СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ СВИНЬИ Российский патент 1996 года по МПК A61K38/21 

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к способу получения лечебно-профилактических препаратов, и может быть использовано в вирусологии и ветеринарии.

Известен способ получения интерферона, основанный на осаждении белков с помощью роданистого калия с последующим центрифугированием, растворением в кислот этаноле и экстракцией из него интерферона.

Известен также способ получения интерферона, включающий концентрирование интерферона путем сгущения ультрафильтрацией через мембрану, с последующим многократным диализом против различных буферов.

Показана также возможность получения человеческого рекомбинантного интерферона с помощью многоэтапной хроматографической очистки (адсорбционная и ионообменная хроматография, гельфильтрация).

Наиболее близким к заявленному является способ получения интерферона, включающий следующие этапы: свиные лейкоциты через 3-4 ч после взятия крови от животных обрабатывают гепарином, смешивают с 4-кратным объемом 0,83%-ного хлористого аммония, выдерживают в холодильнике 10 мин при 4^оС, центрифугируют при скорости 1000 об/мин в течение 10 мин, а осадок суспендируют в среде N 199 с 10%-ной амниотической жидкости коров до количества 10 млн. клеток на 1 мл. Далее в суспензию лейкоцитов вносят индуктор интерферона вирус болезни Ньюкасла (ВБН), вакцинный штамм "Н" в дозе 10 ЭИД₅₀ (эмбрион инфицирующая доза) на клетку, инкубируют 18-20 ч при температуре 37^оС, центрифугируют, инактивируют индуктор добавлением 25%-ного раствора НСl до рН 2,2-2,4, выдерживают в течение 4 сут при температуре 4^оС и восстанавливают рН до 7,2-7,4 с помощью 20%-ного раствора NaOH. Если в процессе биосинтеза используется прайминг клеток, то перед внесением индуктора в суспензию лейкоцитов вносят свежий лейкоцитарный интерферон в количестве 100 ед. на 1 мл суспензии, смесь инкубируют 2 ч при температуре 37^оС, центрифугируют, суспендируют в среде N 199 с 10%-ной амниотической жидкости коров, добавляют в суспензию вирус-индуктор. Далее определяют антивирусную активность. Средний титр лейкоцитарного интерферона в культуре диплоидных клеток человека 400 МЕ/мл (без использования прайминг-метода) и 10000 МЕ/мл при его использовании.

Однако известные способы получения интерферона (ИФ) обладают рядом недостатков. Так, при применении этих методов теряется от 50 до 70% общей исходной биологической активности ИФ. Они требуют использования дорогостоящих реактивов и оборудования, проведения дополнительной стерилизации, что ведет к дополнительной потере биологической активности и возрастанию себестоимости препарата.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в способе в процессе биосинтеза интерферона вместо питательной среды для культивирования лейкоцитов (среду N 199 добавляют в объеме 2/10 от исходного объема крови и, соответственно, от того объема интерферона, который будет получен), готовящейся на импортных ингредиентах, используют плазму крови свиней, прогретую при 56^оС в течение 0,5 ч, а в конечный продукт вводят эпсилон-аминокапроновую кислоту.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, является использование плазмы крови свиней, прогретой при 56^оС в течение 30 мин, и введение в конечный продукт эпсилон-аминокапроновой кислоты. Именно сочетание этих признаков в процессе проведения способа позволяет получить новый эффект увеличение биологической активности за счет активации биосинтеза ИФ, в то же время ранее в медицине и биологии данные вещества для активации ИФ не использовались. Специально проведенные исследования показали, что заявленные параметры температуры и времени существенны, так как при снижении температуры прогревания плазмы менее 56^оС не происходит инактивации ингибиторов действия интерферона в плазме. То же касается и времени инкубации: при температуре более 56^оС и увеличении времени инкубации более 30 мин инактивируются полезные вещества плазмы, усиливающие биосинтез интерферона.

Способ осуществляется в несколько этапов.

На 1-м этапе получают и обрабатывают плазму крови свиней. Для предотвращения свертывания крови ее собирают в посуду, содержащую 5%-ный раствор натрия лимоннокислого в количестве 1/10 объема крови или гепарин из расчета 10-20 ед. на 1 мл крови. Кровь центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 30 мин. Плазму с помощью пипетки отсасывают до уровня лейкоцитов (около 1/3 объема крови). Затем плазму прогревают при 56±1^оС в течение 30±2 мин в водяной бане. Прогретую плазму для удаления образовавшегося осадка центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 30±2 мин. Плазму до использования хранят в холодильнике при температуре 4-8^оС.

На 2-м этапе получают свиные лейкоциты. После удаления плазмы из крови осторожно пипеткой отсасывают лейкоцитарный слой (около 1/5 объема крови). Лейкоцитарную взвесь смешивают с 4-кратным объемом 0,83%-ного раствора хлористого аммония, выдерживают в течение 10 мин в холодильнике при 4^оС и центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 10±1 мин для отделения продуктов гемолиза. Процедуру повторяют, полученный осадок лейкоцитов суспендируют в объеме среды N 199 или Игла, равном 2/10 исходного объема крови, добавляют прогретую плазму до концентрации клеток 10 млн. в 1 мл и мономицин до концентрации 50 ед. в 1 мл.

