СПОСОБ ИММУНОСТИМУЛЯЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 1996 года по МПК A61K31/75 A61K31/23 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии.

В последнее время нашли широкое применение в быту и фармации разнообразные поверхностно-активные вещества, oсобенно неионогенные, так как последние обладают самой низкой токсичностью. Неионогенные ПАВ /НПАВ/ применяются, например, с целью снижения статической электризации в процессе прядения в текстильной промышленности, целлюлозно-бумажном производстве и т.д. /Н.Шенфельд, 1982/. НПАВ являются основным действующим компонентом бытовых антистатиков типа "Лана", "Антистатик", "Чародейка", "АНЭЛ", входит в состав некоторых шампуней, кремов для бритья и зубных паст. В фармации они используются как компоненты препаратов, используемых для лечения кожных заболеваний /Европейские патенты N 0245126 /1987/, N 0203211 /1986/, Патент США N 46135921 /1986/, в качестве антимикробного и противовирусного средства /Патент США N 4136930, публ. 13.02.1979/. НПАВ широко используются как гемостимуляторы /Международная заявка МКИ А 61 К 37/02, 9/00, Великобритания /СВ/ N 2177914, публ. 87.02.04./, как средства, стимулирующие ретикулоэндотелиальную систему /Международная заявка, МКИ А 61 К 27/00, Франция, N 2262514, публ. 1975/, как синергические добавки к иммуностимуляторам /Международная заявка, МКИ А 61 К 39/30 ФРГ /ДЕ/ N 03712768/. Сотрудники НИИ эпидемиологии и микробиологии БССР О.В. Давыдов и Т.В. Воронцова предложили простые и сложные эфиры этиленгликоля /НПАВ/ в качестве стимуляторов иммуногенеза /а.с. N 468629, публ. 30.04.75; N 554866, публ. 05.09.75./.

Влияние НПАВ на интактный организм к настоящему времени более или менее изучено. Более актуальна проблема иммуностимуляции на фоне иммунодепрессии. В качестве модели приобретенного иммунодефицитного состояния или нелучевой иммунодепрессии можно предложить змеиные яды, в частности, яды гадюковых змей, иммунодепрессивный эффект которых известен. В литературе paнee такой вопрос не обсуждался.

Цель предлагаемого изобретения стимулировать иммунную систему на фоне иммунодепрессии, вызванной змеиными ядами.

Представленная цель достигается подкожным введением неионогенных ПАВ - СТЕАРОКС-920 и ОС-20 лабораторным животным нелинейным белым мышам и морским свинкам.

СТЕАРОКС-920 полиэтиленгликоль моностеарат /производство СФРЮ, аналог Ethofat 60/20 Armak СО США/ представляет собой вещество желтого цвета, твердой консистенции, с температурой плавления 45^oС. ОС-20 моноалкиловый эфир полиэтиленгликоля на основе первичных жирных спиртов /производство СССР аналог Ethylan CT-Lankrol td, Англия/ представляет вещество воскообразной консистенции, желтого цвета, с температурой застывания 3З-З6^oС, растворим в воде, нетоксичен. Оба препарата обладают антистатическим эффектом и получены в технологическом отделе местной трикотажной фабрики.

Водные растворы ПАВ вводили в количествах 0,75 мг/100 г, 1,5 мг/ 100 г, 0,15 мг/100 г подкожно.

Для получения модели иммунодепрессии использовали яд гадюки обыкновенной и эфы песчаной, относящихся к семейству гадюковых /Vineridae/. Яд растворяли на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и вводили подкожно из расчета 0,12 мг/100 г яд гадюки обыкновенной, 0,08 мг/100 г яд эфы песчаной, составляющие 1/4 1/5 от 1Д₅₀.

Пример 1. А. Нелинейные белые крысы в количестве 108 были разделены на три группы. Крысам первой группы проводили двукратную иммунизацию стафилококковым анатоксином из расчета 0,1 мл/100 г с интервалом 8 дней. Крысам второй подгруппы двукратную иммунизацию проводили на фоне введения змеиных ядов при первой иммунизации. Животным третьей подгруппы одновременно при первой иммунизации вводили тот или иной змеиный яд в соответствующей дозе и двукратно с интервалом 8 дней /одновременно с инъекциями анатоксина/ раствор того или иного НПАВ в дозах 0,75 мг/100 г и 1,5 мг/100 г, причем инъекции всех веществ производили в разные участки тела. Забор крови проводили через 14 дней после первой иммунизации.

