ПЕПТИД КАЛИЙ-УРЕТИЧЕСКИЙ Российский патент 2012 года по МПК C07K7/16 A61K38/11 A61P7/10 

Изобретение относится к области физиологии, а именно к терапевтически активным химическим соединениям, влияющим на мочеобразующую деятельность почек, и может быть использовано для получения пептидов, вызывающих селективное увеличение выделения ионов калия почкой, полезных для лечения гиперкалиемии.

Известно, что поддержание постоянной концентрации ионов калия в плазме крови и во внеклеточной жидкости является одним из обязательных условий стабильности работы клеток различных органов и систем, в том числе электровозбудимых клеток, в частности нейронов и клеток сердечной мышцы. Внеклеточная концентрация ионов калия зависит от его общего количества в организме и распределения между внутриклеточным и внеклеточным пространствами организма [1]. Регуляция выделения калия почкой является основным механизмом поддержания баланса ионов калия в организме [2].

Гиперкалиемия - состояние, при котором повышена концентрация ионов калия в плазме крови - более 5,6 ммоль/л [3]. Гиперкалиемия может развиваться в результате нарушения баланса между потреблением и выведением ионов калия из организма или перераспределения этих ионов между внутриклеточным содержимым, где доминирует высокая концентрация ионов калия, и внеклеточной жидкостью, в которой их концентрация близка концентрации в плазме крови, а превалируют ионы натрия.

Причинами повышения уровня калия в плазме крови могут служить:

1) повышенное поступление калия в организм, особенно у пациентов со сниженной функцией почек, когда задержано его выведение из организма;

2) нарушение выведения калия почкой при острой и хронической почечной недостаточности, что наблюдается в клинических условиях при приеме ряда препаратов (калий-сберегающие диуретики, циклоспорин, триметоприм, нестероидные противовоспалительные средства, ингибитор ангиотензинпревращающего фермента) у пациентов при гипоальдостеронизме и псевдогипоальдостеронизме, а также с некоторыми формами врожденной патологии надпочечников;

3) перераспределение калия в организме - выходе ионов калия из внутриклеточного содержимого во внеклеточное пространство, что наблюдается при ацидозе, разрушении клеток (гемолиз, ожоги, синдром длительного сдавления, распад опухолей, массивные гемотрансфузии), приеме ряда препаратов (дигоксин, β-блокаторы, осмотические диуретики) [4-5].

Современные подходы к терапии гиперкалиемии должны учитывать ее степень и причины развития, наблюдается ли она как острое нарушение или служит проявлением хронического процесса. В настоящее время основные способы лечения гиперкалиемии направлены на:

1) ограничение поступления калия в организм (отмена пероральных и парентеральных препаратов калия, а также лекарств, которые усиливают гиперкалиемию);

2) временное перераспределение калия между клетками и внеклеточной жидкостью - перенос калия в клетки (инфузия глюкозы с инсулином, β-адреномиметики и при ацидозе введение бикарбоната натрия);

3) неселективное (совместно с другими ионами) удаление избыточного калия из организма (ионообменные смолы, гемодиализ, перитонеальный диализ, введение петлевых диуретиков).

При использовании вышеперечисленных способов лечения гиперкалиемии может наблюдаться целый ряд нежелательных побочных эффектов. Так, например, при лечении петлевыми диуретиками [6] коррекция гиперкалиемии достигается достаточно медленно, при этом пациенты теряют большое количество ионов натрия и соответственно большой объем внеклеточной жидкости.

Описан ряд соединений, увеличивающих удаление (экскрецию) ионов калия почкой. Например, гипофизарный пептидный гормон аргинин-вазотоцин, AVT (Heller, Н., 1963), 1-дезамино-аргинин-вазотоцин [7]; 1-дезамино-1-монокарбо-аргинин-вазотоцин, 1d-1-mc-AVT [8]; лекарственный диуретик фуросемид, 5-(аминосульфонил)-4-хлор-2-[(2-фуранилметил)]аминобензойная кислота (справочник лекарств РЛС). Эти соединения вызывают усиление экскреции калия почкой, однако при этом усиливается и экскреция почкой ионов натрия и воды, причем повышение экскреции натрия и воды в несколько раз превышает увеличение экскреции калия.

