ПРОИЗВОДНЫЕ ВАЗОТОЦИНА Российский патент 1996 года по МПК C07K7/06 C07K7/16 C07K7/52 A61K38/12 

Изобретение относится к новым производным вазотоцина, более конкретно к таким производным вазотоцина (VТ), которые отличаются от природного гормона структурой вазотоцина, имеющей модификации в положении 1, 4, 8 и необязательно 2.

Новые производные вазотоцина вазоактивны более всего из-за специфичности повышать кровяное давление и в некоторых случаях имеют значительный пролонгированный эффект.

Пептидный гормон вазопрессин, выделяемый задней долей гипофиза в основном имеет две функции: так гормон обладает как антидиуретическим свойством (понижающим мочеотделение), так и под его воздействием сокращаются гладкие мышцы, находящиеся в сосудистой стенке, последнее свойство вызывает повышение кровяного давления, уменьшение кровотечения. При клиническом применении вазопрессин дает неспецифический эффект на непродолжительный срок.

В настоящее время на рынке имеется аналог вазопрессина пролонгированного действия под названием лизин-вазопрессин, удлиненный на N-конце тремя аминокислотными остатками. Этот аналог вазопрессина действует как так называемый прогормон или гормоноген, то есть увеличивает продолжительность действия вазопрессина.

Удлиненный аналог вазопрессина имеет сам по себе очень малый фармакологический эффект, который не проявляется до тех пор пока N-концевые аминокислотные остатки не расщепляются посредством энзиматического гидролиза и не образуется свободный лизин-вазопрессин. Кроме продолжительного эффекта гормон имеет преимущество в том, что риск передозировки минимальный из-за ограниченной энзимной способности организма, определяющей уровень плазмы освобожденного вазопрессина. Таким образом, возможно избежать чрезмерно высокого уровня плазмы вазопрессина, возможно управлять ненормально повышенным кровяным давлением, которое может вредить пациенту. Вышеуказанный аналог вазопрессина, однако имеет большой недостаток из-за низкой эффективности и подобно вазопрессину неспецифичности.

Имеется необходимость сосудосуживающих веществ для использования их в качестве ингибиторов крови и в так называемой ортостатической гипотензии, то есть в условиях, уменьшающих кровяное давление, вызванных изменением положения тела. Эти агенты специфично увеличивают кровяное давление, то есть имеют низкий антидиуретический эффект, чтобы избежать водной интоксикации у пациентов, подверженных длительному лечению. Таким образом, полезно, что он обладает эффектом длительного действия.

Описанный шведский патент (согласно РСТ/SЕ 88/00509, 1987) содержит производные вазотоцина, имеющие специфическую активность повышать кровяное давление.

Производные вазотоцина, согласно настоящему изобретению, отличаются структурой от производных вазотоцина, согласно указанного выше шведского патента, главным образом тем, что они имеют дальнейшую модификацию в позиции 4 структуры вазотоцина, то есть они имеют гомоглутамин или гомоцитруллин в позиции 4.

Предлагаемые новые сосудоактивные производные вазотоцина специфично повышают кровяное давление, то есть они специфичны как сосудосуживающие, имеющие высокий коэффициент кровяного давления к антидиуретической активности.

В частности, антидиуретический эффект (понижение выделения мочи) обусловлен за счет удаления источника молекулы. Кроме того, они имеют значительный пролонгированный эффект в некоторых случаях. Соединения, согласно изобретению, предназначены для использования в фармацевтической композиции для задержки кровотечения и в условиях уменьшения кровяного давления посредством изменения положения тела, так называемой ортостатической гипотензии и так же как общие агенты, повышающие кровяное давление. Производные вазотоцина (VТ), согласно изобретению, имеют формулу:

где Hmp остаток 2-гидрокси-3-меркаптопропионовой кислоты:

Z фенилаланин (Рhe),
Y гомоглутамин (Нgn) или гомоцитруллин (Нсi):

Q H, аланин или L-2-аминомасляная кислота;
n 1, 2 или 3.

Производные VТ, согласно изобретению, могут быть получены методами аналогичными тем, которые известны в области пептидов.

Например, вещества, согласно изобретению, могут быть получены традиционным способом путем последовательного присоединения аминокислот друг к другу в жидкой фазе, как это описано Law, H. B. Du Vigneaud, V. in Journal of the American Chemical Society 82 (1960) 4579 4581, Zhuze, A. L. Jost, K. Kasafi'rek, E. Rudinger, J. in Collection of Czechoslovak Chemical Communications 29 (1964), 2648 2662, and modified by Larsson, L. E. 5 Lindeberg, G. Melin, P. /Pliska, V.in Journal of Medicinal Chemistry 21, (1978), 352 356.

