СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК A61B17/435 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано в программах ЭКО и ПЭ с целью повышения их результативности.

Успехи современной науки и практики позволили существенно повысить эффективность лечения бесплодия. Наиболее перспективным методом лечения тяжелых форм бесплодия следует признать экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов в полость матки (В.И.Кулаков, Б.В.Леонов, 1998).

Частота наступления беременности, по данным разных центров ЭКО, находится в пределах 20-40% (В.И.Грищенко, М.П.Петрушко, В.И.Пиняев, 2000). Этот показатель зависит от многих факторов: причины бесплодия, применяемые схемы индукции суперовуляции, показатель спермограммы и др.

Проблема повышения эффективности экстракорпорального оплодотворения остается актуальной и в настоящее время и решается в разных направлениях: развиваются новые и совершенствуются имеющиеся микротехнологические процессы, изменяются методы культивирования, модифицируются протоколы подготовки к ЭКО и др. По данным большинства исследователей одним из путей улучшения результативности программ ЭКО является выбор оптимального количества и качества переносимых эмбрионов. Вопрос отбора клеток, используемых для переноса эмбрионов по количественному и качественному составу, остается самым дискуссионным. Улучшение результативности ЭКО во многом связано не только с качеством эмбрионов, но и с маточными структурами, в частности с состоянием эндометрия, его зрелостью и готовностью к имплантации (М.А.Репина с соавт., 1999).

Т. е. , оптимальный отбор ооцитов для последующего культивирования, качественный отбор переносимых эмбрионов в сочетании с благоприятными процессами созревания структур эндометрия, оптимизацией подготовки "окна имплантации" представляются важными для конечного результата ЭКО.

Известен способ индукции овуляции (заявка 95104452/14, ОБ, 1997.01.20.). Сущность способа в том, что индуктор овуляции вводят интраовариально, снижая неблагоприятное воздействие на эмбрион и эндометрий. Однако, данный способ специфичен (применим при поликистозных яичниках) и достаточно сложен.

Известен способ оплодотворения спонтанного цикла ин витро (заявка 9300517/14, публикация 1996 г.), предусматривающий введение закрытого контейнера с ооцитами, содержащимися в культуральной среде, в полость матки. Недостатком данного способа является также его техническая сложность.

Известен способ повышения приживляемости эмбрионов у овцематок (заявка 97110374/13, ОБ, 1999.01.27.) путем введения прогестерона, обеспечивающего оптимальную внутриматочную среду для трансплантации эмбрионов. Однако данная методика не апробирована на людях.

Прототипом предлагаемого нами способа избран способ проведения ЭКО, описанный в автореферате дисс. к.м.н. К.А.Яворовской, 1993 г.

Сущность способа состоит в том, что предварительно проводят коррекцию состояния репродуктивной системы аналогом гонадолиберина - препаратом "Декапептил" (Фирма "Феринг", Germany). Начиная со 2-го дня менструального цикла, препарат вводят первые 7 дней по 500 мг ежедневно подкожно в область пупка, последующие дни - по 100 мг ежедневно до введения хорионического гонадотропина. Десенситизацию репродуктивной системы декапептилом проводят с целью подготовки к индукции овуляции ЧМГ.

Каждый 3 день осуществляют контроль ЛГ, ФСГ и эстрадиола в крови. Дополнительно проводят эндокринную коррекцию при выявлении отклонений в уровне пролактина, СТГ, гормонов коры надпочечников и щитовидной железы.

Данный способ обладает рядом несовершенств:
1. способ не учитывает морфофункциональную асимметрию женской репродуктивной системы, а именно неравнозначность ответа яичников на стимуляцию овуляции или суперовуляции;
2. способ требует использования дополнительных дорогостоящих препаратов;
3. избыточная стимуляция суперовуляции вызывает нарушение секреторной трансформации эндометрия, что снижает процент положительных результатов ЭКО.

