СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА Российский патент 2001 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для воспроизведения модели острого панкреатита с целью изучения его патогенеза и разработки способов лечения и диагностики данного заболевания в экспериментальных условиях.

Острый панкреатит (ОП) остается одной из сложных и наименее изученных медицинских проблем, что подтверждается неуклонным ростом заболеваемости, увеличением числа деструктивных форм, крайне неудовлетворительными результатами лечения этой тяжелой патологии. Во-многом это обусловлено отсутствием универсальной экспериментальной модели заболевания, позволяющей исследовать в эксперименте закономерности развития острого воспаления поджелудочной железы (ПЖ) в условиях, максимально приближенных к клиническим.

В настоящее время известно множество способов моделирования острого панкреатита в эксперименте, однако лишь небольшая часть из них отвечает современным представлениям о его патогенезе, наиболее важными моментами которого являются значительное повышение гидростатического давления в протоковой системе ПЖ, связанное с внутрипротоковым рефлюксом желчи и/или кишечного содержимого, наличие препятствия для оттока панкреатического сока в результате отека, спазма большого дуоденального соска, обтурации его конкрементами, инородными телами, осаждением в магистральных протоках слизисто-белковых преципитатов, а также с гиперстимуляцией ПЖ и высокой секреторной активностью органа. Большинство предложенных моделей ОП основаны на, так называемом, каналикулярно-гипертензионном механизме индукции заболевания [Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. - М: Медицина, 1971; Шалимов С.А. и соавт. Руководство по экспериментальной хирургии. - М: Медицина, 1989]. Основными условиями воспроизведения ОП по данному механизму являются введение в протоковую систему веществ, способствующих изменению химических свойств панкреатического сока в сторону приобретения им повреждающих свойств, создание повышенного внутрипротокового давления, что достигается инфузией в протоковую систему жидкости в объеме, превышающем ее вместимость, а также моделирование застоя секрета путем перевязки выводного протока железы. Несмотря на патогенетическую оправданность каналикулярно-гипертензионных моделей, большинство из них не отражают перечисленного выше комплекса условий, необходимых для воспроизведения модели ОП, близкой к клиническому течению заболевания, а применяемые средства достижения внутрипротоковой гипертензии и нарушения оттока панкреатического сока зачастую не соответствуют анатомо-функциональным условиям возникновения ОП. Кроме того, большая вариабельность в выборе исследователями компонентов внутрипротоковой агрессии, отсутствие дифференцированного подхода к определению необходимого объема повреждающей смеси, концентрации в ней тех или иных веществ, а также уровня внутрипротокового давления, достигаемого в момент введения раздражителя, приводит к существенным различиям в выраженности экспериментального ОП, тяжести нарушений морфофункционального статуса ПЖ и системных метаболических расстройств, что при, казалось бы, одинаковых условиях проведения эксперимента существенно затрудняет интерпретацию получаемых сведений, резко снижает их достоверность и препятствует унификации того или иного метода моделирования ОП в экспериментальной практике. Широкое распространение получили травматические модели ОП, создаваемые введением различных химических веществ непосредственно в ткань ПЖ с последующей перевязкой главного выводного протока железы или без таковой. При этом в качестве повреждающего агента чаще всего используются желчь, протеолитические ферменты, скипидар, различные кислоты, соли, масла, тритон Х-100 и др. [Гульянц Э.С. и соавт. А.с. СССР N 1327152. Изобретения, открытия. - 1987, Бюл. N 28, - с.211; Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. - М: Медицина, 1971]. Однако травматические модели позволяют создать лишь более или менее ограниченные очаги острого некроза ткани железы в месте введения повреждающего агента, выраженность которого в значительной мере зависит от раздражающих и токсических свойств инъецируемого вещества. Данные модели не соответствуют представлениям о патогенезе ОП, при их использовании не учитываются важные патологические процессы, предшествующие деструктивным изменениям, а степень вовлеченности органа не соизмерима с истинной распространенностью процесса в клинике и имеет четкий локальный характер. Инфекционные методы моделирования ОП основаны на введении в проток или ткань ПЖ взвеси патогенных бактерий, смеси стафилококкового токсина и лецитовителлазы, инфицировании полости желчного пузыря и двенадцатиперстной кишки условно-патогенными микроорганизмами [Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. - М: Медицина, 1971; Трояшкин А.А. Стафилококковая инфекция. - Л., 1972]. Результатом использования этих моделей является острый гнойный панкреатит, который в естественных условиях в подавляющем большинстве случаев представляет собой вторичный процесс, являющийся следствием асептичного воспалительно-деструктивного процесса в органе, фактор которого в инфекционных моделях не учитывается. Сосудистые модели ОП, основанные на эмболизации, лигировании, окклюзии экстра- и интраорганных сосудов ПЖ [Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. - М. : Медицина, 1971; Саркисов Д.С., Ремезов П.И. Моделирование болезней человека в эксперименте. - М.: Медгиз, 1960; Шалимов С.А. и соавт. Руководство по экспериментальной хирургии. - М.: Медицина, 1989], сложны, и научная ценность их невелика, так как они могут быть практически сопоставимы только с ишемическими панкреонекрозами, которые составляют не более 0,5% от всех деструктивных панкреатитов в клинике. Целесообразность использования с целью моделирования ОП аллергических моделей [Чаплинский В.В., Гнатышак А.И. Острый панкреатит. - М.: Медицина, 1972; Шалимов С.А. и соавт. Руководство по экспериментальной хирургии. - М.: Медицина, 1989] в связи с их чрезвычайной трудоемкостью и отдаленностью от истинного этиопатогенеза заболевания в настоящее время подвергнуто глубокому сомнению. В зарубежной практике широкое распространение получили методы моделирования ОП, основанные на введении животным сверхмаксимальных доз экзогенных стимуляторов секреции ПЖ (синтетического холецистокинина - ХЦК-8 (ССК-8), его структурного аналога - церулеина, секретина и др.) [Czako L. et al. Pancreas. 1997. - Vol. 15. - N 1. - P. 83-90; Warzecha et al. J. Physiol. Pharmacol. - 1997. - Vol.48. - N 1. - P. 43-58] . Однако данные способы отражают лишь степень напряженности стимулирующих панкреатическую секрецию влияний, которые при ОП выявляются наряду или возникают в результате ряда известных внутриорганных структурно-функциональных расстройств. Помимо этого практическое использование данных моделей ввиду высокой стоимости экзогенных стимуляторов панкреатической секреции экономически не выгодно.

