СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУХ ГОРМОНОВ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ОБЪЕМЫ ЖИДКОСТИ ТЕЛА Российский патент 1996 года по МПК A61K38/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к вопросам лечения панкреатита, стабилизации нарушений водно-солевого обмена и функциональных систем, на которые водно-солевой обмен оказывает влияния.

Патогенез панкреатита плохо изучен, лечение панкреатита симптоматическое, диетическое, хирургическое.

О функциональной связи деятельности поджелудочной железы и водно-солевого обмена до моих исследований свидетельствовали клинические работы, отмечавшие сгущение крови, олигурию различной тяжести, вплоть до анурии, гипольциемию, изменения в плазме крови концентрации натрия и калия. Экспериментальных изучений нарушений водно-солевого обмена при панкреатите не проводилось, по-видимому, вследствие отсутствия экспериментальной модели панкреатита на животных. Данные клиницистов о нарушениях водно-солевого обмена не получали объяснения.

Об участии поджелудочной железы, как рецепторного органа, участвующего в информации центров регулирующий водно-солевой обмен, свидетельствовали экспериментальные данные, показавшие, что даже медленное введение в артерии поджелудочной железы раствора, изотоничного плазме крови, усиливает выведение жидкости почками.

У собак, с выведенными по И.П.Павлову протокол поджелудочной железы, развивалось непонятное заболевание, названное самим Иваном Петровичем специфическим. Среди прочих причин развития специфического заболевания И.П.Павлов предполагал поступление вырабатываемых поджелудочной железой ферментов в кровяное русло, и, называя поджелудочную железу недотрогой и щепетильной, предупреждал о возможности исследования не физиологии, а патологии этого органа как в остром, так и в хроническом эксперименте. Успехи развития медицины к середине нынешнего столетия, когда стали диагносцировать панкреатит и были описаны морфологические изменения поджелудочной железы при панкреатите, позволили с уверенностью сказать, что специфическое заболевание собак является хроническим рецидивирующим панкреатитом. Для изучения нарушений водно-солевого обмена при панкреатите и были использованы собаки с выведенным по Павлову протоком поджелудочной железы.

Зав. Отделом общей физиологии ИЭМ АМН СССР проф.А.В.Риккль уделяла большое внимание взаимосвязи поджелудочной железы и обмена веществ (общего, белкового). Наиболее значительными были исследования Г.Ф.Милюшкевича, пришедшего от идеи поступления ферментов в кровяное русло, как нормальный физиологический процесс, и реинкреции ферментов поджелудочной железы другими пищеварительными железами, к идеи возможности лечения собак, с выведенным по Павлову протоком поджелудочной железы, парентеральными введениями поджелудочного сока.

В опытах на бодрствующих собаках мною одновременно определялись: ОВ по разведению антипирина, ВН по разведению тиосульфата натрия, рассчитывался ВК, ОП по разведению синьки Эванса. Определялся показатель гематокрита и рассчитывался ОЦК. В плазме крови определялись концентрации натрия, калия, кальция методом пламенной фотометрии.

Если у здоровых собак все изучаемые константы были удивительно постоянны, то после операции выведения панкреатического протока, столь же удивительно, было отсутствие какого либо постоянства всех изучаемых показателей. Изменения водно-солевых констант детально описаны в диссертации. Нарушения водно-солевого гомеостаза при хроническом рецидивирующем панкреатите в обобщенном виде представлены в табл. 1. Основным и ведущим нарушением водно-солевого гомеостаза (обусловливающим другие нарушения) являются перераспределения жидкости между ВН и ВК, возникающие периодически или гипергидратация внеклеточной среды с одновременной дегидратацией клеток, или, наоборот, дегидратацией внеклеточной среды при гипергидратации клеток. ОП и ОЦК изменялись всегда в том же направлении, что и ВН, но изменения ВН наступали раньше и были выражены больше, чем ОП и ОЦК.

Соответственно двум формам перераспределения объемов жидкости тела имеют место и различные клинические признаки заболевания, что позволило выделить две формы течения панкреатита: хроническое и острое.

