БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/14 A61K38/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к биологически активным препаратам, обладающим противовирусной и иммуномодулирующей активностью, способам их получения и применения, предназначенным для профилактики и лечения инфекционных и незаразных болезней, повышения иммунобиологической реактивности организма людей.

Известны биопрепараты, способы их получения и применения, обладающие противовирусной активностью и обеспечивающие повышение иммунобиологической реактивности организма людей, прежде всего детей. Это вакцины, гипериммунные сыворотки, препараты, препараты иммуно- глобулинов, интерферонов.

В качестве аналогов наиболее предпочтительными по сути предлагаемого изобретения являются препараты интерферона, способы его получения и применения (В.Соловьев, Т.Бактемиров "Интерфероны в теории и практике медицины". 2-е изд. М. "Медицина", 1981; Д.Лазарева, Е.Алехин. "Стимуляторы иммунитета". М. "Медицина", 1985).

Прототипом изобретения является препарат "Интерферон лейкоцитарный человеческий сухой" для интраназального применения при профилактике и лечении гриппа и других вирусных респираторных заболеваний.

Недостатком этого препарата, способа его получения и применения является низкая его активность (титр 1:100 1:512), что требует существенного повышения производства при широком применении в медицине, а также очень большой дефицит сырья крови человека. Технология получения этого препарата, как и другие известные способы получения нативных препаратов интерферонов (лейкоцитарных) не позволяет получить препараты с активностью 1:10³.

Целью предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, т. е. обеспечение повышения противовирусной активности препарата и увеличение эффективности его производства и применения. Поставленная цель достигается определением эффективной композиции препарата, высокоэкономичной и производительной технологией изготовления и оптимальной схемой применения.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Биологически активный препарат состоит из продуктов культивирования индуцированных лимфоидных клеток людей (лейкоциты доноров) и наполнителей при следующем соотношении компонентов (в сухом препарате), мас. белки 3,0-30,0; аминокислоты 1,6-9,0; жирные кислоты 0,10-15,0; сахара 2,5-30,0; аскорбиновая кислота 0,6-10,0; вода 1-5; соли до 100. Противовирусная активность препарата (титр) составляет 10⁴ 1:10⁷ в системе ВВС фибробласты эмбриона человека.

Препарат получают при культивировании в течение 12-24 часов лимфоидных клеток (лейкоциты доноров) людей в присутствии вирусных (ВБН, ВС) индукторов с последующим концентрированием белков и внесением жирных кислот и сахаров и объединением фракций неконцентрированных и концентрированных продуктов в соотношении 1:1 100000:1 с добавлением наполнителей. Получаемый таким образом препарат с охарактеризованными свойствами (по противовирусной активности) эффективен по применению в лечебных и профилактических дозах (соответственно 10⁶ и 1-5х10³) при парентеральном или наружном применении.

П р и м е р 1 (оптимальный вариант). Биологически активный препарат получают следующим образом.

I стадия. Культивируют лимфоидные клетки (крови) людей (1-20 млн. клеток/см³) при добавлении последовательно лейкоцитарного интерферона человека (40-200 ед/см³), инсулина (0,0020 ед/см³), вирусных индукторов (вирус болезни Ньюкастла (ВБН 10-40 ТЦД_50/см³ на клетку; вирус Сендай 10-30 ТЦД_50/см³ на клетку). Продукты культивирования индуцированных клеток (режим биосинтеза 12-24 ч при 36,5-37,5^оС, концентрация клеток 1-10 млн. клеток/см³ в перемешивающейся суспензии, питательные среды типа 199, РПМИ-1640) центрифугируют. Затем центрифугат подкисляют до рН 2,5 и выдерживают не менее 72 ч, затем рН выравнивают до 6,0-6,5 добавлением растворов КОН или NaOH. Далее фильтруют через стерилизующие фильтры и часть фильтрата (1-10%) лиофилизуют.

2 стадия. Лиофилизованный полупродукт растворяют в 0,02-0,7 М буферном (боратном) растворе (10 мг/см³) и вносят в соотношении 1:6-1:15 в раствор поверхностно-активных веществ, например 0,2-0,4М раствор аэрозоля ОТ (натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты), а затем добавляют раствор жирной кислоты (например, пальмитиновая, стеариновая) (10-1000 мг) и насыщенный раствор сахаров (например, глюкоза, сорбит и др.) в количестве 2-20 мг. Далее к системе добавляют избыточное количество (1-5-кратное) ацетона и выпавший осадок промывают 3-5 раз ацетоном. Последний удаляют испарением.

3 стадия. Объединяют часть препарата, полученного на 1 стадии, и растворенную в физиологическом растворе (буфер) часть препарата, полученную на 2 стадии, в соотношении 2:1 1:10 (соотношение белковой фракции в частях 1:1 100000: 1), добавляют желатину или белки плазмы крови до конечной ее концентрации 0,1-1% аскорбиновую кислоту (до конечной концентрации 0,03-0,3%) и используют либо в жидком либо в лиофилизованном виде.