Дополнительное введение подопытным животным с депрессией гуморального иммунитета неионогенных ПАВ существенно улучшало продукцию антител при иммунизации стафилококковым анатоксином. Доза 0,75 мг/100 г препарата ОС-20 оказалась неэффективной в иммуноадъювантном плане. Титр антител практически не отличался /Р > 0,05/ в подгруппах с применением этого вещества и без него. СТЕФРОКС-920 в такой же дозе оказывал слабый, но статистически достоверный /P <0,05/ иммуностимулирующий эффект: среднее значение титра антител в серии анатоксин + яд гадюки + СТЕАРОКС-920 1:2,5; в серии анатоксин + яд эфы + СТЕАРОКС-920 1: 2,18 против контроля /анатоксин + яд гадюки/ 1:1,38, /анатоксин + яд эфы /- 1:1,13. Доза 1,5 мг/100 г была иммуностимулирующей для обоих ПАВ. Например, если на фоне иммунодепрессии, инициированной ядом гадюки, титр антител равнялся после иммунизации 1:1,38, то после дополнительной инъекции СТЕАРОКС-920 уже 1:6,3 /Р 0,001/. Несколько слабее выражена иммуностимулирующая активность ОС-20 1:5,1 /Р < 0,001/. Таковы же закономерности воздействия двух иммуностимуляторов на фоне иммунодепрессии ядом эфы песчаной.

Б. Нелинейные белые крысы в количестве 112 так же как и в предыдущей серии разделены на три подгруппы. Иммунизацию животных проводили вакциной кишечной палочки. Схема иммунизации и введения НПАВ и офидиотоксинов такая же, как и в предыдущей серии.

Иммунизация на фоне введения яда гадюки многократно /среднегеометрическое значение титра антител 0,39±0,25/ угнетало антителогенез по сравнению с контрольной группой /среднегеометрическое значение титра антител 6,34±0,17//P < 0,001/. Иммунизацию животных на фоне введения яда гадюки и СТЕАРОКС-920 в дозе 0,75 мг/100 г стимулирует иммуногенез: среднегеометрическое значение титра антител paвен 2,97±0,25, а введение НПАВ в дозе вдвое большей примерно на столько же увеличивает выработку антител: отрицательный log₂ титра антител равен 4,76±0,18.

Среднегеометрические показатели титра антител при дополнительном введении ОС-20 при иммунизации на фоне введения яда гадюки почти такие же, как и при инкорпорировании СТЕАРОКС-920.

При использовании в качестве иммунодепрессора яда эфы песчаной возникают такие же закономерности изменения показателей гуморального иммунитета, что и в сериях с ядом гадюки обыкновенной /Р < 0,05/.

Таким образом, СТЕАРОКС-920 и ОС-20 обладают значительным иммуностимулирующим действием при иммунизации как растворимым /стафилококковый анатоксин/, так и корпускулярным /вакцина кишечной палочки/ антигенами.

Пример 2. Нелинейные белые крысы в количестве 176 разделены на 4 группы. Животным первой /контрольной/ группы вводили изотонический раствор хлорида натрия в количестве 0,2 мл. Крысам второй группы инъецировали один из исследуемых НПАВ в той или иной дозировке /0,75 мг/ 100 г и 1,5 мг/100 г/. Животным третьей группы инокулировали один из испытуемых ядов. Животным четвертой группы одновременно вводили один из ядов и один из НПАВ в Д 1,5 мг/100 г.

Изучение антителообразования проводилось на основании локального гемолиза по методу Ерне-Нордина через 5 и 24 часа после введения испытуемых веществ.

Введение офидиотоксинов заметно снизило степень выживаемости лимфоидных клеток и число бляшкообразующих /антителообразующих/ клеток в селезенке по сравнению с контролем /Р > 0,05/. Введеyие СТЕАРОКС920 и ОС-20 в дозе 0,75 мг/100 г не оказывало существенного влияния на выживаемость лимфоидных клеток и на число антителообразующих клеток /АОК/ как в 5-часовой, так и в 24-часовой сериях. НПАВ в дозе вдвое большей заметно стимулировали как выживаемость клеток, так и активность реакции локального гемолиза /Р < 0,05/.

Совместное введение змеиных ядов и НПАВ заметно стимулировало реакцию бляшкообразования. Одинаковое /в 1,5 раза/ увеличение содержания живых лимфоидных клеток происходило при введении обоих НПАВ на фоне иммунодепрессии. Причем происходило это при 5-часовом и 24-часовом исследованиях. Со стороны антителообразующих клеток более выраженное их увеличение наблюдалось при введении СТЕАРОКС-920 на фоне действия яда гадюки 4,98±0,29, чем ОС-20 3,63±0,28.