Указанные недостатки могут быть устранены в заявляемом изобретении.

Задача изобретения: разработка простого и эффективного способа проведения ЭКО, обеспечивающего оптимальный отбор преовуляторных ооцитов для дальнейшего культивирования и качественную оценку переносимых эмбрионов в полость матки с учетом морфофункциональных асимметрий женской репродуктивной системы.

Поставленная задача решается тем, что вне зависимости от проводимой индукции суперовуляции у больной в момент проведения пункции фолликулов производят раздельную аспирацию преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости из правого и левого яичников, определяют количество ооцитов и активность протеолитических ферментов (кислых пептид-гидролаз) в фолликулярной жидкости. Доминантным считают яичник, активность пептид-гидролаз, в фолликулярной жидкости которого на 20 мг/мл за 1 час и более превышает соответствующий показатель другого яичника. Отбор наиболее качественных ооцитов для дальнейшего культивирования и выбор переносимых эмбрионов определяют с учетом доминантности яичника, перенос эмбрионов в полость матки осуществляют на сторону эндометрия, ипсилатеральную доминантному яичнику.

Предпосылками для выбора данной совокупности отличительных признаков послужило следующее. Учитывая новые данные о важной роли морфофункциональных асимметрий женского организма в генезе бесплодия (В.И.Орлов, 1996, А.В.Кузьмин, 1997), факт парности периферических звеньев женской репродуктивной системы, неоднозначную ответную реакцию яичников на стимуляцию суперовуляции, мы посчитали целесообразным выяснение возможности существования различий морфологии и функции яичников и стороны эндометрия в зависимости от стороны их расположения.

В результате проведенных исследований нами выявлено существенное преобладание функциональной активности одного из яичников как у здоровых женщин, так и у бесплодных больных, методом лечения которых явилось ЭКО и ПЭ. Удивительным оказался тот факт, что аналогичная закономерность в функционировании яичников была отмечена при стимуляции суперовуляции с использованием различных схем.

Функциональную активность яичников оценивали по количеству лидирующих фолликулов и по количеству яйцеклеток, полученных в момент пункции.

Преобладание функциональной активности правого яичника у обследуемых женщин нами было выявлено у 148 из 184 больных (80%), левого яичника - у 29 больных (15,8%) и только у 7 больных (4,2%) была отмечена равномерная ответная реакция обоих яичников на стимуляцию.

В фолликулярной жидкости, полученной из правого и левого яичников, мы определяли активность протеолитических ферментов.

Выбор этой группы ферментов обусловлен их чрезвычайно важной ролью (особенно ограниченного протеолиза) в регуляции различных этапов репродуктивного процесса. Имеются единичные работы, в которых показано участие пептид-гидролаз в разрушении фолликулярной стенки, разрыве фолликула, а также в других уровнях регуляции менструального цикла (В.Ф.Нагорная, 1990).

Данных об исследовании активности протеолитических ферментов (кислых пептид-гидролаз) в фолликулярной жидкости по нарастанию кислоторастворимых Фолинположительных соединений в доступной литературе мы не обнаружили.

Результаты исследования пептид-гидролаз свидетельствуют о том, что у пациенток с преобладанием функциональной активности правого яичника (праводоминантные) в фолликулярной жидкости, аспирированной из правого яичника, активность пептид-гидролаз составила в среднем 106,2±6,4 мг/мл за 1 час, в фолликулярной жидкости левого яичника - 46,7±3,1 мг/мл/час. У пациенток с леводоминантным яичником активность пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости правого яичника была, напротив, в 1.5 раза ниже аналогичных величин в жидкости, взятой из фолликулов левого яичника (77,3±4,3 мг/мл/час) и составила 52,6±4,8 мг/мл/час.

