената на ДЭАЭ-сорбенте, элюции раствором хлористого натрия, осаждения примесей смесью этилового спирта и хлороформа, отделении их центрифугированием, осаждении целевого продукта этиловым спиртом, растворения осадка, стерилизующей фильтрации, лиофилизации, отличающийся тем, что в качестве спиртовой фракции по Кону используют осадок IV-I, гомогенизацию которого и элюцию примесей с сорбента проводят раствором хлористого натрия с концентрацией, не превышающей 0,1 М, после получения гомогената проводят тепловую денатурацию белковых примесей, в качестве сорбента используют ДЭАЭ-сефадекс, после стерилизующей фильтрации осуществляют пастеризацию церулоплазмина.