СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ Российский патент 1996 года по МПК A61K35/16 

Изобретение относится к медицине и касается изготовления лечебных препаратов из плазмы донорской крови.

Известен способ получения "Иммуноглобулина нормального человеческого для внутривенного введения" (ФС 42-232ВС-88). Данный препарат представляет собой белковый раствор иммунологической активной фракции плазмы крови доноров. Для его изготовления в качестве исходного сырья используют сухой полуфабрикат иммуноглобулина человека нормального (ФС 42-79ВС-87), полученный из крови доноров (см. "Типовой комплексный регламент производства белковых препаратов плазмы донорской крови", утв. МЗ СССР 21.12.1979 г.).

Прототипом изобретения является способ получения иммуноглобулина нормального человеческого для внутривенного введения, разработанный Горьковским НИИЭМ ("Регламент производства иммуноглобулина нормального человеческого для внутривенного введения N 143-80", утв. МЗ СССР 08.02.1980).

Иммуноглобулин нормальный человеческий для внутривенного введения лишен антикомплементарных свойств в результате обработки в слабокислой среде небольшим количеством пепсина с последующим удалением фермента гидроокисью алюминия. Действующее начало препарата антитела против различных вирусов и бактерий.

Способ-прототип включает следующие стадии:
растворение сухого иммуноглобулина (полуфабрикат), доведение рН раствора 0,1 Н соляной кислотой до 3,9 4,0, добавление пепсина (25 50 мг/100 г белка), 18-часовая экспозиция при 37^oC;
адсорбция пепсина гидроокисью алюминия, доведение рН 0,1 Н гидроксидом натрия до 7,0±0,5;
выстаивание при температуре 6±4^oC в течение 60 90 суток (рН раствора препарата 7,0±0,5). При выстаивании увеличивается опалесценция раствора, затрудняющая последующую осветляющую фильтрацию;
осветляющая фильтрация, стерилизующая фильтрация и розлив препарата во флаконы.

Для сохранения стерильности препарата во время технологического процесса стерилизующая фильтрация проводится также после добавления пепсина (перед 18-часовой экспозицией) и после адсорбции пепсина (перед выстаиванием). Вся работа проводится в асептических условиях.

Основными недостатками существующего способа является длительность периода выстаивания, а также то, что не все серии препарата сохраняют стабильность в течение установленного срока годности (12 месяцев). Нестабильность препарата проявляется в виде выпадания белков в осадок, помутнения раствора, то есть способ-прототип не обеспечивает полного удаления балластных белков в процессе изготовления иммуноглобулинов.

Цель настоящего изобретения повышение качества препарата, сокращение времени процесса.

Поставленная цель достигается тем, что полуфабрикат препарата выстаивают при pH 6,0 6,4 в течение одного месяца, а затем центрифугируют при 6000 об/мин.

Способ осуществляется следующим образом:
сухой полуфабрикат иммуноглобулина, полученный вышеуказанным способом (Типовой комплексный регламент производства белковых препаратов плазмы донорской крови, утв. МЗ СССР 21.12.1979 г.), растворяют в дистиллированной воде до концентрации белка 15,0 16,0% 0,1 Н соляной кислотой коррегируют значение pН до 3,9 4,0, добавляют высокоочищенный пепсин (25 50 мг на 100 г белка), инкубируют 18 часов при (37±0,5)^oС;
адсорбируют пепсин гидроокисью алюминия, доводят pН до 6,0 6,4 0,1 Н раствором гидроокиси натрия;
выстаивают раствор препарата при 6±4^oC в течение 30 суток (pН раствора 6,0 6,4);
удаляют осадок коллоидно-нестабильных белков центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об/мин, проводят стерилизующую фильтрацию и разливают препарат по флаконам.

По разработанной нами технологии изготовлено 10 серий препарата. В таблице 1 представлены сравнительные характеристики иммуноглобулинов, полученных предлагаемым способом и прототипом.

Препарат, полученный предлагаемым способом, имел более низкую антикомплементарную активность и более высокую прозрачность. Через 12 месяцев эти различия становились еще более выраженными. В трех сериях иммуноглобулина, полученного способом-прототипом, появились макроскопические муть и осадок. Это свидетельствует о выпадении нестабильных балластных белков, которые оставались в препарате после его изготовления по способу-прототипу. В препарате, полученном предлагаемым способом, существенных изменений в процессе хранения не отмечалось. Следовательно, этот препарат обладает более высокими качественными свойствами.