Соединение аминокислот друг с другом образует так называемые пептидные связи, которые также действуют в твердой фазе (обычно, смола) как начальный материал, в котором С-конец первой аминокислоты соединяется, после чего С-конец следующей аминокислоты соединяется с N-концом первой аминокислоты и так далее. В конце концов законченный пептид освобождается от твердой фазы. В нижеуказанных примерах эта так называемая твердая фаза технически используется согласно описания Merrifield, R. В. J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149, Merrifield, R. B. Biochemistry (1964), 3, 1385 and Konig, W. Geiger, R. Chem. Ber. (1970), 103, 788.

Все производные VТ, полученные в примерах, данных ниже, были синтезированы на прикладной биосистеме 430А пептидного синтезатора, с использованием двойной соединительной программы с концевым шагом после второго соединения.

Конечный продукт подвергался анализу. Структура пептида была подтверждена посредством аминокислотного анализа и масс-спектрометрическим методом (FAB МS).

Все аминокислоты, использованные во время синтеза, были L-аминокислоты и они были замещены с третичной-бутоксикарбонильной группой в α-аминофункции. Боковые цепи были замещены как следующие:
Нmp(Mob), Cys(Mob), Dab(Cbz).

Сокращения без скобок:
Cbz карбобензокси;
Mob 4-метоксибензил;
Boc t-бутилоксикарбонил.

Производные аминокислот были получены у Bachem AG, Швейцария.

Дальнейшие сокращения:
Dab L-2,4-диаминомасляная кислота;
Abu L-2-аминомасляная кислота;
Нgn гомоглутамин;
Hci гомоцитруллин
Hmp 2-гидрокси-3-меркаптопропионовая кислота;
OPfp пентафторфениловый эфир
DIPEA диизопропилэтиламин.

Пример 1.

1-Нmp-2-Рhe-4-Нgn-8-Dab-VT
(n 2 и Q H)
Пептид синтезирован на прикладной биосистеме 430А пептидного синтезатора с использованием двойной соединительной программы с концевым шагом после второго соединения. Используемая смола 4-метилбензгидриламинного типа с выходом 0,65 мг-экв/г (Рeninsula Laboratories Inc. USA).

2-гидроокси-меркаптопропионовая кислота [S-(пара-метокси)-бензил] используют для позиции 1.

Конечный продукт синтеза высушивают в вакууме накануне. Пептид отделяют от смолы посредством обработки с жидким фтороводородом в присутствии анизола и этил-метилсульфида как очистителя (НF анизол FMS 10 0,5 0,5). После удаления жидкого фтороводорода выпариванием, смолу суспендируют в этилацетате (100 мл) и отфильтровывают. Твердую часть промывают на фильтре с добавлением этилацетата (3 x 100 мл) и отделенный пептид экстрагируют уксусной кислотой (100 мл). Экстракт сразу разбавляют в объеме 1,5 л 20 уксусной кислоты в метаноле и обрабатывают 0,1 М раствором йода в метаноле до слабого коричневого остатка. Затем добавляют Dowex 1 x 8 ионообменник в ацетатной форме (15 г) (Bio-Rad, Richomond, СА) и смесь профильтровывают. Фильтрат выпаривают и остаток высушивают лиофилизацией. Продукт затем очищают посредством обратнофазной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной Кромасилом® 13μ (EKA Nobel, Surte, Sweden) в соответствующей системе, содержащей ацетонитрил в 0,1 трифторуксуснокислотном водном растворе. Пробы, собранные на колонке, анализируют методом аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРLС) (Spectra Physics Inc. USA 8800) снабженной с Vydac 5 5μ С18 колонка (Vydac Inc. USA).

Чистота (HPLC): 99,5 (18,4 ацетонитрил в 0,1 ТFA, время выдержки 9,13 мин в 1,5 мл/мин, обнаружение в 223 нм). Структура подтверждена аминокислотным анализом и FAB MS (масс-спектрометрическим) анализом.

Пример 2.

I-Hmp-2-Phe-4-Hgn-8-Dab(Ala)-VT
(n 2 и Q Ala)
Окисленный и очищенный нонапептид Нmp-Phe-Ile-Hgn-Asn-Cys-Pro-Dab-Gly-NH₂ (150 мг; приготовлен твердофазным методом аналогично примеру 1) растворен в DVF (2 мл) и добавлен предварительно образованный Boc-Ala-OPfp (4 эквивалента) рН установлен до 8 - 8,5 (DIPEA). Реакционную смесь перемешивают накануне при комнатной температуре. Продукт выделяют путем преципитации с этилацетатом, фильтрации и вакуум высушиванием. Продукт затем обрабатывают с TFA/CH₂Cl₂ 1 1 (20 мл), перемешивают в течение 30 мин, выпаривают и затем обрабатывают диэтилэфиром (100 мл). Преципитат отделяют путем фильтрации и вакуумного высушивания. Продукт очищают путем обратнофазной жидкостной хроматографии.