Первая форма, характеризующаяся увеличением ВН и снижением ВК, протекает длительно недели и месяцы. Несмотря на сохранившийся или повышенный аппетит, прогрессивно снижается вес тела параллельно со снижением ОВ и ВК. Снижение веса тела может достигать 40% снижение ВК до 50 Принимая во внимание, что клетки тканей вряд ли могут существовать при столь выраженном обезболивании, следует думать, что при первой форме заболевания сокращается общая биомасса тела. Сама по себе эта форма заболевания не приводит к гибели, если не осложняется второй формой заболевания.

Вторая форма заболевания, в отличие от первой, протекает быстро (часы и сутки). Внезапно, на фоне удовлетворительного состояния или первой формы заболевания снижается ВН и увеличивается ВК (на фоне первой формы, при сниженном ВК, увеличение ВК доказуемо только при исследовании в динамике). Снижение ВН сопровождается сгущением крови, отсутствием аппетита, общей слабостью, в тяжелых случаях до прострации. Незамедлительное парантеральное введение физиологического раствора поваренной соли в объеме не менее 1/3 общего объема ВН выводит животное из тяжелого состояния, спасает от неминуемой гибели. По весьма обстоятельному анализу патологии и клинике водно-солевого обмена, проведенному Керпель-Фрониусом снижение ВН более чем на 1/3 не совместимо с жизнью, что полностью подтвердилось в моих опытах. Гибель при панкреатите наступает именно вследствие снижения ВН, приводящее к сгущению крови, затруднению кровообращения; дегидратация межтканевой жидкости, в норме осуществляющей доставку питательных веществ от крови к клеткам, не обеспечивает питание клеток и утилизацию продуктов метаболизма от клеток к крови.

Две формы перераспределения объемов жидкости между ВН и ВК, соответствующие хроническому и острому течению панкреатита, подтверждены в экспериментах на крысах в подостром опыте.

Перераспределения между ВН и ВК объемов жидкости при панкреатите не наблюдаются при патологии других органов, из чего следовало предполагать, что поджелудочная железа вырабатывает вещество (вещества), влияющие на распределение объемов жидкости, выработка или поступление которых в кровь нарушается при дисфункции поджелудочной железы. Поиски таких веществ увенчались успехом.

Оказалось, что поджелудочная железа вырабатывает два вещества, условно обозначены С-1 и С-2, гормональной природы, не имеют видовой специфичности, молекулярного веса ниже 12000, полипептидной структуры, так как усиление биуретовой реакции и поглощение в ультрафиолетовой области спектра идут параллельно. Вещества содержатся в промышленных препаратах в трепсине фирмы Дифко, отечественном панкреатите, и в поджелудочном соке собак. Независимо от источника получения, С-1 и С-2 вызывают у здоровых собак и крыс точно такие же перераспределения объемов жидкости, какие между ВН и ВК, какие имели место при панкреатите у собак и крыс.

Излагать технический уровень механизмов водо-ионовыделительной функции почки не рационально на том основании, что С-1 и С-2 не оказывает влияния на избирательное выведение ионов и воды почкой, но добавляют преставления о механизмах регуляции объемов жидкостей тела.

Принято считать, что постоянство объема и состава ВН обеспечивается водо-ионовыделительной функцией почки. ВК находится в динамическом равновесии с ВН. Гетерогенность состава ВК и ВН обеспечивается на уровне клеток и тканей ионными насосами. Доказательства гормональной регуляции ВК на уровне организма плохо изучены.

В эксперименте для увеличения ВН применяются водные нагрузки, для снижения ВН сухоедение или достигается через несколько недель после удаления надпочечников.

С-1 и С-2 получали из промышленного препарата поджелудочной железы трипсина фирмы Дифко. Препарат растворялся в минимальном количестве воды, исключающим его подгорание и кипятился. Денатурированная кипячением часть препарата отделялась фильтрацией через бумагу. Фильтрат помещался в целлофановый мешок, который подвешивался в стакане с водой, и стакан ставился в холодильник. Собиралась вода с проникающими через целлофан веществами: ежедневно переносился целлофановый мешочек в чистую воду. Диализ продолжался 7 дней. Собранная жидкость выпаривалась на водяной бане. Сухое вещество не теряет активности длительное время (наблюдение до года). Заготовленный таким образом препарат по мере надобности разделялся на сефадексе G-50 на две фракции. Первая фракция, содержащая малое количество вещества и лабильную активность, концентрировалась под вакуумом водоструйного насоса при 37^оС. Фракция, содержащая С-2, выпаривалась на водяной бане до постоянного веса. Доза С-1, вводимая животным, выpажалась в условных единицах (у.е.) показания спектрофотометра при длине волны 260 н.м. Дозу С-2, имеющую стабильную активность, вводили из расчета мг на массу тела.

