КОНТЕЙНЕР ДЛЯ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ЯЙЦЕКЛЕТОК Российский патент 1996 года по МПК A61H1/00 

Изобретение относится к контейнеру для оплодотворения яйцеклеток человека.

Оплодотворение "ин витро" яйцеклеток человека является очень сложным методом, который позволил решить проблему в случаях бесплодия, которое было до настоящего времени необратимым. С первого рождения в 1978 г. Луиса Брауна, проведенного группой Эдвардса из Англии, тысячи детей были рождены во всем мире с использованием этого метода.

Главной основой при работе группы оплодотворения "ин витро" было всегда как упрощение методики, так и применяемых устройств при сохранении или улучшении результатов. Именно на этой основе в клинической практике появились:
стимуляция с целью получения нескольких яйцеклеток и увеличения таким образом шансов на успех,
другие варианты пункции, отличные от пункции под контролем эндоскопии брюшной полости, в частности под эхографическим трансвезикальным контролем, затем трансвагинальным контролем и, наконец, трансуретральным контролем, которые позволяют обойтись без общей анестезии и избежать возможной токсикации СO₂. В плане биологическом замораживание сверхкомплектных эмбрионов позволило улучшить результаты. Лишь сам этап биологического оплодотворения подвергался весьма незначительным модификациям.

Этот биологический этап до сегодняшнего дня остается очень сложным. Классически он соответствовал аэробной и стерильной культуре эмбрионов в коробке или трубке при 37^oC и при содержании СO₂ в 5% Это требует наличия коробок и трубок с отсутствием герметичности при риске отравления окружающей средой. Отсюда следует необходимость иметь термостат с СO₂ или инкубатор (разработка фирмы "Тестар"), обеспечивающих строгое соблюдение режима по температуре в 37^oС и по содержанию СO₂. Это оборудование является сложным и дорогостоящим.

Кроме того, первоначально после пункции обеспечивали фазу созревания яйцеклеток от 1 до 4 ч в среде комплементированной культуры, чаще всего в человеческой сыворотке, а после этого срока оплодотворение яйцеклеток после смены среды; через 18 24 ч выполнялось обнажение зародышей. (Это обнажение соответствует механическому снятию кумулюсных клеток, окружающих зародыш с целью оценки стадии развития). Зародыш переносился в новую среду, которая через 20-24 ч после этого была вновь сменена перед помещением его в маточную полость, что соответствовало использованию более 3 мл среды культуры зародышем и многочисленным последовательным манипуляциям в течение 48 ч, что могло создать токсикацию для этих зародышей.

Из публикации Ж. Салат-Бару и др. Оплодотворение в пробирке, 1982, с. 2681-2685, известен контейнер для оплодотворения яйцеклеток, содержащий пробирку для размещения в ней культурной среды и винтовую пробку.

Целью изобретения является создание контейнера для оплодотворения яйцеклеток, содержащего пробирку с содержимым в виде культурной среды, мембрану, обеспечивающую предоперационную стерильность среды, и пробку, предназначенную для замены мембраны после разрыва последней.

Хотя культурная среда представляет собой текучую среду, она является составной частью используемой трубки, как только мембрана будет противодействовать изменению количества жидкости и ее состояния от изготовления до использования.

На фиг. 1 показана модель контейнера для оплодотворения яйцеклеток; на фиг.2 закрепляющее устройство для удержания трубки в вагинальной полости.

Это цилиндрическая трубка небольших размеров с гладкими и закругленными стенками (1) с целью избежания травм вагинальной слизистой оболочки. Размеры составляют приблизительно 4 см длины при внешнем диаметре в 1,5 см; толщина стенок составляет 2 мм на корпусе цилиндра (2), за исключением уровня горловины, где она составляет не более 1 мм (3), что обеспечивает внутреннюю полость в 1,1 см диаметром на длине 3,8 см с полезным объемом приблизительно в 3,2 см³. Этот объем соответствует культуре в 4-5 эмбрионов. Для числа эмбрионов, превышающего 5, используемый объем среды может быть увеличен до 5 см³, тогда внешние размеры составляют 4,5 см длины при внешнем диаметре 1,7 см, а толщина стенок остается неизменной. Могут быть рассмотрены также и другие формы (кроме цилиндрической): грушевидная, круглая или изогнутая форма в зависимости от вагинальной формы.

На внешней стенке корпуса трубки должна быть предусмотрена поверхность для записи фамилии пациентки. Такая же запись на внешней стенке пробки ограничивает ошибки асептии.