В фолликулярной жидкости пациенток без выраженного доминирования одного из яичников (амбилатеральные) средняя активность пептид-гидролаз не зависела от стороны ее аспирации (43,0±3,8 мг/мл/час и 43,5±3,4 мг/мл/час), хотя у отдельных пациенток наблюдалась тенденция к увеличению протеолитических ферментов в фолликулах правого или левого яичников.

Полученные нами данные выявили четкую зависимость между ферментативной активностью фолликулярной жидкости и доминированием одного из яичников. Очевидно, это связано с обеспечением наиболее благоприятных условий для развития ооцитов доминантного яичника в связи с важной ролью пептид-гидролаз в обновлении тканевых белков, а также участием в процессах фолликулогенеза.

Сопоставительный анализ результатов биохимических исследований с визуальной оценкой яйцеклеток, аспирированных из доминантного яичника, свидетельствует о большей информативности вышеописанной методики в оценке качества ооцитов и обоснованности отбора полноценных яйцеклеток (созревших в оптимальной метаболической среде) для дальнейшего культивирования и подготовки к возможной криоконсервации.

Не менее важной задачей, наряду с изучением фолликулярной жидкости, на наш взгляд, явилось изучение степени готовности эндометрия к приему плодного яйца в зависимости от стороны расположения доминантного фолликула (в спонтанных циклах) и доминантного яичника (в стимулированных циклах). Доминантность эндометрия правой и левой половин матки оценивалась по результатам гистохимического анализа 42 ленточных соскобов эндометрия, полученных у 21 женщины спустя 3 дня после овуляции.

У 17 из 21 обследуемой (81%) при правостороннем расположении доминантного фолликула секреторная трансформация эпителия и стромы была более выраженной на правой половине матки, в то время как на левой половине матки циклические изменения, как бы, "запаздывали" на 1-3 дня.

Аналогичная закономерность была прослежена у 3 (14%) обследуемых с доминированием левого яичника и левой половины матки. У 1 пациентки (5%) при доминировании левого яичника выявлена равномерная готовность эндометрия к восприятию плодного яйца на правой и левой половинах матки.

Закономерность доминирования одного из яичников и соответствующей половины матки сохранялась и при стимуляции суперовуляции.

При гистохимическом анализе соскобов эндометрия в слизистой диагностированы разные стадии фазы секреции, но во всех случаях выявлено достаточно четкое отличие в строении слизистой правой и левой стенок матки.

Гистохимические изменения эндометрия на стороне расположения доминантного фолликула или доминантного яичника и на противоположной стороне матки имели следующие различия: на домининатной половине матки слизистая по строению соответствовала 18 дню нормального цикла, в то время как на противоположной половине матки циклические изменения, как бы, "запаздывали" на 1-3 дня и соответствовали 15-16 дню цикла.

В части наблюдений в эндометрии на стороне расположения доминантного фолликула отмечалась поздняя стадия фазы секреции (24-25 день цикла), а с противоположной стороны - средняя (22-23 день). У 1 пациентки спустя 3 дня после овуляции отмечена средняя фаза секреции с доминантной стороны и ранняя фаза секреции - с противоположной.

Т. о. , на основании проведенных исследований выявлены определенные функциональные закономерности, свидетельствующие о существовании тесных связей между правым яичником и эндометрием правой половины матки, а также между левым яичником и эндометрием левой половины матки, но с существенными различиями по частоте встречаемости.

Немаловажное значение имеет тот факт, что еще на стадии формирования доминантного фолликула кровоснабжение яичника и соответствующей ипсилатеральной половины матки существенно выше по сравнению с соответствующими структурами. Эти данные позволяют еще на стадии роста доминантного фолликула прогнозировать сторону имплантации (плацентации) эмбриона и, тем самым, повысить эффективность программы ЭКО.

Пример 1.