Выяснение зависимости доза-эффект проводилось на крысах. У крыс линии Вистар, массой 150-250 г, под кратковременным эфирным наркозом удалялись почки и в бедреную вену проводилась инъекция 1 мл 0,2%-ного раствора инулина, в ту же иглу вводили растворенные в объеме 0,2 мл ту или иную дозу С-1 или С-2, или тот же объем физиологического раствора хлористого натрия контрольным животным. Через 3 ч вновь под эфирным наркозом у крыс из бpюшной аорты забиралась кровь, в сыворотке которой резорциновым методом определялась концентрация инулина и рассчитывался ВН. В связи с тем, что у крыс удалялись почки, и выведение воды из организма было исключено, уменьшение или увеличение ВН расценивалось как тест перераспределения жидкости между ВН и ВК.

При желании определить объем плазмы крови у тех же животных за 8 мин до взятия крови внутривенно вводили 0,2 мл 0,2%-ного раствора синьки Эванса. В сыворотке крови определяли концентрацию синьки на спектрофотометре при длине волны 625 нм. В качестве дополнительного контроля возможных сдвигов объема плазмы крови определяли в ней концентрацию белка спектрофотометрически. При необходимости выяснения изменений объема внеклеточной жидкости не через три, а через 1 ч после введения С-1 или С-2, последние вводились через 2 ч после инъекции инулина.

Между применяемой дозой С-2 и объемом внеклеточной жидкости обнаружена прямая зависимость: чем большая доза С-2 введена, тем более выражено снижение ВН. ВН у контрольных крыс в среднем 13,8±0,4 мл/100 г С-2 в дозах 7, 12, 25, 68 мг/100 г массы крысы вызвало снижение ВН соответственно до 10,0±1,1, 8,5±1,8, 6,8±0,3, 5,2±0,3 мл/100 г, что составило от исходного уровня контрольных животных соответственно 27,5, 37,8, 50 и 62,3%
ОП исследовали в ответ на введение двух доз С-2: 15 и 35 мг/100г массы, вызывающие достаточно выраженное снижение ВН. Оказалось, что у крыс ОП после введения С-2 в эффективных дозах, снижающих ВН, не изменился через 3 ч. Отсутствие изменений концентрации белка крови подтвердило отсутствие изменения гидратации в сосудистом русле (табл.2). Такие результаты оказались неожиданными. Так как у собак после введения С-2 и С-1 ОП изменяется в том же направлении, что ВН. Проведена дополнительная серия опытов, в которых ОП определялся через 1 ч после инъекции С-2. Представленные в табл. 2 данные показывают, что и через 1 ч после введения С-2 ОП и ОЦК не изменились по сравнению с уровнем этих величин контрольных животных.

В отличии от С-2, вызывающего с повышением дозы, все более выраженное снижение ВН С-1 способствует увеличению ВН только в определенной концентрации в крови. Так доза С-1 0,5 у.е. не вызывала увеличения объема внеклеточной жидкости, доза же 0,7 у.е. способствовала наиболее выраженному увеличению ВН (22% выше контрольного уровня), а доза 1,3 у.е. увеличила ВН не более, чем доза 0,7 у. е. (15,7% выше исходного, табл. 3). Проведена серия опытов, в которой влияние С-1 на ВН, ОП, и ОЦК исследовалось одновременно (табл. 4). Доза С-1 последовательно увеличивалась примерно вдвое. Как свидетельствуют данные табл.4, С-1 вызывает увеличение ВН лишь в дозе 0,66 у.е. и ни меньшая доза, ни одна из последовательно увеличенных доз не изменила ВН. Эти данные позволяют полагать, что, во-первых, для увеличения объема ВН в крови должен быть определенный уровень С-1; во-вторых, существует механизм, ограничивающий резкое обезвоживание клеток более чем на 7% (из грубого подсчета: ВН не увеличивается более, чем на 22% ВК более ВН примерно в три раза). В процессе получения и хранения С-1 может обнаружиться некоторая вариабельность его активности: наиболее выраженно ВН увеличивается в дозе С-1 0,66-0,7, у.е. доза 1,3 у.е. может вызвать (табл.3) или не вызвать (табл. 4) увеличение ВН.