Вследствие уменьшения толщины стенки горловины внешний край завинченной пробки не выступает за стенку трубки.

Глухой конец трубки скруглен (5).

Верхний конец, связанный с горловиной, является плоским (6) и имеет в центре круглое отверстие диаметром приблизительно 4 мм (7). Именно через это отверстие вводятся яйцеклетки и необходимые для оплодотворения сперматозоиды. Размеры отверстия сознательно занижены по отношению к диаметру трубки с целью ограничения обменов среды культуры с окружающим воздухом и, следовательно, минимизации возмущений.

Для еще большего уменьшения септических рисков, возмущений среды и снижения времени манипуляций представляется полезным разработать контейнеры, в которых среда культуры помещается в трубку с момента ее изготовления (8).

Для избежания биохимических возмущений среды или отравлений в течение срока, разделяющего приготовление и использование, реализуется герметичное закрытие трубки тонкой мембраной (9), перекрывающей отверстие. Эта мембрана изготавливается таким образом, чтобы она могла быть легко разорвана в момент помещения яйцеклеток и сперматозоидов в трубку с помощью "пипетки Пастера" из стекла или наконечника пипетки из стекла, или наконечника пипетки из пластмассы одноразового пользования. Могут быть использованы и другие примеры герметизации, например применение системы, снабженной клапаном.

Средой культуры может быть одна из классически применяемых и имеющихся в продаже. В данном случае используется среда "I.N.R.A. de Menezo", известная на рынке под названием "В2" фирмы "А.Р.I. Systeme". Между поверхностью среды и мембраной сохраняется лишь малый газовый объем приблизительно в 200 мкл (10), который соответствует объему переносных яйцеклеток и сперматозоидов.

Внутренние стенки трубки должны быть совершенно гладкими и скругленными (11) с целью предотвращения прилипания яйцеклеток при отборе для их переноса в маточную полость.

Пробка (12) высотой 1 см и диаметром 1,5 см завинчивается на горловину трубки для закрытия отверстия. После разрыва мембраны необходимо, тем не менее, обеспечить надежную герметичность трубки для предотвращения возмущений среды и возможных загрязнений при ее помещении в вагинальную полость. Эта герметичность обеспечивается двумя прокладками, одна из которых корончатого типа зажимает горловину трубку (13) толщиной приблизительно 1 мм; другая, плоская и круглая (14), покрывающая днище пробки, с идентичной толщиной. Для дополнительного обеспечения герметичности днище пробки имеет в середине выпуклость (15), диаметр которой равен диаметру отверстия, что позволяет в процессе завинчивания пробки прижать прокладку к отверстию трубки.

Внешняя стенка пробки имеет скругленные края (16).

Применяемым для реализации материалом является жесткая пластмасса, имеющая большую механическую прочность (но без травматизма), типа полипропилена, не являющегося токсичным для клеточных культур.

Стерильные трубка и среда упаковываются индивидуально в стерильную упаковку типа целлофанированной бумаги, в процессе упаковки пробка полностью не завинчивается с целью избежания разрыва мембраны. Закрепляющее устройство, обеспечивающее удержание трубки в вагинальной полости, показано на фиг. 2. Это устройство состоит из гибкого кольца, в составе которого входит металлическая пластина (17), на которую нанесена резиновая оболочка (18), к которой крепится небольшой резиновый карманчик (19) размера трубки, который позволяет поместить ее туда. Диаметр этого кольца будет определен, как для диафрагмы, для каждой пациентки в зависимости от размера ее маточной полости и шейки матки во время консультации перед оплодотворением "ин витро". Это устройство позволяет удержать трубку в задней части вагинальной сумки без риска для пациентки потерять ее или переохладить среду культуры в связи со слишком близким расположением по отношению к отверстию влагалища.

Мероприятия, которые позволили предложить это устройство, базируются на результатах наблюдений и исследовательских работах. Первый из этих результатов, наблюдаемый на протяжении 6 месяцев, состоит в том, что часть среды, сохраняемая в стерильной герметически закрытой трубке, по возможности без доступа воздуха, позволяет сохранять ее более 10 дней без возмущений и без того, чтобы ее использование изменило бы классически полученные результаты. Второй результат базируется на исследованиях оплодотворения 3 яйцеклеток, помещенных в одну и ту же опытную емкость, т.е. в 1 мл среды: он показывает получение процента расслоения, идентичного классически получаемому процентному соотношению, когда культивируется одна яйцеклетка на каждый опыт. Фактом является также то обстоятельство, что если одна яйцеклетка остается в одном и том же опытном объеме в течение 48 ч, необходимых для оплодотворения, яйцеклетка не взаимодействует ни с чем на этой стадии своего развития.