На 3-м этапе осуществляют биосинтез интерферона. Для этого в суспензию лейкоцитов вносят индуктор интерферона вирус болезни Ньюкасла (ВБН) вакцинный штамм "Н" в дозе 10 ЭИД₅₀ на 1 лейкоцит и 5%-ный раствор аминокапроновой кислоты в объеме 0,1 мл на 1,0 мл суспензии. Взвесь лейкоцитов инкубируют при температуре 37±1^оС в течение 18-20 ч, затем центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 30±2 мин для отделения клеток от культуральной жидкости. Культуральную жидкость, содержащую интерферон, сохраняют в холодильнике при 4^оС до момента определения титра интерферона. Определение антивирусной активности проводят известным методом 4. Средний титр интерферона, полученного заявленным способом, составляет в среднем 500000 МЕ/мл.

В таблице представлены сравнительные характеристики заявленного способа получения интерферона и прототипа.

П р и м е р 1. На 1 этапе получают и обрабатывают плазму крови свиней. Для предотвращения свертывания крови ее собирают в посуду, содержащую 5%-ный раствор натрия лимоннокислого в количестве 1/10 объема крови или гепарин из расчета 10-20 ед. на 1 мл крови. Кровь центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 30 мин. Плазму с помощью пипетки отсасывают до уровня лейкоцитарного слоя (около 1/3 объема крови). Затем плазму прогревают при 56±1^оС в течение 30±2 мин в водяной бане. Прогретую плазму для удаления образовавшегося осадка центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 30±2 мин. Плазму до использования хранят в холодильнике при 4^оС.

На 2-м этапе получают свиные лейкоциты. После удаления плазмы из крови осторожно пипеткой отсасывают лейкоцитарный слой (около 1/5 объема крови). Лейкоцитарную взвесь смешивают с четырехкратным объемом 0,83%-ного раствора хлористого аммония, выдерживают в течение 10 мин в холодильнике при 4^оС и центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 10±1 мин для отделения продуктов гемолиза. Процедуру повторяют, полученный осадок лейкоцитов суспендируют в объеме среды N 199 или Игла, равном 0,2 исходного объема крови, добавляют прогретую плазму до концентрации клеток 10 млн. в 1 мл и мономицин до концентрации 50 ед./мл.

На 3-м этапе осуществляют биосинтез интерферона. Для этого в суспензию лейкоцитов вносят индуктор интерферона вирус болезни Ньюкасла (ВБН) вакцинный штамм "Н" в дозе 10 ЭИД₅₀ на 1 лейкоцит и 5%-ный раствор аминокапроновой кислоты в объеме 0,1 мл на 1 мл суспензии. Взвесь лейкоцитов инкубируют при 37±1^оС в течение 18-20 ч, затем центрифугируют при 1000±100 об/мин в течение 30±2 мин для отделения клеток от культуральной жидкости. Культуральную жидкость, содержащую интерферон, сохраняют в холодильнике при 4^оС до момента определения титра интерферона. Определение антивирусной активности проводят известным методом. Средний титр свиного интерферона, полученного заявленным способом, составляет в среднем 500000 МЕ/мл.

Таким образом, приведенные материалы свидетельствуют о том, что заявленный способ дает возможность получить интерферон с высоким титром антивирусной активности, превышающей таковую у прототипа в 50 раз. В то же время способ является доступным, дешевым, а полученный интерферон не теряет специфической активности в условиях длительного хранения.

Все это дает основание рекомендовать заявленный способ для широкого использования при получении ИФ, применяемых в здравоохранении и ветеринарии для профилактики и лечения вирусных заболеваний.

Использование: в биологии, медицине, и вирусологии и ветеринарии. Сущность изобретения заключается в том, что в процессе биосинтеза интерферона используют плазму крови свиней, прогретую при 56^oС в течение 0,5 ч, а в конечный продукт вводят эпсилон-аминокапроновую кислоту. Способ позволяет получить интерферон с высокой антивирусной активностью, которая не снижается в условиях длительного хранения. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ СВИНЬИ, включающий обработку лейкоцитов хлористым аммонием, осаждение их, суспендирование в питательной среде, добавление вируса болезни Ньюкасла в качестве индуктора, инкубацию и последующее удаление лейкоцитов, отличающийся тем, что лейкоциты суспендируют в среде, дополнительно содержащей плазму крови свиней, предварительно прогретую в течение 30 мин при 56^oС, при этом лейкоциты в питательной среде разводят плазмой до концентрации 10 млн/мл, а после внесения индуктора добавляют ε -аминокапроновую кислоту до ее конечной концентрации 0,5%