СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении эффективности терапии больных хронической почечной недостаточностью (ХПН).

Известен способ определения эффективности терапии больных ХПН, который включает регистрацию концентрации креатинина в крови и уровня клубочковой фильтрации (Рябов С.И. Наточин Ю.В. Бондаренко Б.Б. Диагностика болезней почек. Ленинград: Медицина, 1979. 256 с.). При снижении концентрации креатинина (Cr) и повышении уровня клубочковой фильтрации (F) говорят об эффективной терапии.

Однако для определения концентрации Cr требуется не менее 2 мл сыворотки крови; кроме того, динамика этих показателей слишком медленна, что не позволяет судить об эффективности терапии на ранних стадиях ее проведения.

Задачей изобретения является создание способа, позволяющего определить эффективность терапии на ранних стадиях ее проведения.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения эффективности терапии больных ХПН путем исследования сыворотки крови, согласно изобретению, из сыворотки крови осаждают глобулины сульфатом аммония, в надосадочную жидкость вводят достаточное количество раствора зонда ДСП-6 (n-толуолсульфонат 4-/4'>диметиламинофенил/этенил-1-гексил пиридиния), регистрируют интенсивность свечения при длине волны 540 нм и при снижении интенсивности свечения терапию считают эффективной.

Сывороточный альбумин основной белковый компонент плазмы крови - обладает уникальной способностью к модификации и связыванию различных лигандов. В литературе имеются данные, свидетельствующие о существенных изменениях третичной и вторичной структуры альбумина сыворотки крови (ЧСА) при различных патологических состояниях. Нами установлено, что модификация альбумина, то есть конформационные изменения его молекулы, происходят при воздействии эндотоксинов, образующихся в крови больных ХПН. Эти изменения предшествуют нарастанию концентрации свободных токсинов в крови, что позволяет оценить эффективность терапии на ранних стадиях ее проведения. Оценка конформационных изменений ЧСА проводилась спектрофлуориметрическим методом с использованием флуоресцентного зонда ДСП-6, который ранее применялся при работе с эритроцитарными мембранами (Калниня И.Э. Шибаева Т.Н. Блума Р.К. Соминский В. Н. Определение условий применения зондов ДСМ и ДСП-6 для изучения мембран эритроцитов// Изв. АН Латв. ССР. 1989. Вып. 7. с. 107 111/. Нами обнаружено свойство зонда ДСП-6 связываться с ЧСА и повышать интенсивность своего свечения при взаимодействии с альбумином больных ХПН. Попытки оценить изменение связывающей способности ЧСА с помощью другого зонда 8-анилино-1-нафталин сульфонат (АНС) дали результаты при патологии печени и окончились неудачей в применении к почечным больным (уремия различного генеза) /Миллер Ю.И. Использование флуоресцентного зонда в оценке связывающей способности сывороточного альбумина человека при печеночной недостаточности//. Лаборат. дело. 1989. Вып. 7. с. 20 23/. Использованный в данном способе зонд ДСП-6 оказался эффективным при исследовании ЧСА почечных больных.

Способ может быть осуществлен следующим образом. Из сыворотки крови больного осаждают глобулины методом высаливания в присутствии 33% сульфата аммония при постоянном перемешивании в течение 2-х часов при комнатной температуре /Вапцаров И. Иомтов М. Савов С. Дюкмеджиев И. Эшкенази М. Диспротеинемии. София: Медицина и физкультура. 1978. 336 с./. Суспензию центрифугировали при 700 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. К надосадочной жидкости после соответствующего разбавления до конечной концентрации белка 3 мг/мл, добавляют флуоресцентный зонд ДСП-6 (конечная концентрация зонда в пробе 1,0 2,5 10^-5 M), и после экспозиции в течение 20 30 минут регистрируют экспозицию интенсивность флуоресценции (I_фл) при длине волны 540 нм, (длина волны возбуждения 470 нм) на спектрофлуориметре "Хитачи" 650-40 (Япония). При концентрации зонда ниже 1,0 10^-5 M интенсивность свечения ДСП-6, связавшегося с белком, резко падает; при концентрации зонда выше 2,5 10^-5 M невозможно работать, так как при оптической плотности больше 0,42 интенсивность падает. Рабочая концентрация зонда была выбрана из зависимости: I_фл cистемы белок-зонд от концентрации зонда при концентрации белка 3 мг/мл. Для измерений использовался раствор, оптическая плотность которого была 0,42. Рабочая концентрация белка выбрана из зависимости I_фл системы зонд-белок от концентрации альбумина. Регистрация I_фл проводилась при λ = 540 нм,, а не при λ_макс., поскольку на склоне спектра, при длине волны 540 нм, различия в I_фл между разными пациентами выявлялись более четко. Длина волны возбуждения 470 нм выбрана как λ_макс. в спектре возбуждения ДСП-6 при λ_макс. испускания 610 нм. Значения интенсивности, которыми мы оперировали при разработке данного способа, являются величинами, представляющими собой отношение интенсивности свечения зонда, связанного с белком пациента, к интенсивности свечения зонда, связанного с альбумином фирмы "Reanal" (I_отн.). В каждом исследовании цифры, полученные на спектрофлуориметре, нормировались по стандарту, которым являлся альбумин фирмы "Reanal". Флуориметрический анализ частично очищенных альбуминов проводился каждому пациенту неоднократно, как до начала терапии, так и на ее фоне.

