Способ определения модифицированного альбумина в крови человека Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

w

ы

ё

Использование: в области медицины, в частности в клинической биохимии. Сущность изобретения: из сыворотки крови больного осаждают глобулины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия до конечной его концентрации 0,8-1,0 М и белка 0,2-0,5 мг/мл, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм, определяют интенсивность флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитывают их соотношение. Способ прост в исполнении и позволяет повысить чувствительность определения модифицированного альбумина. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении модифицированного альбумина в крови человека.

Известен способ определения модифицированного альбумина, включающий изо- электрическое фокусирование (ИЭФ) в геле с использованием борат-полиольного градиента рН в одно- и двухмерной системе. Альбумин выделяют препаративным электрофорезом (ЭФ) в агарозном и полиакрила- мидном гелях (ПААГ). Аналитическое и препаративное ИЭФ в борат-полиольной системе осуществляют в ПААГ. В качестве буферного раствора используют 0,1 М борную кислоту, оттитрованную трисом до рН 7,5. После ИЭФ гель извлекают из трубочки и окрашивают кумасси G-250. При препаративном ИЭФ из гелевого блока вырезают контрольную полоску, окрашивают ее; из блока вырезают участки геля, соответствующие белковым фракциям. Гель измельчают на холоду и элюируют на воронке с бумажным фильтром. Элюаттроекратно промывают в стакане для ультрафильтрзции (фильтр УАМ-50 Владипор) дистиллированной водой, а затем 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0, после чего фракции концентрируют. Дополнительная очистка от примеси глобулинов осуществляется методом препаративного диск-электрофореза в ПААГ. Для определения дисперсии оптического вращения и спектров кругового дихроизма используют концентрации белка в пробах 1 мг/мл. Данный способ принят за прототип.

К недостаткам способа относятся: сложность осуществления, длительность и необходимость накопления для анализа сравнительно высоких концентраций белка, что ограничивает возможность использования этого метода и значительно снижает его чувствительность.

VJ VJ

Ю

2

fcb

Целью изобретения является упроще ние, ускорение, а также повышение чувстви- го-чьности сгособз.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения модифицированного альбумина в крови человека, включающем биохимическое исследование крови, согласно изобретению, из сыворотки крови осаждают глобулины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия до конечной концентрации белка 0,2-0,5 мг/мл и конечной концентрации хлорида натрия Ц8-1,0 М, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм, определяют интенсивности флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитывают их соотношение.

Выделение альбуминов из еьшоротки крови путем осаждения глобулинов сульфатом аммония не требует больших затрат времени и сложного оборудования. Применение СФЛ анализа позволяет работать с низкими концентрациями белка; для проведения исследования необходимо 0,2-0,5 мг/мл (или 0,003 мл исходной сыворотки крови), что существенно повышает чувствительность способа. В прототипе для анализа требуется 1 мл/мл. В способе на анализ крови одного больного затрачивается 2.5 ч, а в прототипе - сутки и более. Раствор хлорида натрия не влияет на спектральные характеристики альбумина. При концентрации хлорида натрия ниже 0,8 М белок после семидневного хранения выпадает в осадок, кроме того в такой среде быстро размножаются микроорганизмы; при концентрации хлорида натрия выше 1 М, ионная сила раствора столь высока, что может привести к изменению характеристик триптофановой флуоресценции. В пределах указанных величин концентраций хлорида натрия параметры спектров флуоресценции не зависят от ионной силы раствора. При концентрации белка ниже 6,2 мг/мл вклад во флуоресценцию примесей, содержащихся в растворителе, становится сопоставимым с уровнем свечения самого белка. При концентрации белка выше 0,5 мг/мл существенным становится отклонение от линейной зависимости между концентрацией белка и интенсивностью флуоресценции.