Состав композиции следующий,
Белки 3,0-30,0
Аминокислоты 1,6-9,0
Жирные кислоты 0,10-15,0
Сахара 2,5-30,0
Аскорбиновая кислота 0,6-10,0
Вода 1-5
Соли До 100
Противовирусная активность (титр) 1:5000 1:1000000000 (5000 10 млн.ед.).

П р и м е р 2 (отрицательный вариант, пример 2 по таблице) Препарат получают так, как описано в примере 1, но используют только процедуры, изложенные в 1 стадии.

Противовирусная активность препарата в этом случае не превышает (титр) 1:500 1:1000 (500-1000 ед.). В составе препарата нет жирных кислот, сахаров, аскорбиновой кислоты.

П р и м е р 3 ( недостаточно эффективный вариант, пример по табл.). Препарат получают так, как описано в примере 1, но используют только процедуры, изложенные в стадии 1 и 2 (без третьей стадии).

Противовирусная активность препарата составляет 10⁵-10⁶ ед/мг. В составе препарата отсутствует 60-90% белка, 100% аскорбиновой кислоты. Получаемый препарат в 10-100 раз менее активен, чем при изготовлении по технологии, изложенной в примере 1. Еще один недостаток его можно расфасовывать только в сухом виде, что технологически крайне сложно.

П р и м е р 4 (см. таблицу).

П р и м е р 5. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание белка менее 3% В этом случае не достигается необходимой активности (10⁴ 10⁷ ед. ), из-за потери противовирусной активности в процессе приготовления препарата потеря активности в 100-1000 раз. При повышении концентрации белка свыше 30,0% в препарате технологический процесс по- лучения препарата является экономически нецелесообразным.

П р и м е р 6. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание жирных кислот менее 0,10% В этом случае не достигается активности препарата выше 1000 ед. что не обеспечивает необходимой активности препарата (10⁴ 10⁷ ед. ). При повышении концентрации жирных кислот выше 15,0% в препарате наблюдается снижение активности препарата в 100 раз и более.

П р и м е р 7. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание сахаров (например, глюкоза, манноза, сорбит и др.) менее 2,5% При этом получаемый на 2 стадии полупродукт является малорастворимым, что не обеспечивает получение препарата с активностью выше 1000 ед. При повышении концентрации сахаров свыше 30% наблюдается снижение активности препарата в 10 раз и более (очевидно, за счет блокирования мембрано-активных центров противовирусных компонентов препарата).

П р и м е р 8. Препарат получают, как описано в примере 1, но содержание аскорбиновой кислоты менее 0,6% В этом случае при хранении продукта свыше 1 месяца наблюдается постепенное снижение активности препарата в 10 раз и более. При повышении концентрации аскорбиновой кислоты свыше 10% наблюдается снижение активности препарата в 15-20 раз и более.

Таким образом, приведенные примеры осуществления предлагаемого изобретения свидетельствуют о том, что указанные параметры биологически активного препарата для наружного применения и способа его получения позволяют готовить препараты с высокой противовирусной активностью (10⁴-10⁷ ед.).

Авторами на себе и на добровольцах с очень высоким эффектом был апробирован этот препарат. В частности, в виде капель для профилактики и лечения различных форм гриппа; электрофоретического введения в виде эмульсий и мазей для лечения пневмоний, подкожного введения в виде растворов для лечения различных форм гриппа, пневмоний и др. болезней.

Изобретение относится к медицине, точнее к биологически активным препаратам, обладающим противовирусной и иммуномодулирующей активностью. Предложен биологически активный препарат, состоящий из продуктов культивирования индуцированных лимфоиднных клеток человека, а также способ получения этого препарата. 1 з. п. ф-лы.

1. Биологически активный препарат, состоящий из продуктов культивирования индуцированных лимфоидных клеток человека и наполнителей, отличающийся тем, что из продуктов культивирования он содержит белки, аминокислоты, соли, а из наполнителей жирные кислоты, сахара, аскорбиновую кислоту, белки и воду при следующем соотношении, мас.

Белки 3,0 30,0
Аминокислоты 1,6 9,0
Жирные кислоты 0,10 15,0
Сахара 2,5 30,0
Аскорбиновая кислота 0,6 10,0
Вода 1 5
Соли До 100
2. Способ получения биологически активного препарата, включающий культивирование лимфоидных клеток в присутствии вирусных индукторов, отличающийся тем, что проводят культивирование вирусиндуцированных лимфоидных клеток человека в течение 12 24 ч, затем центрифугируют, фильтруют через стерилизующие фильтры, полученный фильтрат разделяют на две части: одну часть 1 10% лиофилизуют, растворяют в буферном боратном растворе 10 мг/см³ и вносят в соотношении 1 6 1 15 в 0,2 0,4 М раствор аэрозоля ОТ, добавляют 10 1000 мкг жирной кислоты, 2 20 мг сахара и осаждают 1 - 5-кратным количеством ацетона, полученный осадок, растворенный в физиологическом растворе, смешивают с второй частью фильтрата в соотношении 2 1 1 10, добавляют белки плазмы крови и/или желатину до конечной концентрации 0,1 1% аскорбиновую кислоту до конечной концентрации 0,03 - 0,3% и лиофилизуют.