Актуальным представляется разработка и внедрение в практику экспериментальной хирургии базирующегося на современных данных об этиопатогенезе, учитывающего его ведущие стороны и, тем самым, адаптированного к клинике способа моделирования ОП, способного оптимизировать экспериментальные исследования в области ургентной панкреатологии.

В качестве аналога взят способ моделирования ОП, предложенный С. А. Шалимовым и соавт. [С.А. Шалимов, А.П. Радзиховский, Л.В. Кейсевич. Руководство по экспериментальной хирургии. М: Медицина. 1989. С. 192-193]. Способ относится к каналикулярно-гипертензионным моделям и заключается в следующем. У наркотизированного животного производят срединную лапаротомию, в рану извлекают двенадцатиперстную кишку с прилегающей к ней средней долей ПЖ, между которыми выделяют и берут на держалки главный выводной проток железы, специальной иглой пунктируют двенадцатиперстную кишку, после чего иглу вводят в отверстие выводного протока, фиксируя ее в протоке лигатурой. Вслед за этим медленно заполняют протоковую систему 2-4 мл 1% раствора перманганата калия, удаляют иглу и перевязывают главный выводной проток. Через 10-20 мин возникает острый отек ПЖ, выраженность которого зависит от количества введенного в протоки раствора перманганата калия.

Недостатки:
а) В качестве повреждающего агента используют неестественное для биологических объектов химическое вещество (перманганат калия), поэтому воздействие им на протоковую систему и тканевые структуры ПЖ вряд ли можно считать патогенетически оправданным, и патологические изменения, возникающие при введении в протоковую систему перманганата калия, обусловлены его неспецифическими агрессивными свойствами.

б) Способ не предполагает индивидуализированного подхода к выбору количества вводимого в протоки ПЖ повреждающего раствора в зависимости от конституциональных особенностей подопытного животного, что существенно снижает достоверность получаемых в ходе эксперимента результатов.