Наконец, многочисленные исследования, выполненные фирмой "Menezo", показали минимальные изменения среды культуры перед и после оплодотворения.

Комплекс этих результатов привел к выполнению предварительных исследований, которые обеспечили прогресс, несмотря на то, что число пациенток, число яйцеклеток и соответствующих зародышей было малым, причем первоначальные результаты были весьма обнадеживающими.

Первое исследование было реализовано на 8 пациентках, а число яйцеклеток превышало 4 на пункцию. Приблизительно половина полученных зародышей культивировалась классическим образом, а другая половина в герметично закрытой трубке в течение 48 ч в термостате. Не было отмечено какой-либо разницы по степени расслоения. Две пациентки забеременели, что соответствует классически полученному проценту успеха.

Вторая серия из 8 пациенток имела 4 яйцеклетки на пункцию, из которых половина культивировалась классическим образом, а другая половина внутриматочным введением трубки, содержащей зародыши. Здесь еще процент расслоения оставался эквивалентным и даже немного превосходил метод интравагинальной культуры. 5 из этих пациенток забеременели.

Источники информации
1) Менезо Й. Синтетическая среда для сохранения и созревания гамет и для культуры оплодотворенного яйца. (1976). Отчет парижской академии наук, т. 282, серия Д (1967-1970).

2) Менезо Й. Среда культуры для искусственного оплодотворения, 1985, 43, 27-31.

3) Менезо Й. Тестарт Ж. Перрон Д. Сыворотка не нужна для искусственного оплодотворения человека, ранней эмбрионной культуры и переноса. (1984). Рождаемость и стерилизация, т. 42, N 5, 750-755.

4) Плашо М. Мандельбаум Ж. Юнка А.М. Акросомная реакция спермы человека и ее использование при искусственном оплодотворении в пробирке. (1984). Рождаемость и стерилизация, т. 42, N 3, 418-423.

5) Салат-Бару Ж. и др. Оплодотворение в пробирке. (1982). Новая медицинская пресса, 11, 36, 2681-2685.

6) Жак Тестарт. Внешнее оплодотворение человеческого яйца. (1982). Исследование N 130, т. 13, 144-156.

7) Патент США N 4380997.

Область применения: изобретение относится к области медицины, а именно к устройствам для оплодотворения яйцеклеток человека. Сущность изобретения: контейнер для оплодотворения яйцеклеток содержит пробирку 1 для размещения в ней культурной среды и винтовую пробку 12, при этом контейнер снабжен мембраной 9, установленной над входным отверстием в пробирку 1, а пробка 12 имеет герметичную прокладку 14, размещенную с внутренней стороны на донной ее части. Кроме того, культурная среда расположена в пробирке 1 с сохранением воздушного объема. 6 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Контейнер для оплодотворения яйцеклеток, содержащий цилиндрическую пробирку для размещения в ней культурной среды и винтовую пробку, отличающийся тем, что, с целью обеспечения стерильности среды, он снабжен мембраной, установленной над входным отверстием в пробирку, а пробка имеет герметичную прокладку, размещенную с внутренней стороны на донной ее части, при этом культурная среда расположена в пробирке с сохранением воздушного объема. 2. Контейнер по п.1, отличающийся тем, что воздушный объем составляет 200 мкл. 3. Контейнер по п.1, отличающийся тем, что пробирка имеет длину 4 5 см, наружный диаметр 1,5 1,7 см, а ее внутренний объем составляет 3,2 5,0 см³. 4. Контейнер по п. 1, отличающийся тем, что он имеет дополнительную герметизирующую прокладку, размещенную с наружной стороны пробирки по ее периметру и выполненную с возможностью взаимодействия с торцевой поверхностью крышки. 5. Контейнер по п.1, отличающийся тем, что наружные диаметры дополнительной герметизирующей прокладки и пробки соответствуют наружному диаметру пробирки. 6. Контейнер по п.1, отличающийся тем, что прокладка на пробке имеет в своей центральной части выпуклую поверхность, диаметр которой равен диаметру входного отверстия в пробирку. 7. Контейнер по п.1, отличающийся тем, что культурная среда представляет собой среду B₂ Менезо.