Если анализ данных при хроническом рецидивирующем панкреатите привел к выводу о том, что перераспределение объемов между ВН и ВК является первичным и обуславливает сдвиги ОП, то данные табл.4 свидетельствуют о самостоятельном влиянии С-1 на транскапиллярный обмен жидкости, так как дозы С-1, увеличивающие ВН не совпадают с дозами, увеличивающими ОП. Достоверность сдвигов ОП и увеличение гидратации в сосудистом русле подтверждает снижение концентрации белка в тех группах, где отмечено увеличение ОП.

Таким образом, наиболее важные выводы из серий экспериментов доза-эффект следующие: полипептид С-2 вызывает тем большее снижение ВН, чем большая доза введена животному. Наиболее эффективная доза С-1, вызывающая увеличение ВН 0,7 у. е. выявлено не опосредованное влияние С-1 на транскапиллярный обмен жидкости.

Действие С-1 и С-2 на водо-ионовыделительную функцию почки.

Работа проводилась на крысах, самках, массой 160-220 г. У крыс под хлоралозо-нембуталовым наркозом вскрывали брюшную полость и в мочевой пузырь вшивали фистулу. В некоторых сериях опытов удаляли поджелудочную железу. Сбор мочи начинали через 1 ч после операционного вмешательства и сразу же после внутривенной инъекции С-1 или С-2, в дозах соответственно 0,7, у.е. и 15 мг/100 г массы крысы, в объеме 0,2 мл. Контрольным крысам вводили 0,2 физиологического раствора хлористого натрия. Кровь в конце опыта получали из брюшной аорты. Натрий, калий в моче и сыворотке крови определяли на пламенном фотометре Цейс 111.

В связи с тем, что ионо-водовыделительную функцию почек предполагалось исследовать в течение 1 ч после введения С-1 и С-2, проведены опыты, в которых выяснялась степень изменения ВН и ионный состав сыворотки крови в течение часа после их введения. Опыты показали выраженные сдвиги ВН без изменения ионного состава сыворотки крови (табл.5).

В первой серии исследований моча собиралась с интервалами времени: 0-10, 10-20, 20-60 мин. Концентрация ионов в моче определялась суммарно за 0-60 мин. На введение С-2 не выявлено изменений в выведении мочи почками по сравнению с контрольной группой крыс. С-1 в первые 10 мин после введения снижает объем диуреза в 2,5 раза по сравнению с контрольными животными. В последующее время наблюдения диурез не отличался от такового контрольных животных. Концентрация натрия и калия в моче крыс с введенным С-1 не отличалась от их концентрации контрольных животных.

Поскольку С-1 вызывает увеличение ВН и одновременно усиливает реабсорбция воды и натрия почкой, представляло интерес оценить его эффективность в условиях предварительного введения больших объемов физиологического раствора. После инъекции в вену С-1, в ту же иглу вводился физиологический раствор в объеме 5% мас. тела. Объем диуреза у крыс, которым введен С-1, в 15 раз меньше, чем у контрольных в первые 10 мин после введения (0,0275±0,0092 и 0,4026±0,0967), за последующие 20 мин в 12 раз ниже контрольных (0,0245±0,0073 и 0,3027±0,0457) и в 5 раз меньше за 1 ч. Концентрация натрия в моче крыс с введенным С-1 не отличалась от таковой у контрольных крыс, но концентрация калия достоверно увеличивалась (р < 0,02), это при том, что ВН увеличена физиологическим раствором хлористого натрия.

Таким образом, С-1 увеличивает ВН и одновременно тормозит выведение воды и ионов почкой. Такой эффект противоречит существующей схеме участия почек в регуляции ВН. Это дает основание предполагать, что С-1 представляет собой гормональный фактор, обеспечивающий увеличение объема внеклеточной жидкости как за счет перехода ее из клеточного сектора, так и за счет усиления реабсорбции натрия и воды почкой. Торможение диуреза и ионуреза в условиях нагрузки физиологическим раствором свидетельствует о том, что С-1 выключает гомеостатические механизмы, направленные на экскрецию избытка ионов и воды.