в) При введении повреждающего раствора в протоковую систему ПЖ не производится регистрация внутрипротокового давления, что чревато получением статистически недостоверных и противоположных результатов.

г) Перевязка главного выводного протока после введения в него повреждающего раствора нецелесообразна, так как создаваемое при этом препятствие для пассажа секрета в двенадцатиперстную кишку является постоянным, что несопоставимо с клиническими фактами.

д) Способ позволяет получить изолированную модель отечной либо деструктивной (при введении больших количеств повреждающей смеси) форм ОП, что не соответствует динамике течения ОП в клинике, где данные формы заболевания строго взаимосвязаны и являются стадиями единого процесса.

В качестве прототипа нами взят способ экспериментального воспроизведения ОП, предложенный А. Д. Перельманом [А.с. СССР N 1105191, 1984, Бюл. N 28]. Способ заключается в следующем. После осуществления доступа в брюшную полость и выведения двенадцатиперстной кишки с поджелудочной железой в рану путем перевязывания и пересечения панкреатодуоденальных артерий и вен мобилизуют среднюю долю железы от двенадцатиперстной кишки, выделяют главный выводной проток, который лигируют толстой шелковой нитью. Далее главный выводной проток пунктируют тонкой иглой проксимальнее лигатуры и непосредственно в него вводят 0,05 - 0,1% раствор пилокарпина из расчета 0,22 - 0,29 мг/кг массы тела животного. Дополнительно осуществляют инъекции раствора пилокарпина в ткань ПЖ в указанных выше дозах.

Недостатки:
а) Рекомендуемый в данном способе доступ к главному выводному протоку ПЖ достаточно травматичен, пересечение панкреатодуоденальных сосудов неминуемо ведет к присоединению ишемического компонента.

б) Необратимая обструкция протоковой системы ПЖ, создаваемая перевязкой главного выводного протока, патогенетически не обоснована и не позволяет проводить исследование экзосекреторной функции ПЖ в течение экспериментального ОП.

в) Введение раствора пилокарпина производится без учета объема повреждающей смеси, а также выраженности создаваемой при этом протоковой гипертензии.

г) Введение пилокарпина в ткань железы не соответствует патофизиологии ОП, так как при этом на первый план выступает травматический фактор, а не стимулирующее влияние пилокарпина на секрецию ПЖ, которое неадекватно и весьма сомнительно при внутритканевом и внутрипротоковом способе применения препарата.

Задачи изобретения:
Повышение соответствия экспериментальной модели острого панкреатита основным звеньям этиопатогенеза и клиническим особенностям течения заболевания путем:
1. Разработки максимально приближенной к клинике модели ОП, учитывающей ведущие причинно-следственные связи его развития в естественных условиях (энзимобилиопанкреатический рефлюкс, внутрипротоковая гипертензия, застой секрета).

2. Определения в острых экспериментах на животных рационального сочетания и доз естественных раздражителей для воспроизведения модели острого панкреатита с использованием внутрипротокового пути их введения.

3. Установления с учетом конституциональных и анатомо-функциональных особенностей лабораторного животного необходимого объема повреждающей смеси для получения модели заболевания с сохраненной стадийностью течения.

4. Определения оптимальной величины избыточного давления в протоковой системе ПЖ, создаваемого при введении повреждающей смеси.

5. Установления оптимального для индукции ОП в эксперименте временного диапазона протоковой обструкции.

Поставленные задачи достигаются тем, что из трансдуоденального чреспапиллярного доступа под давлением в 1360 Па в качестве повреждающего агента вводят непосредственно в протоковую систему поджелудочной железы смесь аутожелчи с трипсином в равных соотношениях и в количестве 0,3-0,5 мл/кг массы тела, при концентрации трипсина - 0,4-0,7 мг/кг, а нарушение оттока панкреатического сока обеспечивают транзиторным отжатием катетера на срок в 30-40 мин.

По отношению к прототипу заявляемый способ моделирования острого панкреатита имеет следующие отличительные признаки.