Известны производные вазотоцина [9], имеющие высокий коэффициент кровяного давления к антидиуретической активности и специфичные как сосудорасширяющие. Антидиуретический эффект (понижение выделения мочи) обусловлен за счет удаления источника молекулы. Соединение аминокислот друг с другом образует так называемые пептидные связи, которые также действуют в твердой фазе. Известные производные вазотоцина вызывают усиление экскреции калия почкой, однако при этом усиливается и экскреция почкой ионов натрия и воды, причем повышение экскреции натрия и воды в несколько раз превышает увеличение экскреции калия.

Известен способ поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у млекопитающих [10], основанный на введении синтетического аналога аргенин-вазотоцина. Основной задачей способа была разработка метода поддержания и коррекции водно-электролитного баланса у млекопитающих, позволяющего увеличить реабсорбцию осмотически свободной воды при сохранении баланса калия и натрия и не вызывающего изменений деятельности сердечно-сосудистой системы. Известный способ поддержания и коррекции водно-электролитного состава усиливают экскреции калия почкой, однако при этом усиливается и экскреция почкой ионов натрия и воды, причем повышение экскреции натрия и воды в несколько раз превышает увеличение экскреции калия.

Известен способ [11] поддержания и коррекции водно-электролитического баланса у приматов, также основанный на введении синтетического аналога аргенин-вазотоцина. Однако недостатком применения известных соединений является повышение экскреции почкой ионов натрия и воды, превышающее экскрецию калия в несколько раз.

Известно 1-дезамино-8-аргинин-вазотоцин (1d-AVT), применяемое в качестве средства для увеличения выведения почкой солей натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя [12], наиболее близкое к заявленному изобретению и принятое в качестве прототипа. Известное соединение применяется в качестве средства для увеличения выведения почкой солей натрия и усиления обратного избирательного всасывания из почечных канальцев в кровь воды-растворителя. Средство по заявленной активности превосходит известный аргинин-8-вазотоцин и может быть использовано при гипернатриемии.

Недостатком известного соединения является избирательная экскреция ионов натрия.

Как показывают результаты анализа научной и патентной литературы, на сегодняшний день лекарственных препаратов для селективного выведения ионов калия из организма почками не существует.

Вот почему целесообразна и актуальна разработка средств, которые бы способствовали селективному удалению калия почкой. Данные средства могут быть полезны для лечения гиперкалиемии, достаточно распространенной среди разных возрастных групп населения, опасной болезни.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение пептида, вызывающего селективное увеличение выделения ионов калия почкой.

Указанный технический результат достигается новым калий-уретическим пептидом: 1-дезамино-4-аргинин-8-аргинин-вазотоцин (1-d-Arg-AVT):

Mpr-Tyr-Ile-Arg-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂

Технический результат подтвержден многочисленными экспериментальными исследованиями по синтезу заявляемого пептида и изучению его диуретических свойств, которые проводились на лабораторной и экспериментальной базах Санкт-Петербургского государственного университета и Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН.

Пример 1.

Проверка калий-уретического действия. Эксперименты проведены на самках крыс линии Вистар с массой тела 150-220 г в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными, форма опытов одобрена этическим комитетом ИЭФБ РАН. Пептидные препараты - аргинин-вазотоцин (AVT), 1-дезамино-аргинин-вазотоцин (1d-AVT) и 1-дезамино-4-аргинин-8-аргинин-вазотоцин (1d-4-Arg-AVT) растворяли в 0,9%-м растворе NaCl до концентрации 0,5 нмоль/мл и вводили внутримышечно в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела. Выбор дозы основан на результатах наших исследований влияния на деятельность почки 1d-AVT [12]. Фуросемид в виде 1% раствора вводили внутримышечно в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела. Контролем служили животные из вивария, которым инъецировали 0,9% раствор NaCl в том же объеме. Животных помещали в клетки-пеналы с проволочным дном, через отверстия которого моча стекала по воронке в пробирку. Выделение мочи регистрировали в течение 4 ч при спонтанном мочеотделении, измеряли объем мочи, концентрацию в ней Na⁺, K⁺ и осмоляльность. Кровь брали по окончании экспериментов из сонной артерии под эфирным наркозом.

Осмоляльность сыворотки крови и мочи определяли криоскопическим методом на микроосмометре 3300 (Advanced Instruments, Inc., США). Исследование концентрации Na⁺, K⁺ в сыворотке крови и в моче проводили на пламенном фотометре Corning-410 (Великобритания) в воздушно-пропановом пламени.

Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 6,0. Все данные представлены в виде M±m. Значимость межгрупповых различий оценивали по тесту ANOVA и критерию Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений (при p<0,05).

Результаты. Введение крысам заявляемого соединения - 1d-4-Arg-AVT - в дозе 0.05 нмоль на 100 г массы тела вызывает усиление экскреции ионов калия, не оказывая влияния на мочеотделение, выведение ионов натрия и осмотически свободной воды (таблица 1). В то же время вазотоцин (AVT, гормон большинства позвоночных животных за исключением млекопитающих) и его аналог 1dAVT в той же дозе усиливают экскрецию как натрия, так и калия. При действии AVT, 1d-AVT, а также петлевого диуретика фуросемида почка экскретирует в несколько раз больше ионов натрия, чем калия. Таким образом, влияние известных на настоящий момент веществ, усиливающих выделение калия, имеет неспецифический характер - клетки почки усиливают выведение различных ионов и воды. В случае петлевых диуретиков это обусловлено блокадой котранспортера Na, K, 2Cl в люминальной мембране клеток толстого восходящего отдела петли Генле.

Действие заявляемого соединения 1d-4-Arg-AVT высоко селективно - пептид вызывает увеличение экскреции калия в 3.2 раза по сравнению с контролем, при этом после его инъекции достоверно не меняется ни диурез, ни экскреция натрия (таблица 1). Это соединение является единственным веществом среди исследованных пептидов, после инъекции которого K/Na отношение превышает 1, т.е. почкой выводится больше калия, чем натрия (таблица 1). Известный гормон альдостерон при инъекции нормальным здоровым животным не влияет на исходный уровень экскреции калия почкой, он усиливает экскрецию калия и уменьшает выделение натрия у животных и человека при снижении секреции этого гормона корой надпочечника. Следует подчеркнуть, что 1d-4-Arg-AVT не только селективно усиливает выделение калия почкой, но этот эффект проявляется в очень малых дозах и он проявляется быстро после его инъекции.

Таблица 1 Влияние пептидов на выведение ионов калия и натрия почкой крысы Условия опыта V^2ч, мл U_OsmV^2ч, мкОсм U_NaV^2ч, мкмоль U_KV^2ч, мкмоль C_H2O ^2ч, мл K/Na 1d-4-Arg-AVT 0.20±0.02 246±27 35±6 57±9* -0.63±0.07 1.63 1d-AVT 1.14±0.07* 1022±30* 336±10* 122±8* -2.29±0.08* 0.36 AVT 0.53±0.07* 512±55* 110±16* 59±6* -1.19±0.12* 0.54 1d-1-mc-AVT 0.75±0.15* 632±122* 183±37* 27±6* -1.40±0.30* 0.15 Фуросемид 3.35±0.19* 1069±52* 385±24* 83±3* -0.24±0.05 0.22 Контроль 0.22±0.03 214±16 26±3 18±3 -0.50±0.05   Примечание: Приведены показатели выведения за 2 ч эксперимента на 100 г массы тела: мочи (V^2ч), осмотически активных веществ (U_OsmV²⁴), натрия (U_NaV^2ч), калия (U_KV^2ч) и осмотически свободной воды (C_H2O ^2ч); K/Na - соотношение экскреции калия к экскреции натрия почкой. * - значимость различий по сравнению с контролем (p<0.05).

Пример 2.

Синтез Mpr-Tyr-Ile-Arg-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂ (1d-4-Arg-AVT)

1d-4-Arg-AVT был синтезирован твердофазным методом с использованием Fmoc-/tBu-стратегии на 2-хлор-тритиламинной смоле. Для защиты сульфгидрильной группы цистеина и β-меркаптопропионовой кислоты использовался ацетамидометильный (Acm-) остаток. Были использованы следующие производные аминокислот: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(HCl)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH и S-Acm-β-меркаптопропионовая кислота. Первая аминокислота (Fmoc-Gly-OH) была присоединена к полимеру с помощью диизопропилкарбодиимида в присутствии N-оксибензотриазола в диметилформамиде. Удаление Fmoc-защитных групп в ходе наращивания пептидной цепи проводили 20% раствором пиперидина в диметилформамиде. Конденсация аминокислот проводилась диизопропилкарбодиимидом в присутствии N-оксибензотриазола. На каждой стадии конденсации использовался 2-кратный избыток присоединяемой Fmoc-аминокислоты, полнота прохождения реакции контролировалась с помощью нингидрина (Кайзер-тест). После полной сборки пептидной цепи комплекс пептид-полимер обрабатывали смесью трифторуксусная кислота-триизопропилсилан-этандитиол-вода (92.5/2.5/2.5/2.5, об.%). Полимер отфильтровывали, промывали на фильтре трифторуксусной кислотой, к объединенным фильтратам добавляли сухой эфир. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали сухим эфиром, сушили.