Больная Р-а, история болезни 698/563 поступила в Центр реподукции человека с целью проведения ей программы ЭКО и ПЭ. Больная предъявляет жалобы на бесплодие-2 в течение 1 года. Из анамнеза известно, что больная в 1997 г. перенесла правостороннюю тубэктомию по поводу правосторонней трубной беременности, в 1998 г. левостороннюю тубэктомию по поводу левосторонней трубной беременности, 3 попытки ЭКО и ПЭ в 1999 г. без эффекта.

На этапе обследования перед программой ЭКО выявлен уреаплазмоз, проведено противовоспалительное лечение (с эффектом).

Стимуляция суперовуляции проводят со 2-3 дня менструального цикла с использованием индукторов суперовуляции по протоколу кломифенцитрат по 100 мг в день - (5 дней) и человеческий менопаузальный гонадотропин (Хумегон) по 2-4 ампулы в день (доза вводимого препарата определяют индивидуально в зависимости от реакции пациентки, контролируемой ежедневным, начиная с 5-6 дня стимуляции, ультразвуковым и гормональными исследованиями). При УЗ-исследовании определяют динамику диаметра лидирующего фолликула или когорты фолликулов и толщину эндометрия в соответствии с протоколом.

У данной больной было зарегистрировано на момент проведения пункции 3 лидирующих фолликула в левом яичнике и 5 - в правом. Толщина эндометрия составила 11,2 мм.

По достижении зрелости фолликулами (на основании данных ультразвукового и гормонального мониторинга) пациенткам назначают овуляторную дозу ХГ ("Прегнил", "Профази") в количестве 5000-10000 ЕД. Момент назначения ХГ определяют в зависимости от срока достижения лидирующим фолликулом диаметра не менее 18 мм или 2-3 фолликулами - не менее 17 мм.

Аспирацию ооцитов и фолликулярной жидкости производят через 36 часов после введения овуляторной дозы ХГ раздельно из правого и левого яичника. С целью получения ооцитов из фолликулов яичников и фолликулярной жидкости производят трансвагинальную пункцию с помощью влагалищного пункционного датчика с частотой 5 MHz ультразвукового аппарата Aloka SSD-500.

При пункции фолликулов из левого яичника было получен 1 ооцит, из правого яичника - 4.

Полученные преовуляторные ооциты из правого и левого яичников культивируют в специальных термостатах при температуре 37^oC при смеси 5% СO₂ в воздухе в питательной среде Менезо В2.

В фолликулярной жидкости, аспирированной из левого и правого яичников, определили активность протеолитических ферментов.

Фолликулярную жидкость наливают в 2 пробирки по 1 мл (контрольную и опытную) и в них добавляют по 0,5 мл 1% раствора лиофилизированного коммерческого гемоглобина, приготовленного на ацетатном буфере (0,2 М СН₃COONA и 0,2 М СН₃СООН), рН 4,2. После этого в контрольную пробу приливают 1,5 мл 10% раствора ТХУ, а опытную помещают в термостат при температуре 37^oС на 1 час и по окончании инкубации прибавляют 1,5 мл 10% ТХУ. Затем пробы центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. По 1.5 мл центрифугата переносят в опытную и контрольную пробирки, куда добавляют по 0,16 мл 10% раствора NaOH, после чего отбирают по 0,4 мл содержимого, в котором определяют концентрацию кислоторастворимых продуктов (тирозина) протеолитического гидролиза гемоглобина. К нейтрализованному центрифугату в каждую пробирку приливают по 2 мл рабочего раствора реагента, который представляет собой смесь 0,25 л 2% раствора карбоната натрия в 0,1 М раствора гидроксида натрия и 0,01 л 0,5% раствора сульфата меди в 1% растворе цитрата натрия (данная смесь готовится перед анализом). Перемешанное содержимое выдерживают при комнатной температуре (18-25^oС) в течение 10 минут, после чего приливают 0,2 раствора Фолина-Чокальтеу и опять после тщательного перемешивания пробы выдерживают в течение 20 минут при комнатной температуре (18-25^oС).

Измерение оптической опытной пробы проводят против контрольной пробы в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 750 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре.