Трансдуоденальный чреспапиллярный доступ к протоковой системе ПЖ менее травматичен, исключает присоединение фактора ишемии органа, связанного с мобилизацией средней доли железы. Исключительно внутрипротоковое введение раздражающих веществ более оправдано, так как проникновение и воздействие повреждающего фактора в этом случае максимально приближено к патофизиологии ОП, и мишенью для альтерации, как и в естественных условиях, является протоковая система. Принимая во внимание, что рефлюкс желчи в протоки ПЖ и внутрипротоковая активация трипсина, запускающего каскад биохимических реакций, способствующих приобретению аутоагрессивных свойств панкреатическими энзимами, являются наиболее постоянными факторами реализации ОП в клинических условиях, использование в качестве повреждающих агентов аутожелчи и трипсина в должной мере соответствует патогенезу заболевания. Целесообразной является и предполагаемая структурой способа транзиторная обструкция протоковой системы в течение 30-40 мин после введения повреждающей смеси, так как неустранимая обструкция, практикуемая в других моделях, не соответствует типичной клинике заболевания, кроме того, обратимая обструкция протоковой системы позволяет проводить комплексное исследование экзосекреторной функции ПЖ (объем секреции, содержание в соке панкреатических ферментов, бикарбонатов, расчет их дебитов и др.) в течение эксперимента. Контроль внутрипротокового давления в момент введения повреждающей смеси является необходимым условием стандартизации эксперимента, а величина давления в 1360 Па (120 мм вод. ст.) позволяет избежать нерационального моделирования стертых и молниеносных форм заболевания. Дифференцированный подход к выбору объема вводимой повреждающей смеси, концентрации в ней реактогенных веществ в зависимости от конституциональных особенностей животного более оправдан, позволяет повысить достоверность экспериментальных исследований, снизить частоту "неудачных" экспериментов.

Таким образом, решение поставленной задачи обеспечивается основными существенными признаками заявляемого способа, а именно трансдуоденальным чреспапиллярным воспроизведением энзимобилиопанкреатического рефлюкса и транзиторной обструкцией протоковой системы ПЖ.

Заявляемое количество вводимой в протоковую систему ПЖ смеси аутожелчи с трипсином, концентрации в ней трипсина, величина давления в момент введения повреждающего агента необходимы и достаточны для воспроизведения адаптированного к клинике острого воспаления ПЖ, так как экспериментально установлено, что уменьшение их ниже заявляемого предела недостаточно для адекватного возбуждения воспалительного процесса в органе, а увеличение может привести к молниеносному течению заболевания, что малосопоставимо с типичной его клиникой. Обструкция протоковой системы на срок в 30-40 мин в абсолютном числе случаев достаточна для воспроизведения ОП, в то время как увеличение времени обструкции чревато развитием фульминантного ОП, а сокращение не гарантирует от неудачного моделирования заболевания.

Разработка модели ОП осуществлена в эксперименте на 16 беспородных собаках. Технически моделирование ОП заключалось в следующем. После наркотизации и фиксации животного в асептичных условиях производилось выделение бедренного сосудистого пучка и выполнялась катетеризация бедренной вены по методике Сельдингера для внутривенного введения анестетиков и забора проб крови для биохимического анализа в определенные сроки эксперимента. После этого выполнялась верхне-срединная лапаротомия, в правом подреберье отыскивалась двенадцатиперстная кишка и вместе с ПЖ выводилась в рану. Примерно на 1-2 см проксимальнее перехода средней (фиксированной) доли ПЖ в правую в промежутке между сосудистыми аркадами производилась поперечная дуоденотомия, на края кишки накладывались серозно-мышечные держалки, после разведения которых на задней или задне-медиальной стенке двенадцатиперстной кишки находили белесоватый панкреатический сосочек. Панкреатический сосочек канюлировали эластичным полихлорвиниловым катетером диаметром 0,5 мм, который проводили в протоковую систему ПЖ до заклинивания. Перипапиллярно накладывали слизисто-подслизистый кисетный шов, который провизорно затягивали на один узел с целью герметизации протоковой системы. Пунктировали желчный пузырь и забирали 5-10 мл аутожелчи. Согласно массе тела лабораторного животного производили расчет необходимого количества повреждающей смеси, ингредиенты которой использовали в равных объемных соотношениях (учитывая, что в 1 мл раствора трипсина 1,6 мг и более сухого вещества). Под давлением в 1360 Па (120 мм вод. ст.), величину которого контролировали путем присоединенного к шприцу посредством тройных переходников аппарата Вальдмана, в выводной проток ПЖ при постоянном подтягивании катетера с целью равномерного заполнения протоковой системы вводили смесь аутожелчи и трипсина в объеме 0,3-0,5 мл/кг массы тела животного (концентрация трипсина - 0,4-0,7 мг/кг). Далее катетер пережимали мягким зажимом на 30-40 мин, после чего временную обструкцию протоковой системы устраняли снятием зажима и перипапиллярно наложенного кисетного шва. С целью динамического исследования экзосекреции ПЖ катетер оставляли в протоковой системе и выводили путем микродуоденостомии из двенадцатиперстной кишки, просвет которой ушивали однорядным узловым серозно-мышечно-подслизистым швом.

