Способ получения стафилококковой антисыворотки крови человека Советский патент 1989 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению донорских иммунных гамма-глобулинов, и может быть использовано на станциях переливания крови при отборе доноров для иммунизации адсорбированным стафилококковым анатоксином.

Целью изобретения является повышения титра специфических антител за счет получения сыворотки, содержащей антитела к альфастафилолизи- ну, являющемуся ведущим фактором патогенности стафилококков, в концентрации 6 ме/мл.

Согласно предлагаемому способу доноров определяют HLA локусов А, В, С, затем из этой группы исключают лиц, имеющих антигены HLA - А1, В 14, бланк-антигены локуса С. Иммунизацию адсорбированным стафилокок ковым анатоксином проводят всем осг тавшимся донорам, при этом предпочтение отдается донорам, имеющим HLA

В27; Введение адсорбированного стафилококкового анатоксина осуществляют внутрикожно, трехкратно с интервалом в одну неделю в дозах 1,0} 1,0; 2,0 мл.

Способ осуществляется следующим образом.

Определение HLA осуществляют с помощью микролимфоцитотоксического теста. Кровь, полученную путем ве- нопункции, в объеме 2-3 мл дефибри- нируют лучинкой 5-7 мин, разводят в соотнощении 2 ч. крови: 3 ч. физиологического раствора и наслаивают на 1 мл раствора фиколл - верографин плотностью 1,077 г/мл. Данный раствор для вьвделения лимфоцитов готовят смешивая растворенный в дистиллированной воде фиколл (12 ч. го раствора) и верографин (5 ч. 33,9%- ного раствора). Денситометром прове - ряют плотность раствора. Сразу же после наслаивания кровь центрифугиСП

СП

3150

руют в течение 20 мин (при 18°С), 2000 об/мин на центрифуге К-23. Пастеровской пипеткой отсасывают кольцо лимфоцитов, образовавшееся на границе сыворотки и разделяющей смеси. Полученную взвесь лимфоцитов дважды отмывают раствором Хенкса, концентрацию их доводят до 4-6 тыс. в 1 мм и вносят в объеме 0,001 мл в лунки камеры для микротитрования, где под слоем вазелинового масла находятся различные образцы (0,001 мл) анти- HLA сывороток локусов А,В и С (используют гистотипирующую панель), Смесь инкубируют при в течение 1 ч. После инкубации в каждую лунку добавляют по 0,004 мл смеси заранее оттитрованного комплемента. Пластины инкубируют еще 1 ч, а затем в каждую лунку добавляют по 1 мкл рабочего раствора эозина. Вазелиновое масло через 10-15 мин стряхивают и учитывают результат по схеме:

отрицательная реакция (-) - О- 10% лизированных лимфоцитов;

слабоположительная реакция (+) - 15-20% лизированных лимфоцитов}

реакция положительная (++) - 21- 39% лизированных лимфоцитов;

отчетливо положительная реакция (+++) - 40-70% лизированных лимфоцитов;

реакция резко положительная (+++ +) - 80-100% лизированных лимфоцито

Антигены HLA определяют, используя кросс-реакции А и В локусов. При наличии у донора антигенов HLA А1, В14, бланк-антигенов локуса С его отводят от иммунизации. Прививки адсорбированным стафилококковым анатоксином осуществляются внутри- кожно с интервалом в 1 неделю в дозах 1,0; 1,0; 2, О мл всем оставшимся донорам, при этом предпочтение отдается лицам, имеющим антиген HLA-B27, Начиная с момента третьей прививки, донор с двухнедельным интервалом 10 раз сдает плазму для производства антистафилококкового гамма-глобули- ,на. При трехкратном определении в сыворотке крови анти-альфа-стафило- лизинов в реакции нейтрализации гемолитических свойств альфа-стафилото сина в титрах 2 ме/мл и ниже донора отводят от сдачи плазмы, В против- ном случае сдача крови им продолжается через месяц (10 раз с интервалом в две недели) и после этого, ес

Q j 20

25

зо

50 - 55

40

ли титры антител достаточно высоки, через месяц (10 раз с двухнедельным интервалом),