Расчет осуществляют по предварительно построенному калибровочному графику. Результаты выражают в МКГ тирозина на 1 мл фолликулярной жидкости.

Качество ооцитов, полученных при пункции, оценивают по уровню активности пептид-гидролаз. Хорошее качество ооцитов выставляют при уровне активности пептид-гидролаз - свыше 75 мг/мл/час, среднее качество при уровне - 40-74 мг/мл/час, плохое качество - при уровне ниже 40 мг/мл/час.

Доминантным считают яичник, активность пептид-гидролаз, в фолликулярной жидкости которого превышает на 20 мг/мл за 1 час и более соответствующий показатель другого яичника. У данной больной уровень пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости левого яичника составил 20,8 мг/мл, правого - 96 мг/мл, что было расценено нами как хорошее качество ооцитов, аспирированных из доминантного правого яичника.

Сперму подвергают флотированию и центрифугированию, после чего оценивают ее фертильность и производят инсеминацию ооцитов.

Перенос эмбрионов в полость матки осуществляют, как правило, через 48-50 часов после трансвагинальной пункции. Эмбрионы на стадии 2-8-ми бластомеров с помощью специального одноразового катетера для трудного подведения фирмы "COOK" (Австралия) через цервикальный канал переносят в полость матки. Кривизна катетера обращена к той стенке матки (правой или левой), где по нашим данным находится наиболее подготовленный к приему плодного яйца эндометрий. Как было указано выше, наиболее подготовленной стороной эндометрия считалась сторона, ипсилатеральная стороне расположения доминантного яичника, т.е. там, где активность пептид-гидролаз на 20 мг/мл за 1 час и более превышала соответствующий показатель другого яичника.

Перенос 4 эмбрионов, полученных при пункции правого яичника на стадии 8 бластомеров, осуществили на правую половину матки.

Результатом описанной попытки ЭКО и ПЭ явилась маточная беременность.

Пример 2. Больная С-а, история болезни 6442/522, поступила в Центр репродукции человека с целью проведения ей программы ЭКО и ПЭ. Больная предъявляла жалобы на бесплодие в течение 4 лет. Из анамнеза известно, что больной в 1992 г. была произведена правосторонняя тубэктомия по поводу правосторонней трубной беременности, в 1995 г. - левосторонняя тубэктомия по поводу левосторонней внематочной беременности. Стимуляция суперовуляции проводилась Хумегоном 75 ЕД+75 ЕД - 14 ампул со 2 по 7 день МП, кломифенцитратом по 100 мг в сутки со 2 по 7 день МЦ. При достижении зрелости фолликулами на 10 день МЦ был назначен Прегнил в дозе 8000 ЕД.

При УЗ-исследовании на момент проведения пункции фолликулов было зарегистрировано 2 лидирующих фолликула в левом яичнике и 7 - в правом. Толщина эндометрия составила 11 мм.

Больной была произведена пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости. При пункции фолликулов из левого яичника был получен 1 ооцит, из правого яичника - 5.

В фолликулярной жидкости, аспирированной из левого и правого яичников, определили активность протеолитических ферментов по вышеописанной методике. Уровень пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости левого яичника составил 41,7 мг/мл/час, правого - 145,8 мг/мл/час, что было расценено нами как хорошее качество ооцитов, аспирированных из доминантного правого яичника. Учитывая более высокую активность пептид-гидролаз в правом яичнике по сравнению с аналогичным показателем в левом яичнике (более 104,1 мг/мл/час), выбор переносимых эмбрионов осуществлялся из правого яичника.

Перенос 4 эмбрионов, полученных при пункции правого яичника на стадии 8 бластомеров, перенесли на правую половину матки.

Результатом проведенной программы ЭКО и ПЭ явилась маточная беременность.

Пример 3.