К регуляторным факторам, ответственным за выведение избытка воды и натрия относится натриуретический гормон, источник поступления которого в кровь не известен, и, возможно, образующийся в поджелудочной железе С-2. Для выяснения роли С-2 в выведении воды и ионов почкой проведены опыты с удаленной поджелудочной железой. У крыс с удаленной поджелудочной железой в исходном периоде диурез, экскреция натрия и калия не отличались от контрольных крыс. После введения физиологического раствора, в объеме 5 мл/100 г массы крысы, у крыс с удаленной поджелудочной железой почки выделяли меньше жидкости. Реакция в условиях нагрузки физиологическим раствором на введение С-1 принципиально не отличалась от ответа интактных крыс диурез, экскреция натрия и калия были резко снижены. Введение полипептида С-2 не оказывало заметного влияния на функцию почек у животных с удаленной поджелудочной железой, но, что очень существенно, при совместном введении С-1 и С-2 отмечалось выраженное ослабление эффекта С-1. Действие С-1 было достаточно продолжительным: снижение диузера и экскреции натрия и калия наблюдалось не только на протяжении первого, но и второго часа.

Материалы позволят полагать, что полипептиды поджелудочной железы С-1 и С-2 являются регуляторами водно-солевого обмена. С их помощью регулируется изоосмотическое равновесие распределения объемов жидкости в жидкостных средах организма. Они являются также факторами регулирующими выведения воды и ионов почкой.

Лечебные и иммунизирующие свойства С-1 с С-1.

Как отмечалось на уровне техники, собаки с выведенным по Павлову протоком поджелудочной железы, в случае развития панкреатита неминуемо гибнут. Предложенный Г.Ф. Милюшкевичем и И.М.Джаксон способ лечения состоит из подкожных инъекций стерилизованного посредством свечи Шамберлена поджелудочного сока собак, в дозах 4-6 мл с одновременным подкожным введением большого объема физиологического раствора поваренной соли. С регистрацией показателей водно-солевого гомеостаза нами проведено лечение этим способом двух собак, страдающих хроническим рецидивирующим панкреатитом. По данным Г.Ф. Милюшкевича и И. М. Джаксон лечебным эффектом обладают стерильный поджелудочный сок, фильтрат прокипяченого поджелудочного сока, низкомолекулярные примеси трипсина фирмы Дифко, С-1 и С-2 содержатся в этих же субстанциях. С высокой степенью вероятности можно предположить, что именно С-1 и С-2 являются лечебными факторами.

Бодрствующим, интактным собакам проводились внутривенные и подкожные вливания С-1 и С-2. Получены реакции изучаемых величин на одно внутривенное введение С-2 и двух введений С-1. На первое введение С-2 снижаются ВН и ОП, на первое введение С-1 отчетливо повышаются ВН и ОП. Количество белка крови не изменяется, но концентрация его повышается вследствие оттока жидкости из сосудов с применением С-2 (снижен ОП), и снижается вследствие притока жидкости в сосуды с применением С-1 (увеличение ОП). Интересно то, что повторное введение С-1 не вызвало более повышение ВН, но реакции ОП и белка крови оказались такими же, как и при первом введении С-1, более того увеличился ОЭ. Следовательно, повторное введение С-1 увеличивает полнокровие в сосудистом русле.

На другой бодрствующей собаке оценивались воздействия подкожного введения стерильного поджелудочного сока и внутривенного введения С-1 и С-2. Как установлено ранее, стерильный поджелудочный сок, введенный внутривенно, вызывает снижение ВН и увеличение ВК. Подкожное введение стерильного сока увеличено ВН, но снизило ОП. Повторное подкожное введение сока, что важно, не изменило ни одного показателя водно-солевого гомеостаза. Той же собаке первое внутривенное введение С-2 только снизило повторное введение С-2 не изменило ВН, но увеличило ОП и ОЭ. ВН и не изменило других показателей. После применявшихся воздействий на данной собаке, даже внутривенное введение С-1 вызвало лишь слабую реакцию повышение ВН. Второе и третье введение С-1 не изменяло величины ВН. Как свидетельствуют данные, повторные инъекции С-1 увеличивают ОП и ОЭ, а, следовательно, и ОЦК, т.е. повторные применения С-1, также как и С-2, не оказывают воздействий на соотношение ВН/ВК, но способствуют увеличению полнокровия в сосудистом русле как вследствие увеличения плазмы крови, так и вследствие увеличения объема эритроцитов.