Результаты применения заявляемого способа моделирования ОП показали его простоту, доступность и высокую результативность - острое воспаление ПЖ удалось воспроизвести во всех случаях. При этом модель заболевания в достаточной степени соответствовала клиническим метаморфозам ОП и имела четко выраженную стадийность и фазность - от острого отека ПЖ до локальных и распространенных деструктивных изменений, с характерными для каждой стадии местной симптоматикой в брюшной полости (ферментативный перитонит, бляшки стеатонекроза и др. ), изменений в экзосекреторной деятельности ПЖ (резкое увеличение секреторной активности в отечную стадию и стадию начальной деструкции и некоторое ее снижение в фазу распространенного панкреонекроза), сдвигами в метаболическом статусе животных (резкое увеличение ферментативной активности крови, существенное повышение содержания в крови маркеров поражения органов детоксикации, напряженности процессов пероксидации липидов, эндотоксикоза). Морфологические изменения в различные фазы эспериментального ОП были типичными и характеризовались резким отеком интерстициального пространства, увеличением объема экзокринной паренхимы вследствие ее отека и выраженной клеточной дистрофии смешанного генеза, лейкоцитарной инфильтрацией тканевых элементов, резкими нарушениями интраорганной микроциркуляции, проходящего этапы внутрисосудистого стаза и сладжирования форменных элементов до завершенного тромбоза. У всех животных морфологические явления, характерные для начальной (отечной) стадии ОП, к 2-3 часам с момента моделирования заболевания трансформировались в очаговый панкреонекроз, который имел тенденцию к распространению, и охватывал к 10 часу экспериментального ОП до 30 - 50% паренхимы органа. Все животные, которым было осуществлено моделирование ОП заявляемым способом, погибли на фоне нарастающих деструктивных изменений, распространенного ферментативного перитонита и присущих для данной патологии тяжелых системных метаболических расстройств спустя 10 -12 часов с момента моделирования заболевания. Отмеченные в течение эксперимента морфофункциональные нарушения были строго типичными и последовательными, что позволило получить высоко достоверные сведения.

Заявляемый способ моделирования ОП апробирован в экспериментальных работах по изучению эффективности различных способов лечения острого воспаления ПЖ в общей сложности на 37 беспородных собаках. Результаты практического применения заявляемого способа подтвердили достаточное соответствие его предъявляемым к экспериментальным моделям требованиям, а именно высокую результативность, простоту, доступность, дешевизну, этиопатогенетическую близость и адаптированность к своему клиническому прототипу.

