ИММУНОГЛОБУЛИН ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННЫЙ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/40 A61P31/12 

Изобретение относится к медицинским иммунобиологическим сывороточным препаратам, используемым для экстренной профилактики и лечения сибиреязвенной инфекции у людей.

Одним из известных сывороточных препаратов для внутривенного введения является иммуноглобулин человека нормальный (Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов. /Под ред. С.Г.Дзагурова, Ф.Ф.Резепова. - М., Медицина, 1975, 223 с.; Руководство по вакцинному и сывороточному делу. /Под ред. П.Н.Бургасова. - М., Медицина, 1978, 440 с.). Данный препарат используется для лечения тяжелых токсических форм бактериальных и вирусных инфекций, а также послеоперационных осложнений, сопровождающихся септицемией. Активным компонентом его являются иммуноглобулины, обладающие активностью антител различной специфичности. Препарат обладает неспецифической активностью, проявляющейся в повышении общей резистентности организма. Однако использование данного препарата для лечения сибирской язвы неэффективно.

Известен глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий и сухой, выпускаемый Научно-исследовательским институтом микробиологии МО РФ (г.Киров), представляющий собой 8-10% раствор иммуноактивных γ- и β-глобулиновых фракций гипериммунной лошадиной противосибиреязвенной сыворотки (Патент РФ №2214836 «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный сухой»).

Недостатком вышеуказанного препарата, прежде всего, является его гетерогенность. Белки, входящие в его состав, обладают выраженными антигенными свойствами для человека. Введение данного препарата в организм человека может сопровождаться сенсибилизирующим действием сывороточных белков (сывороточная болезнь, анафилактический шок), что требует предварительного определения индивидуальной чувствительности организма к белкам данного препарата путем постановки специальной внутрикожной пробы.

К причинам, препятствующим достижению полноценного результата для экстренной профилактики и лечения, относится то, что при введении глобулина противосибиреязвенного лошадиного в мышцу адсорбция препарата происходит медленно, уровень антител в крови реципиента достигает максимума только на 3...6 сутки, и до 30% введенного препарата «утилизируется» в месте введения. Кроме того, создаваемый данным препаратом пассивный иммунитет носит кратковременный характер, длительность его составляет 1...2 недели. Кратковременность иммунитета обуславливается, главным образом, образованием антител к белкам введенной сыворотки, являющейся для организма чужеродным антигеном. По этой же причине после повторного введения препарата длительность пребывания антител в организме еще больше уменьшается в результате действия ранее образовавшихся антител к белкам введенного препарата.

Задачей настоящего изобретения является получение готовой лекарственной формы иммуноглобулина человека противосибиреязвенного жидкого и сухого для внутривенного введения.

Решение поставленной задачи достигается тем, что глобулин для внутривенного введения содержит специфически активные белки гомологичного происхождения.

Новый препарат представляет собой 5,0±0,5% гамма-глобулин, содержащий не менее 95% IgG с титром антител к протективному антигену (ПА) в ИФА не менее 1:1600, полученный из плазмы крови доноров, иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной, содержащих антитела к ПА сибиреязвенного микроба в титре не менее 1:400 по результатам ИФА.

Выделение белковой фракции IgG состоит из следующих этапов:

1. Отбор доноров, проверенных на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека и гепатитов, и их последующая иммунизация комбинированной сибиреязвенной вакциной.

2. Забор плазмы крови доноров через 20...22 дня после иммунизации методом прерывистого двойного плазмафереза и определение специфической активности образцов плазмы (титра антител к ПА сибиреязвенного микроба) методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

3. Отбор, по результатам ИФА, образцов плазмы, содержащих антитела к ПА сибиреязвенного микроба в титре 1:400 и выше.

4. Получение концентрата иммуноглобулина G по схеме, составленной на основе 6-го метода Cohn и 9-го метода Cohn - Onkley (Наставление по применению ботулинических сывороток типов В, С, Е, F, очищенных методом пептического переваривания, концентрированных. Утв. МЗ СССР 09.12.1983 г.).

5. Приготовление внутривенной формы иммуноглобулина путем кислотно-ферментативного гидролиза.

Белковая фракция IgG, выделенная из плазмы крови доноров, иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной, является гомологичной, нереактогенной для человеческого организма и обладает специфической активностью к ПА сибиреязвенного микроба.

Проведенный анализ, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Сущность изобретения заключается в получении готовой лекарственной формы иммуноглобулина человека противосибиреязвенного, представляющей собой специфически активную белковую фракцию, выделенную из плазмы крови доноров, предварительно иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной СТИ-1, проверенных на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека и гепатитов, содержащую специфические антитела.

Возможность практического осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.

Пример

В реактор загружают иммунную плазму с титром антител 1:400 в объеме 40 л, 53% этиловым спиртом, охлажденным до минус 12°С, проводят осаждение фракции крови - фибриногена, являющегося «бросовым» осадком. Осажденный фибриноген выделяют из реакционной смеси центрифугированием на суперцентрифуге СГО-100 при скорости вращения ротора 15000 об/мин. Получают центрифугат I в количестве 45 л (1,13 л/л плазмы).

Центрифугат I возвращают в реактор, где 53% этиловым спиртом, охлажденным до температуры минус 12°С, проводят осаждение фракции иммуноглобулинов. Осадок выделяют из реакционной смеси центрифугированием на суперцентрифуге СГО-100 при скорости вращения ротора 15000 об/мин. Получают 1,7 кг осадка фракции II+III с титром антител к возбудителю сибирской язвы в разведении 1:400.