Чистота (НРLC): 99,8 (17,6 ацетонитрил в 0,1 ТFA, время выдержки 8,56 мин в 2 мл/мин, обнаружение в 223 нм). Структура подтверждена аминокислотным анализом и FAB МS анализом.

Пример 3.

I-Hmp-2-Phe-4-Hgn-8-Dab-(Abu)-VT
(n 2 и Q Abu)
Окисленный и очищенный нонапептид Hmp-Phe-Ile-Hgn-Asn-Cys-Pro-Dab-Gly-NH₂ (100 мг; приготовлен твердофазным методом аналогично примеру 1), растворен в DMF (2 мл) и добавлен предварительно образованный Boc-Abu-POfp (4 эквивалента), рН установлен до 8 - 8,5 (DIPEA). Реакционную смесь перемешивают накануне при комнатной температуре. Продукт выделяют путем преципитации с этилацетатом, фильтрации и вакуумного высушивания.

Продукт затем обрабатывают с TFA/CH₂Cl₂ 1 1 (20 мл), перемешивают в течение 30 мин, выпаривают и затем обрабатывают диэтиловым эфиром (100 мл). Преципитат отделяют путем фильтрации и вакуумного высушивания.

Продукт очищают путем обратнофазной жидкостной хроматографии.

Чистота (НРLC): 99,5 (17,6 ацетонитрил в 0,1 TFA, время выдержки 9,82 мин в 2 мл/мин, обнаружение в 223 нм). Структура подтверждена аминокислотным анализом и FAB МS анализом.

Пример 4.

I-Hmp-2-Phe-4-Hci-8-Dab-VT
(n 2 и Q H)
Пептид синтезирован аналогично примеру 1. 2-гидроксимеркаптопропионовая кислота [S-(пара-метокси)-бензил] использован для позиции 1. Чистота (НРLC): 98,5% (17.6 ацетонитрил в 0,1 TFA, время выдержки 10,68 мин в 2 мл/мин, обнаружение в 223 нм). Структура подтверждена аминокислотным анализом и FAB МS анализом.

Пример 5.

I-Hmp-2-Phe-4-Hci-8-Dab-VT
(n 2 и Q Abu)
Окисленный и очищенный нонапептид Hmp-Phe-Ile-Hgn-Asn-Cys-Pro-Dab-Gly-NH₂ (100 мг; приготовлен твердофазным методом аналогично примеру 1); растворен в DMF (2 мл) и добавлен предварительно образованный Boc-Abu-OPfp (4 эквивалента), рН установлен до 8 - 8,5 (DIPEA). Реакционную смесь перемешивают накануне при комнатной температуре. Продукт выделяют путем преципитации с этилацетатом, фильтрации и вакуумного высушивания.

Продукт затем обрабатывают с TFA/CH₂Cl₂ 1 1 (20 мл), перемешивают в течение 20 мин, выпаривают и затем обрабатывают диэтиловом эфиром (100 мл). Преципитат отделяют путем фильтрации и вакуумного высушивания.

Продукт очищают путем обратнофазной жидкостной хроматографии.

Чистота (НРLС): 99,5 (20,0 ацетонитрил в 0,1 TFA, время выдержки 5,94 мин в 2 мл/мин, обнаружение в 223 нм). Структура подтверждена аминокислотным анализом и FAB МS анализом.

Пример 6.

I-Hmp-4-Hgn-8-Orn-VТ
(n 2 и Q Y)
Пептид синтезирован аналогично примеру 1. 2-гидрокси-меркаптопропионовая кислота [S-(пара-метокси)-бензил] использован для позиции 1. Чистота (НРLС): 98,5 (14,4 ацетонитрил в 0,1 TFA, время выдержки 5,83 мин в 2 мл/мин, обнаружение в 223 нм). Структура подтверждена аминокислотным анализом и FAB МS анализом.

Пример 7.

I-Hpm-4-Hgn-Dab-VT
(n 2 и Q Hz)
Пептид синтезирован аналогично примеру 1. 2-гидрокси-меркаптопропионовая кислота [S-(пара-метокси)-бензил] использован для позиции 1. Чистота (НРLC): 99 (16,0 ацетонитрил в 0,1 TFA, время выдержки 4,98 мин в 2 мл/мин, обнаружение в 223 нм). Структура подтверждена аминокислотным анализом и FAB МS анализом.