Больная А-а, история болезни 384/42 поступила в центр репродукции человека с целью проведения программы ЭКО и ПЭ. Больная предъявляла жалобы на бесплодие в течение 7 лет. В 1998 г. при проведении МСГ была установлена непроходимость маточных труб в истмических отделах. При дополнительном обследовании в плане подготовки больной к программе ЭКО и ПЭ выявлен уреаплазмоз, гарднереллез, проведено противовоспалительное лечение. Стимуляция суперовуляции проводилась с использованием Хумегона 75 ЕД+ 75ЕД - 15 ампул, кломифенцитрат - по 100 мг в сутки - 5 дней, овуляторная доза Прегнила составила 1000 ЕД.

При УЗ-исследовании на момент проведения пункции фолликулов было зарегистрировано 5 лидирующих фолликулов в левом яичнике и 4 - в правом. Толщина эндометрия составила 13,3 мм.

Больной была произведена пункция фолликулов и аспирация преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости. При пункции фолликулов из левого яичника было получено 2 ооцита, из правого яичника - 1.

В фолликулярной жидкости, аспирированной из левого и правого яичников, определили активность протеолитических ферментов по вышеописанной методике. Уровень пептид-гидролаз в фолликулярной жидкости левого яичника составил 46,9 мг/мл/час, правого - 31 мг/мл/час, что было расценено нами как среднее качество ооцитов левого яичника. Разница в уровне пептид-гидролаз фолликулярной жидкости яичников составила 15,9 мг/мл/час.

Перенос 1 эмбориона, полученного при пункции левого яичника на стадии 8 бластомеров, осуществили на левую половину матки.

Результатом проведенной программы ЭКО и ПЭ явилась маточная беременность, подтвержденная гормональным и УЗ исследованиями. Однако в 6 недель произошел самопроизвольный аборт.

По заявляемой методике проведено ЭКО и ПЭ 82 пациенткам. Показаниями к проведению программы ЭКО у данного контингента больных явились: трубно-перитонеальное бесплодие, одно- и двухсторонние тубэктомии, резекции яичников и односторонние аднексэктомии в сочетании с трубно-перинатальным бесплодием, эндометриоз, гипофункция яичников и бесплодие неясного генеза.

Из обследуемого контингента больных у 35 пациенток разница в уровне пептид-гидролаз фолликулярной жидкости яичников была выше 20 мг/мл, у 31 из них наступила беременность. Из 47 пациенток с отсутствием значимой разницы аналогичных показателей, беременность наступила только у 2, что подтверждает высокую работоспособность метода.

Т. о., заявляемый способ является более эффективным по сравнению с известными и обладает рядом преимуществ:
- не имеет осложнений и противопоказаний;
- прост в исполнении;
- позволяет существенно повысить эффективность программ ЭКО и ПЭ.

- может широко использоваться в центрах репродукции человека в программах ЭКО и ПЭ.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и репродуктологии и может быть использовано в программах ЭКО и ПЭ. Предложено в момент проведения пункции фолликулов производить раздельную аспирацию преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости из правого и левого яичников, определять в ней активность протеолитических ферментов - кислых пептид-гидролаз и перенос эмбрионов в полость матки осуществлять на сторону эндометрия, ипсилатеральную тому яичнику, где активность пептид-гидролаз превышала на 20 мг/мл за 1 ч и более соответствующий показатель другого яичника. Способ позволяет повысить результативность программ ЭКО и ПЭ.

Способ проведения экстракорпорального оплодотворения путем предварительной индукции суперовуляции и переноса эмбрионов в полость матки, отличающийся тем, что в момент проведения пункции фолликулов производят раздельную аспирацию преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости из правого и левого яичников, определяют в ней активность протеолитических ферментов - кислых пептид-гидролаз и перенос эмбрионов в полость матки осуществляют на сторону эндометрия, ипсилатеральную тому яичнику, где активность пептид-гидролаз превышала на 20 мг/мл за 1 ч и более соответствующий показатель другого яичника.