Отсутствие изменений ВН и ВК при повторных введениях С-1 и С-2 здоровым собакам демонстрирует (табл.6), из данных которой следует вывод, что патогенетическое воздействие новых гормонов поджелудочной железы предотвращается предварительными парентеральными введениями. Таким образом, С-1 и С-2 при внутривенном введении вызывают перераспределение объемов между ВН и ВК и в то же время способствуют образованию иммунитета к подобным повторным воздействиям, внешним или внутренним. Повторные внутривенные инъекции и С-1 и С-2 увеличивают ток ОЦК за счет и объема плазмы крови и объема эритроцитов.

Сопоставление изменений АД с изменениями ВН, ОП, ОЭ, ОЦК под воздействием С-1 и С-2.

Изучение влияния С-1 и С-2 на системное артериальное давление проводили в 2-х вариантах опытов. В первом варианте после одномоментного введения С-1 и С-2 изучали динамику изменений АД на протяжении 180 мин: у крыс массой 250-300 г под хлоролозо-нембуталовым наркозом в сонную артерию вставлялась канюля, которая соединялась с ртутным манометром, регистрировали АД на электрокимографе с 10-ти минутным интервалом. Во втором варианте эти условия опытов совмещали с определениями объемов жидкостей тела, с использованием методов, описанных выше. В настоящем варианте определение объемов жидкостей тела проводилось под хлоролозо-нембуталовым наркозом, а АД с экстерпированными почками. Последовательность воздействия соблюдали следующие: удаляли почки, подключали регистрацию АД, вводили инулин, на 120-ой мин вводили ту или иную дозу С-1 или С-2, на 170-й мин вводили синьку Эванса, кровь забирали на 180-й мин из сонной артерии.

Таким образом утверждаются следующие факты. 1. Поджелудочная железа вырабатывает и поставляет в кровяное русло два гормона, условно обозначенные как С-1 и С-2, регулирующие объемы жидкостей тела, как путем перераспределения ее в организме, так и путем влияния на функции почки. 2. Нарушение выработки или поступления в кровь С-1 или С-2 обусловливает хроническое или острое течение панкреатита. 3. Парантеральное введение С-1 и С-2, вызвавшее перераспределение объемов жидкостей тела однажды, образует иммунитет к повторным нарушениям водно-солевого геостаза, что является основанием для рекомендации применения их в медицине, как специфическое лечебное средство от панкреатита. 4. С-1 и С-2 в определенных дозах и при повторных введениях обладают свойством увеличивать объем циркулирующей крови, как за счет увеличения объема плазмы крови, так и увеличения объема эритроцитов, и могут быть использованы в клинике для борьбы с анемией и сгущением крови. 5. Установленная зависимость уровня артериального давления от объема интерстициальной жидкости может быть использована в борьбе с гипертонической болезнью и гипотонией, так как С-1 и С-2 регулируют объем интерстициальной жидкости и обладают имунными свойствами стабилизации ее объема.

Сущность изобретения заключается в том, что получены два неизвестных ранее гормона поджелудочной железы, регулирующие объемы жидкостей тела и обусловливающие нарушения водно-солевого обмена при панкреатите, обладают имунными свойствами и рекомендуются для лечения панкреатита и стабилизации систем и функций, на которые оказывает влияние водно-солевой гомеостаз. 6 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУХ ГОРМОНОВ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ОБЪЕМЫ ЖИДКОСТИ ТЕЛА, включающий обработку денатурацией ткани поджелудочной железы или трипсина Дифко, фильтрацию, очистку и разделение на сефадексе, отличающийся тем, что очистку фильтрата осуществляют диализом через целлофановую мембрану против воды до полного выхода проникающих через целлофан веществ, последние собирают и выпаривают на водяной бане, препарат разделяют на сефадексе G-50, целевой продукт собирают в виде двух фракций, имеющих максимальное значение в белковой области спектра поглощения, и упаривают до постоянного веса.