Способ может быть осуществлен следующим образом. Из сыворотки крови человека осаждают глобулины, методом высаливания в присутствии 33% сульфата амония при постоянном перемешивании в течение двух часов при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют при 700 q

в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость используют для проведения спектрофлуориметрических исследований после соответствующего разбавления хлоридом натрия до конечной концентрации белка 0,2-0,5 мг/мл и конечной концентрации хлорида натрия 0,8-1,ОМ. СФЛ анализ одной пробы длится в среднем 1 мин. Полноту осаждения глобулинов контролируют методом диск-электрофореза в ПААГ. В качестве характеристики спектра флуоресценции используют величину параметра А, представляющую отношение ин- тенсивностей на склонах спектра

флуоресценции и являющуюся очень чувствительной характеристикой даже небольших спектральных сдвигов: А 1з20/1зб5, где Цго и vji интенсивности в спектрах флуоресценции при длинах волн 320 и 365

нм соответственно.

Характер спектров флуоресценции и спектров поглощения (максимум в области 280 нм) препаратов альбуминов из сыворотки доноров и больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) свидетельствует о том, что во всех случаях флуоресценция обусловлена собственными хромофорами белка - триптофановыми и тирозиновыми остатками. При возбуждении излучением с длиной

волны 296,8 нм, т.е. в той спектральной области, где вклад тирозиновых остатков в поглощении незначителен, регистрируется только флуоресценгция триптофана, при возбуждении излучением с длиной волны 28

нм. наряду с триптофановыми остатками, значительный вклад в коротковолновой области спектра дают тирозиновые остатки. В случае сывороточного альбумина доля тирозиновых остатков в излучении значительна,

поскольку в составе молекулы этого белка имеется 18 тмрозиновых и только 1 трипто- фановый остаток. В настоящей работе решено ограничиться анализом только триптофановой флуоресценции. Поэтому

параметр А измерялся при возбуждении длиной волны 296,8 нм.

Пример 1. Больной Ленцер Д.А. 24 г., диагноз мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит с нефротическим синдромом. суточная потеря белка (СПБ) 6.5 г/сут, концентрация альбумина в крови - 20,0 г/л. Выделение альбуминов из сыворотки крови проводили по приведенной выше методике, определяли параметр .А при концентрации

альбумина 0,20 мг/мл, концентрации хлорида натрия 0,8 М. Получили величину параметра А 1,62 ±0,02.

Пример 2, Больной Ленцер Д.А.

Определяли параметр А при концентрации

альбумина 0,5 мг/мл, концентрации хлорида натрия 1,0 М. Получили величину препарата А 1,63±0,04.

Пример 3. Больной Ленцер Д.А, Определяли параметр А при концентрации альбумина 0.3 мг/мл, концентрации хлори- да натрия 0,9 М. Получили величину параметра А 1,65±0,02.

Пример 4. Донор В.. 18 лет, практически здоров. Определяли параметр А при концентрации альбумина 0,3 мг/мл и кон- центрации хлорида натрия 0.9 М. Получили величину параметра А 1,22 ±0.02.

Результаты исследования представлены в таблице.

Средняя величина параметра А для 12 здоровых доноров составляет 1,26±0,0t. Из данных таблицы следует:

Больные ХГН и здоровые доноры различаются по параметру А (спектр распределе- ния) с Рц 0,001 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

Обнаружена высокодостоверная, приближающаяся по величине к прямой функциональной связи зависимость между величиной параметра А и суточной протеи- нурией. Коэффициент ранговой корреляции по Спирмену р 0.885; Р 0,005.

Имеется достоверная обратная зависимость между уровнем альбумина в сыворотке крови и величиной параметра А. -0.461, ,05.

Применение способа позволяет упростить, ускорить методику и повысить чувствительностьопределениямодифицированного альбумина. Используемые реактивы и методы исследования позволяют сохранить первоначальную структуру модифицированного альбумина, находящегося в сыворотке крови.

Формула изобретения

Способ определения модифицированного альбумина в крови человека путем ее биохимического исследования, отличающийся тем, что, с целью упрощения, ускорения и повышения чувствительности способа, из сыворотки крови осаждают глобулины сульфатом аммония, надосадочную жидкость разбавляют раствором хлорида натрия до конечной его концентрации 0,8- 1,0 М, измеряют флуоресценцию при длине волны возбуждения 296,8 нм, определяют ее интенсивность при длинах волн 320 и 365 нм и рассчитывают, соотношение этих показателей.