Количество АОК при введении НПАВ на фоне действия яда эфы песчаной заметно возросло до сравнению с соответствующим показателем контрольной группы /яд эфы песчаной/: через 5 часов 4,63±0,26 /СТЕАРОКС920/ и 3,13±0,34 /ОС-20/ против 0,88±0,33 /только яд/; через 24 часа соответственно 4,75±0,25 и 2,38±0,18 против нулевого показателя в контроле. Причем активность ОС-20 была слабее СТЕАРОКСа-920 в 1,52 раза. Сравнивая результаты совместного действия офидиотоксинов и НПАВ с результатами, полученными при введении изотонического раствора хлорида натрия, можно отметить, что неионогенные ПАВ настолько стимулировали реакцию локального гемолиза на фоне действия офидиотоксинов, что показатели достигали контрольных значений /изотонический раствор хлорида натрия /Р > 0,05/ и даже превышали их /Р < 0,05/.

Пример 3. В опытах на 70 морских свинках исследовано влияние СТЕАРОКС-920 /0,15 мг/100 г/ на фоне введения яда эфы песчаной /0,08 мг/100 г/. Животные были разделены на 4 группы. Первой /контрольной/ группе животных подкожно инъецировали физиологический раствор, второй вводили только яд, третьей
только НПАВ, четвертой яд + НПАВ. Забор крови проводили через 1, 24 и 48 часов. Исследовали популяционный состав лимфоцитов периферической крови, а также провели анализ лейкоцитарной формулы.

Подкожное введение яда эфы уже через 1 час вызывало двух-, трехкратное, в зависимости от учета абсолютных или относительных величин, уменьшение количества Т-лимфоцитов /в контроле 755±64 клеток в 1 мкл, или 35±3%/, и в такой же степени увеличение В-лимфоцитов /в контроле 1463±282 клеток в 1 мкл, или 44, 4±8,6% Дополнительное же введение на фоне офидиотоксикоза СТЕАРОКС-920 столь же быстро вызвало "нормализацию" в соотношениях популяций лимфоцитов периферической крови. Через 24 часа после инокуляции змеиного яда наблюдалось резкое уменьшение числа Т-лимфоцитов более чем в 20 раз. Количество В-лимфоцитов возросло в 2 раза через 24 и 48 часов. Через 48 часов число Т-лимфоцитов начало увеличиваться, по сравнению с суточным сроком различие было трехкратным /196±30,9 клеток в 1 мкл/. Дополнительное инкорпорирование СТЕАРОКС-920 приводило к весьма существенному увеличению общего числа лейкоцитов /5256±300 клеток в 1 мкл/ и лимфоцитов /3186±490 клеток в 1 мкл/, к нормализации уровня В-лимфоцитов /787±204 клеток в 1 мкл/, но двухкратному росту содержания "нулевых" клеток /1802±295 клеток в 1 мкл/, более активному восстановлению Т-лимфоцитов /528,2±173 клеток в 1 мкл/.

Анализ лейкоцитарной формулы показал, что змеиные яды вызывают омоложение нейтрофилов гранулоцитарного ряда до стадии миелоцитов и даже промиелоцитов. А дополнительное введение СТЕАРОКС-920 не ликвидирует картину лейкемоидной реакции, но заметно снижает степень ее выраженности. Например, количество сегментоядерных нейтрофилов нa 1 мкл цельной крови составило в среднем 2193 через 24 часа, 2571 через 48 часов от начала интоксикации, а при дополнительном введении НПАВ уже 1583, при исходном уровне /контроль/-1294.

Таким образом, неионогенные ПАВ СТЕАРОКС-920 и ОС-20 обладают выраженным иммуностимулирующим действием на фоне иммунодепрессии, вызванной змеиными ядами. Выявлен дозозависимый эффект. Препарат оксиэтилированной жирной кислоты /СТЕАРОКС-920/ обладает более высокой активностью стимуляции иммуногенеза /на 15-20%/, чем производное высшего жирного спирта /ОС-20/.

Способ иммуностимуляции при помощи указанных НПАВ может быть рекомендован при депрессии иммунной системы змеиными ядами, а также в целях корригирования показателей иммунного статуса лиц, подвергшихся укусам змей, скорпиона, каракурта и т.д.

Изобретение относится к области медицине, а именно к иммунологии. Предлагаемые средства - СТЕАРОКС-920 и ОС-20 /неионогенные поверхностно-активные вещества/ позволяют стимулировать иммунную систему, супрессированную змеиными ядами или другими зоотоксинами. Это позволяет рекомендовать их как средства для корригирования показателей иммунного статуса лиц, подвергшихся укусам змей, каракурта, скорпиона и т.д.

Способ иммуностимуляции в эксперименте, отличающийся тем, что при иммунодепрессии, обусловленной офидиотоксикозом, вводят подкожно водный раствор "СТЕАРОКС-920" или "ОС-20" в дозе 1,5 мг/100 г массы лабораторного животного.