Пример 1. Беспородному кобелю по кличке Рыжий массой 18 кг под внутримышечным обезболиванием в асептических условиях произведены выделение и катетеризация правой бедренной артерии по методу Сельдингера. Под базисным внутривенным наркозом тиопенталом-натрия (12 мг/кг) выполнена верхнесрединная лапаротомия, в рану выведена двенадцатиперстная кишка с поджелудочной железой. В проекции перехода средней доли железы в правую произведена поперечная дуоденотомия, на раневые края кишки наложены серозно-мышечные лигатурные держалки, при разведении которых на задне-медиальной стенке двенадцатиперстной кишки визуализирован панкреатический сосочек, который канюлирован эластичным катетером диаметром 0,5 мм. Катетер проведен в протоковую систему железы до заклинивания и осуществлено перипаллярное наложение слизисто-подслизистого кисетного шва, который с целью герметизации протоковой системы провизорно затянут на один узел. Произведена пункция желчного пузыря - забрано 5 мл аутожелчи. Далее под давлением в 1360 Па в протоковую систему поджелудочной железы введено 9 мл (из расчета 0,5 мл/кг массы тела) смеси аутожелчи и трипсина в равных объемных соотношениях, учитывая, что в 1 мл раствора трипсина - 1,6 мг сухого вещества. Отжатием катетера мягким зажимом воспроизведена обструкция протоковой системы органа, которая устранена через 30 минут снятием зажима и перипаллярного кисетного шва. Катетер оставлен в главном выводном протоке поджелудочной железы, выведен из двенадцатиперстной кишки посредством дуоденостомии. Просвет кишки ушит однорядным узловым серозно-мышечно-подслизистым швом. В сроки 1, 3, 5, 7, 10 часов от момента моделирования заболевания произведены интраоперационные биопсии железы с целью изучения морфологической динамики ОП. Уже через 15 минут от момента введения повреждающей смеси макроскопически отмечен острый отек поджелудочной железы и микрогеморрагии на ее поверхности. Через 30 минут в брюшной полости появлялся воспалительный транссудат, и происходило резкое повышение внутрипротокового давления (на 120% от исходного уровня), что сопровождалось значительным усилением секреторной активности поджелудочной железы (активность амилазы в соке возросла на 244%, трипсина - на 188%, липазы - на 210%, объем секреции - на 275%). Одновременно отмечено существенное повышение ферментативной активности крови. Указанные выше явления прогрессировали и к 3 часу заболевания по биохимическим и морфологическим критериям отмечена реализация деструкции ткани ПЖ (падение ферментативной активности сока при нарастании ферментативной активности крови и внутрипротокового давления, появление фокусов некроза при гистологическом исследовании), В течение эксперимента воспалительно-деструктивный процесс в ПЖ неуклонно нарастал и манифестировал к 10 часу эксперимента в распространенный панкреонекроз (по данным макроскопического и морфологического исследования деструкции были подвержены 45 - 60% паренхимы органа), повторяя, тем самым, ведущие клинические метаморфозы ОП. На фоне тяжелой эндогенной интоксикации, выраженной гиперферментемии и функциональной недостаточности внутренних органов, явлений ферментативного перитонита и жирового некроза в брюшной полости собака выведена из эксперимента болюсным внутривенным введением 1,0 г тиопентала-натрия.

Таким образом изобретение практически осуществимо и является высокоэффективным, простым и доступным способом моделирования острого панкреатита в эксперименте.

Медико-социальный эффект. Способ позволит повысить соответствие экспериментальной модели заболевания основным звеньям этиопатогенеза и клиническим особенностям течения острого панкреатита, упростить моделирование заболевания в эксперименте, существенно повысить качество и достоверность научных исследований.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано при изучении патогенеза острого панкреатита и разработке способов лечения и диагностики данного заболевания. В проток поджелудочной железы вводят катетер. Осуществляют введение в проток смеси аутожелчи и раствора трипсина в равных соотношениях. Смесь вводят в количестве 0,3-0,5 мл/кг массы тела. При этом используют трипсин в концентрации 0,4-0,7 мг/кг. Введение осуществляют под давлением 1360 Па. Затем транзиторно отжимают катетер на срок в 30-40 мин. Способ позволяет повысить соответствие экспериментальной модели заболевания основным звеньям этиопатогенеза и клиническим особенностям течения острого панкреатита и, следовательно, повысить качество и достоверность научных исследований.

Способ моделирования острого панкреатита на собаках, включающий введение катетера и химических веществ в проток железы, отличающийся тем, что в качестве химических веществ используют смесь аутожелчи и раствора трипсина в равных соотношениях и в количестве 0,3-0,5 мл/кг массы тела, при концентрации трипсина в ней 0,4-0,7 мг/кг, которую вводят в проток железы под давлением в 1360 Па, после чего осуществляют транзиторное отжатие на срок в 30-40 мин.