Фармакологические исследования.

Производные вазотоцина, согласно изобретению, были использованы для эффективности кровяного давления и антидиуретической активности в так называемом 4-указанном исследовании, то есть активности исследованных веществ, сходных со стандартным препаратом (AVР-аргининвазопрессин) и эффекты двух уровней доз для каждого вещества, были анализиpованы. Кроме того, три прессор-специфических производных VТ согласно нашему предварительному применению SR 8703855-0 были исследованы для сравнения, I-Hmp-2-Phe-8-Orn-VТ (состав 2 таблице), I-Hmp-2-Phe-8-Dab-(Ala)-VT (состав 5 в таблице).

Исследование кровяного давления было проведено на анестезированных Sprague Dawley крысах (около 250 г), предварительно леченных дибенамином (Dekahski, J. 1952, Br. J. Pharmacol 7,567). Максимальное увеличение кровяного давления после внутривенных инъекций пептида было использовано как критерий эффекта, выраженного как интенсивность.

В добавление к потенциальной детерминации, основанной на эффекте интенсивности, был установлен критерий длительности эффекта (индекс персистенции (I. Р), Pliska, V. 1966, Arzheim. Forsch, 16, 886). Этот измеренный фактор является критерием эффектов продолжительности респективного аналога сходного со стандартом AVР.

Антидиуретическая эффективность была определена с помощью анестезированных водными наркотиками Аprague Dawley крыс (200 г) (Larsson L. Е. Lindeberg G. Melin Р. and Pliska V. 1978, J. Med. Chem, 21, 353). Максимальное увеличение выделения мочи после предварительных инъекций было принято как параметр эффекта.

В этих двух исследованиях сравнение было сделано между эффектами респективных производных и эффектом стандартного препарата, АVР и эффективность была определена с помощью 4-указанного теста и указана в международных единицах к микромолям (IU/mmole) (Sturmer, Е. in Handbook of Experimental Pharmacoligy, 1966, Vol. 23, pp.130 189).

Специфичность в отношении кровяного давления определена посредством коэффициента эффективности кровяного давления и антидиуретической эффективности (ВР/AD).

Фармакологические результаты даны в таблице.

Из таблицы следует, что составы, согласно изобретению, проявляют очень высокую активность в отношении увеличения кровяного давления и продолжительности эффекта.

Посредством введения гомоглутамина или гомоцитруллина в положении 4 антидиуретическая активность была практически устранена. Таким образом, настоящее изобретение объединяет прессорную специфичность (отношение кровяного давления к антидиуретической активности), которая была увеличена почти от 2 до 10 раз по сравнению с прессорной специфичностью производных SE 8703855-0 (модификации в положении 1, 2, 8 источника молекулы; см. таблицу).

Комбинация этой модификации с предварительно сделанными замещениями в положении 1, 2 и 8 ведет к аналогам с высокой активностью, удлинению длительности действия и наивысшей прессорной специфичности. Таким образом, базированные на представленных исследованиях на животных новые вещества могут быть использованы для лечения, позволят устранить любой водный накопительный эффект (антидиуретик), а также полностью избежать риска водной интоксикации пациентов.

Назначение: в медицине. Сущность изобретения: Производные вазотоцина (VI) формулы: , где Y - гомоглутамин или гомоцитруллин; X=-NH-CH(CO-)(CH₂)_nNHQ, где n = 1 - 3, Q = Н, аланил или L-2-амино-масляная кислота. Все производные VТ были синтезированы на прикладной биосистеме 430А пептидного синтезатора с использованием двойной соединительной программы с концевым шагом после второго соединения. Структура конечного пептида подтверждена посредством аминокислотного анализа и масс-спектрометрическим методом. 1 табл.

1. Производные вазотоцина следующей формулы:

где Hmp остаток 2-гидрокси-3-меркаптопропионовой кислоты

Z фенилаланин (Phe);
Y гомоглутамин (Hgn) или гомоцитруллин (Hci)

Q H, аланин или L-2-аминомасляная кислота;
n 1,2 или 3. 2. Производное вазотоцина по п. 1, отличающееся тем, что Z Phe, Y Hgn, n 2, Q H. 3. Производное вазотоцина по п. 1, отличающееся тем, что Z Phe, Y Hgn, n 2 и Q аланин. 4. Производное вазотоцина по п. 1, отличающееся тем, что Z Phe, Y Hgn, n 2 и Q L-2-аминомасляная кислота. 5. Производное вазотоцина по п. 1, отличающееся тем, что Z Phe, Y Hci, n 2 и Q H.