Пример 1. Больной А. 27 лет, диагноз: хронический гломерулонефрит (ХГН), активное течение, ХПН-2б, азотемия, метаболический ацидоз, вторичная гипертензия. Терапия: c 29.11.90: трентал, фуросемид, анаприлин, адельфан (до 14.12.90); с 11.12.90 фестал; с 18.12.90 энтеросорбент СКНП-1. В таблице 1 представлены данные обследования больного А. в течение 2 месяцев.

Из данных таблицы видно, что между 03.12.90, 12.12.90 и 19.12.90 практически нет существенной динамики по уровню Cr фильтрация падает в 1,3 раза. I_отн. уже к 12.12.90 снижается в 1,3 раза по сравнению с 03.12.90 и далее, на фоне энтеросорбента, уже через 4 суток после его назначения, I_отн. падает в 1,55 раза (21.12.90), что свидетельствует об эффективной терапии и что регистрируется лишь 26.12.90: креатининемия снижается, скорость клубочковой фильтрации возрастает. Дальнейшее снижение I_отн. в 1,8 раза предшествует за 14 суток изменению Cr и F. Альбуминовые фракции сыворотки крови больного А. исследовались методом электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ). Получены четкие различия в электрофореграммах между 03.12.90 и 10.01.91: в сыворотке от 10.01.91 отсутствуют дополнительные полосы, которые выявляются 03.12.90 и которые, возможно, соответствуют фракциям модифицированного альбумина.

Пример 2. Больной Б. 45 лет, диагноз: ХГН, обострение, вторичная гипертензия, ХПН-2а, азотемия. Терапия: c 17.10.90: курантил, фуросемид, клофелин; с 26.10.90 эуфиллин; с 05.11.90 апрессин; с 20.11.90 - энтеросорбент СКНП-1. В таблице 2 представлены данные обследования больного Б. в течение 1,5 месяца.

Данные таблицы 2 демонстрируют положительный эффект лечения больного Б. с 18.10.90 до 26.11.90. Относительно 31.10.90, уже к 13.11.90 и особенно к 26.11.90, снизилась креатининемия, F возросла: в 1,28 раза (13.11.90) и затем 2,25 раза (26.11.90). Интенсивность свечения зонда по отношению к исходной (1,20) снижается в 1,22 раза уже 31.10.90, и далее в 1,58 раза 13.11.90. Резкое возрастание I_отн., зарегистрированные 19.11.90 и далее - 26.11.90 (в 1,72 раза) предшествует снижению клубочковой фильтрации и нарастанию креатининемии,что выявляется лишь через 15 суток, 03.12.90. При ЭФ в ПААГ между 18.10.90 и 26.11.90 обнаружены те же различия, что и в предыдущем примере, а именно: в сыворотке от 26.11.90 отсутствуют дополнительные полосы, обнаруженные 18.10.90.

Пример 3. Больной В. 45 лет, диагноз: мезангиально-пролиферативный ГН, 2-й тип течения, вне обострения, ХПН-2а, азотемия, вторичная гипертензия. Терапия: с 14.02.91: кордафен, адельфан, карбонат кальция; с 28.02.91 - бисептол, бромгексин; с 06.03.91 энтеросорбент СКНП-1. В таблице 3 представлены данные обследования больного В. в течение 2 месяцев.

Данные таблицы демонстрируют неэффективность лечения больного В. с 15.02.91 по 15.04.91: существенная динамика по Cr отсутствует, F падает в 1,2 раза. I_отн. по сравнению с исходным, уже 22.02.91 возрастает в 1,5 раза, предшествуя снижению клубочковой фильтрации, которое регистрируется только 05.03.91. В дальнейшем I_отн. остается практически на одном уровне, что соответствует отсутствию положительных сдвигов в состоянии больного. Электрофоретические картины альбуминовых фракций этого больного 15.02.91 и 01.04.91 оказались практически одинаковыми.

Из приведенных примеров видно:
изменение относительного спектрального параметра происходит в среднем на 10 15 суток раньше, чем изменение концентрации Cr и F;
снижение I_отн. коррелирует с эффективной терапией;
увеличение I_отн. указывает на неэффективность терапии.

Использование предлагаемого способа позволяет:
оценивать эффективность терапии больных ХПН на ранних стадиях ее проведения;
проводить исследование в микродозах сыворотки (0,03 0,04 мл);
значительно повысить чувствительность.

Использование в медицине, в частности, при определении эффективности терапии больных хронической почечной недостаточностью (ХПН). Сущность способа состоит в том, что из сыворотки крови осаждают глобулины сульфатом аммония, в надосадочную жидкость вводят достаточное количество раствора зонда ДСП-6, регистрируют интенсивность свечения при длине волны 540 нм, и при снижении интенсивности свечения терапию считают эффективной. Предлагаемый способ позволяет оценить эффективность терапии на ранних стадиях ее проведения и повысить чувствительность. Возможность работы с низкими концентрациями белка избавляет от необходимости забора больших объемов крови у больных. Используемые реактивы и методы исследования позволяют сохранить первоначальную структуру модифицированного альбумина, находящегося в сыворотке крови больных ХПН.

Способ определения эффективности терапии хронической почечной недостаточности, включающий исследование сыворотки крови в процессе терапии, отличающийся тем, что из сыворотки крови пациента осаждают глобулины сульфатом аммония, в надосадочную жидкость вводят флуоресцентный зонд n-толуолсульфонат 4-/4-диметиламинофенил/-этенил-1-гексил пиридиния (ДСП-6), регистрируют интенсивность свечения при длине волны 540 нм и при снижении интенсивности относительно исходной терапию считают эффективной.