Выбор параметров pН при выстаивании препарата и режиме центрифугирования обусловлен следующими соображениями.

Как видно из приведенных выше данных, выстаивание при pН 7,0±0,5 процесс длительный и не обеспечивающий полного удаления балластных белков.

Известно, что снижение pН в растворах иммуноглобулинов ниже 6,0 может привести к нежелательному расщеплению белковых молекул за счет гидролиза и активации естественных ферментов, примесь которых содержится в иммуноглобулинах (Мосс Д. 1970; Терновой А, П. 1970).

В то же время, как показали наши исследования (табл. 1), выстаивание препарата при значениях pН в пределах 6,0 6,4 обеспечивает достаточно полное и быстрое выпадение балластных нестабильных белков.

Режим центрифугирования 6000 об/мин выбран нами как минимальный, обеспечивающий надежное удаление микрочастиц белковой природы из раствора препарата. Более высокие скорости центрифугирования на отечественном производственном оборудовании не могут быть получены и, следовательно, не могут рекомендоваться.

Пример конкретного выполнения
Из 135 литров донорской плазмы методом спиртового фракционирования в соответствии с Типовым комплексным регламентом производстве белковых препаратов плазмы донорской крови (1979) получили 2,1 кг осадка иммуноглобулинов, который подвергли сублимационной сушке по типовому режиму высушивания иммуноглобулинов. Лиофилизированный порошок (600 г) явился исходным сырьем для получения иммуноглобулинов, пригодных для внутривенного введения.

600 г сухого осадка иммуноглобулинов растворили в 2,52 л апирогенной дистиллированной воды, установив концентрацию белка в растворе 15% Провели коррекцию pН 0,1 Н соляной кислотой (1,6 л) до 4,0. Добавили 195 мг высокоочищенного пепсина (ТУ 6-09-10-229-74), провели стерилизующую фильтрацию и в герметичной таре раствор препарата поставили на инкубацию в термостат (37^oC) на 18 часов.

Через 18 часов в бутыль с раствором препарата добавили гель гидроокиси алюминия. После тщательного перемешивания подвергли раствор осветляющей фильтрации для удаления комплекса "фермент-гидроокись алюминия". Добавлением 1,7 л 0,1 Н гидрооксида натрия довели pН раствора иммуноглобулинов до 6,2. Раствор препарата подвергли стерилизирующей фильтрации.

В герметичной таре препарат выстаивали в течение 30 суток в бытовом холодильнике (6±4^oC).

Через 30 суток раствор иммуноглобулинов центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин. При этом на дне центрифужных стаканов образовался плотный белый осадок. Центрифугат слили и 0,1 Н гидрооксидом натрия довели pН в нем до 7,0.

Раствор препарата подвергли стерилизующей фильтрации и разлили по 25 мл в 50-миллиметровые флаконы. Получено 220 доз иммуноглобулина для внутривенного введения.

Необходимое количество флаконов препарата передано на контроль. Результаты контроля: препарат соответствует требованиям ФС 42.232ВС-88. При этом антикомплементарная активность составила менее 20 мг белка/ 2 СН₅₀, прозрачность 0,0 ед. оптической плотности.

Таким образом, предлагаемый нами способ получения иммуноглобулинов для внутривенного введения позволяет сократить время технологического цикла в 2
3 раза, получить препарат с более высокими качественными характеристиками, более стабильный при хранении, то есть решает поставленную цель. ТТТ1

Использование в медицине, в частности в трансфузиологии, а именно в изготовлении препаратов крови. Сущность метода состоит в том, что полуфабрикат препарата выстаивают при pН 6,0 - 6,4 в течение одного месяца, а затем центрифугируют при 6000 об/мин. Применение указанного способа позволяет сократить продолжительность технологического цикла изготовления иммуноглобулина для внутривенного введения, повысить производительность труда, а также улучшить качество данного лечебного препарата. 1 табл.

Способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, включающий растворение сухого иммуноглобулина, добавление пепсина при рН 3,9-4,0, последующую обработку гидрооксидом алюминия, выстаивание и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что выстаивание осуществляют при рН 6,0-6,4, а затем центрифугируют.