Полученный продукт растворяли в 80% водной уксусной кислоте и обрабатывали насыщенным раствором йода в 80% уксусной кислоте (10-кратный молярный избыток йода). Раствор упаривали до ~¼ первоначального объема, к остатку добавляли воду и снова упаривали. Остаток после повторного упаривания замораживали и подвергали лиофильной сушке. Полученный лиофилизат растворяли и подвергали очистке с помощью обращеннофазной ВЭЖХ. После хроматографической очистки получен целевой пептид с чистотой выше 98%. Для подтверждения структуры полученного соединения был проведен аминокислотный анализ (таблица 2) и определен молекулярный вес с помощью масс-спектрометрии (MALDI-TOF). Пик молекулярного иона в масс-спектре MALDI-TOF соответствовал массе 1064.4945 (теоретически 1064.26). Выход в расчете на Fmoc-Gly-OH составлял в разных опытах 70-75%.

Таблица 2 Результаты аминокислотного анализа Аминокислота Вычислено Найдено Тирозин 1 0.98 Изолейцин 1 1.10 Аргинин 2 2.00 Аспарагиновая кислота 1 1.04 Цистеин 1 0.95 Пролин 1 1.02 Глицин 1 1.00

Как показывают результаты проведенных исследований, заявленным изобретением достигается технический результат получением пептида, вызывающего селективное увеличение выделения ионов калия почкой, полезных для лечения гиперкалиемии.

Список использованной литературы

1. Rosa R.M., Epstein F.H. Extrarenal potassium metabolism. In: Alpern R.J. and Hebert S.C. eds. The Kidney. Physiology and pathophysiology, 4^th Edition. Amsterdam, Elsevier, 2008, p.1277-1300.

2. Malnic G., Muto S., Giebisch G. Regulation of potassium excretion. In: Alpern R.J. and Hebert S.C. eds. The Kidney. Physiology and pathophysiology, 4^th Edition. Amsterdam, Elsevier, 2008, p.1301-1348.

3. Наточин Ю.В., Мухин H.A. Введение в нефрологию. СПб., «ГЭОТАР-Медиа», 2007, 152 с.

4. Наточин Ю.В. Почка. Справочник врача. СПб., изд-во СПбГУ, 1997, 208 с.

5. Кутина А.В., Кузнецова А.А., Наточин Ю.В. Катионы в сыворотке крови человека. Усп. физиол. наук. 2005. Т.36. №3. С.3-32.

6. Lehnhardt A., Kemper M.J. Pathogenesis, diagnosis and management of hyperkalemia. Pediatr. Nephrol. 2010. DOI 10.1007/s00467-010-1699-3.

7. Heller, H. 1963. Neurohypophyseal hormones. In J.Euler and H.Heller (eds.), Comparative Endocrinology, vol.1, pp.26-72. Academic Press, New York.

8. Канашкина Т.А., Шахматова Е.И., Наточин Ю.В. Влияние 1-дезамино-1-монокарбо-аргинин-вазотоцина на выделение ионов натрия и воды почками крыс. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2007, т.143, №5, с.494-496.

9. Патент РФ №2067586 (Заявка РСТ: SE 91/00154).

10. Патент РФ №2342100.

11. Патент РФ №2342101.

12. Патент РФ №2342949 (прототип).

Изобретение относится к терапевтически активным химическим соединениям, влияющим на мочеобразующую деятельность почек, а именно к пептиду, вызывающему селективное увеличение выделения ионов калия почкой. Соединение предназначено для лечения гиперкалиемии. 2 табл., 2 пр.

Соединение формулы
Mpr-Tyr-Ile-Arg-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂,
обладающее селективным калий-уретическим действием.