Пример 1, Донор 1961 г рождения, группа крови 0(1) Rh, По данным микролимфоцитотоксического теста имеет антигены большой системы гис- тосовместимости А10,25; В 27, CW2, Иммунизирован адсорбированным стафилококковым анатоксином трехкратно, внутрикожно в дозах 1,0; 1,0; 2,0 мл. Максимальный титр анти-альфа-стафило- лизинов выработался в титре 10 ме/мл. Пример 2.Донор 1960 г. ния, группа крови 0(1) Rh , По данным микролимфоцитотоксического теста имеет антигены большой системы гис- тосовместимости А2,10; В5,7; CW2, Иммунизирован адсорбированным стафилококковым анатоксином согласно вышеуказанной схеме. Максимальный титр анти-альфа-стафилолизинов выра- ботался в титре 6 ме/мл,

П р и м е р 3. Донор 1952 г, рождения, группа крови АВ(1У) ,По данным микролимфоцитотоксического теста имеет антигены большой систе- 1 гистосовместимости А1, В7,14; CW - неопределены. Отстранен от сдачи плазмы на стафилококковый гамма- глобулин в связи с неэффективностью иммунизации (максимальный титр анти альфа-стафф1олизинов 2 ме/мл).

Предложенный способ разработан опытным путем. Исследовано 126 доноров, иммунизированных адсорбированным стафилококковым анатоксином. Вакцинацию проводили согласно пред-, ложенной схеме, У данных лиц определяли HLA локусов А и В, Максимальная концентрация анти-альфа-стафилолизи- нов после иммунизации устанавливалась титрацией сыворотки донора в течение всего периода сдачи им крови. Для анализа связи между интенсивностью иммуного ответа на адсорбированный стафилококковый анатоксин и антигенами большой системы гистосовместимости были выделены две группы привитых: 1 группа - 39 человек, у которых после трехкратного введения анатоксина антитела к аль- фа-стафилолизину не вырабатывались или вырабатывались в низких титрах (2-4 ) ; 2-я - 87 человек - иммуноактивные доноры (максимальные концентрации антител 6 ме/мл и выше). Анализ данной характеристики с истпользованием критерия соответствия X пokaэaл, что наличие у донора антигенов HLA-A1; В14 связано (,01 с низким иммунным ответом (критерий Х равен 8,1 и 7,78), а антиген HLA - В 27 достоверно связан (р .0,05) с высоким иммунным ответом на адсорбированный стафилококковый анатоксин. Анализ относительной зффективности иммунизации, проведенный по формуле, аналогичной определению относительного риска заболеваемости, подтвердил перечисленные выводы. Установлен но, что относительный риск получения низких титров анти-альфа-стафилолизи- иов при иммунизации адсорбированным У стафилококковым анатоксином лиц, имеющих антигены А1 и В14, равен соответственно 3,7 и 6,1, а относительная эффективность иммунизации доноров, имеюцих в генотипе антиген В 27, равняется 4,5.

С целью выяснения наличия связи между антигенами большой системы ги- стосовместимости локуса С и ром иммунного ответа на адсорбированный стафилококковый анатоксин, проведен анализ вышеуказанных факторов у 74 доноров, который показал, что наличие в генотипе неопределяемых антигенов указанного локуса связано с низким иммунным ответом (р ,05).

При отстранении от иммунизации доноров с антигенами А1, В14, бланк антигенами локуса С процент эффективной иммунизации (наличие доноров с максимальным титром анти-альфа-ста- филолизинов .6 ме/мл и вьппе) повьппа0 ется с 69 до 82%; проведение прививок лицам, имеющим в генотипе антиген В27, увеличивает эффективность иммунизации до 89%, что позволяет снизить материальные затраты на при5 гото ление антистафилококкового гамма-глобулина на 5,2%.

Формула изобретения

20

Способ получения стафилококковой антисыворотки крови человека путем иммунизации доноров адсорбированным стафилококковым анатоксином с последующим отбором сьгаорртки, о т л и 25 чающийся тем, что, с целью повышения титра специфических антител, перед иммунизацией в лимфоцитах доноров определяют антигены системы HLA и для иммунизации используют до- Моров, содержащих антиген В-27 при Ьтсутствии антигенов А1, В14 и бланк Ьнтигенов локуса С.

30

Изобретение относится к области медицины, а именно к проблеме получения донорских иммунных гамма-глобулинов и может быть использовано при иммунизации доноров адсорбированным стафилококковым анатоксином. Цель изобретения - повышение титра специфических антител и достигается тем, что для иммунизации используют доноров, содержащих антиген В-27 при отсутствии антигенов А 1, В 14 и бланк антигенов локуса С системы HLA, которые определяют на лимфоцитах доноров.