Полученный осадок «выпрессовывают» при температуре минус 25°С для удаления свободного этилового спирта.

В дальнейшем проводят фракционирование осадка фракции II+III (иммуноглобулинов).

Для этого проводят отмывку осадка от низкомолекулярных белков. Осадок растворяют 5% этиловым спиртом, приготовленным на 0,85% растворе хлористого натрия. Полученную суспензию охлаждают в реакторах до минус (1,5...2)°С, осаждение (отмывку) проводят 50% этиловым спиртом.

Затем осуществляют осаждение бета-глобулинов и липоидов.

Для этого реакционную смесь после длительного выстаивания пропускают через суперцентрифугу СГО. Полученный осадок (фракция иммуноглобулинов) вновь растворяют в 0,014 М растворе хлористого натрия и охлаждают в реакторе до температуры +0,1-0,2°С. Концентрацию водородных ионов доводят до 4,95...4,98 ед. рН.

Осаждение бета-глобулинов и липоидов проводят 50% этиловым спиртом (скорость подачи в начале осаждения 20 л/час, в конце осаждения - 12 л/час), охлажденным до минус 16°С. Концентрацию водородных ионов при этом устанавливают на уровне 5,22 ед. рН. После длительного перемешивания и «выстаивания» смесь центрифугируют на суперцентрифуге СГО, полученный осадок бета-глобулинов и липоидов актируют и получают 1,3 кг осадка.

Дополнительное удаление липоидов проводят подщелачиванием растворов до значений 5,56 ед. рН 1М раствором натрия двууглекислого с одновременным повышением температуры с минус 5...6 до минус 4,5°С. После перемешивания смесь центрифугируют, полученные осадки липоидов актируют и получают 0,08 кг осадка.

Осаждение гамма-глобулиновой фракции проводят 50% этиловым спиртом в присутствии натрия хлористого и натрия двууглекислого при концентрации водородных ионов 6,97 ед. рН в начале осаждения, 7,2 ед. рН - в конце осаждения и при температуре смеси в конце осаждения минус 9,5°С.

После 15-часового выстаивания и перемешивания смесь центрифугируют.

В результате центрифугирования получают осадок гамма-глобулиновой фракции весом 0,6 кг (выход с 1 л плазмы - 1,5 г/л).

На завершающем этапе проводят удаление из осадка технологического этилового спирта, который составляет 70% веса осадка и имеет крепость 40°.

Для этого используют фильтры «Biomax-30» установки «Pellicon-2» (фирма «Millihore» США). Полное удаление этилового спирта достигается 5-кратным разведением осадка водой для инъекций и проведением пяти циклов ультрафильтрации через фильтры «Biomax-30».

Ультрафильтрация позволяет, одновременно с удалением спирта из раствора, провести концентрирование белка. В данном случае белок концентрируется с 1,8% в начале ультрафильтрации до 11,5% - в конце.

В дальнейшем устанавливают содержание белка в растворе 5,0±0,5%, рН 7,0±0,5, иммуноглобулин подвергают стерилизующей фильтрации и разливают по флаконам.

Полученный таким образом иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения является гомологичным и практически нереактогенным для человеческого организма препаратом, выгодно отличающимся от глобулина противосибиреязвенного лошадиного объемом безопасной для введения дозы, скоростью возникновения и длительностью создаваемого пассивного иммунитета до 30 суток. Препарат позволяет эффективно и более безопасно проводить экстренную профилактику и лечение больных сибиреязвенной инфекцией различной степени тяжести.

Основные показатели качества иммуноглобулина человека противосибиреязвенного для внутривенного введения представлены в таблице.

Основные показатели качества иммуноглобулина человека противосибиреязвенного для внутривенного введенияНаименование показателя качестваИммуноглобулин человека противосибиреязвенныйПодлинностьВыявляются только белки сыворотки крови человека, белки животного происхождения отсутствуютПрозрачность, ед. опт. плотн.0,01Цветность, ед.0,017Содержание белка, %5,4Электрофоретическая однородность100% γ-глобулин человекаСтерильностьстериленПирогенностьнепирогененТоксичностьнетоксиченрН, ед. рН6,65Титр антител к ПА в ИФА, ед. титраНе менее 1:1600Фракционный состав в иммуноэлектрофорезеИнтенсивная дуга IgG человека и одна дополнительная дугаИндекс превентивных свойств, отн. ед.0,5Содержание хлоридов, %0,9Содержание глюкозы, %0,54Содержание гликокола, %0,63Молекулярные параметрыДимеры IgG человека - 3,3% Мономеры - 84,9% Фрагменты - 11,8%Антикомплементарная активность0 ед. СН₅₀ комплемента на 1 мг белка

Изобретение относится к медицинским иммунобиологическим сывороточным препаратам, используемым для экстренной профилактики и лечения сибиреязвенной инфекции у людей. Сущность изобретения включает получение готовой лекарственной формы иммуноглобулина человека противосибиреязвенного для внутривенного введения, представляющей собой 5,0±0,5% белковую фракцию, содержащую 100% IgG, выделенную из плазмы крови доноров, проверенных на отсутствие антител к вирусам иммунодефицита человека и гепатитов и иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной. Преимущество изобретения заключается в повышении длительности сохранения иммунитета. 1 табл.

Иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения, представляющий собой 5,0±0,5% гамма-глобулин, содержащий 100% IgG с титром антител к ПА в ИФА не менее 1:1600, полученный из плазмы крови доноров, иммунизированных комбинированной сибиреязвенной вакциной, содержащей антитела к ПА сибиреязвенного микроба в титре не менее 1:400 по результатам ИФА.