СПОСОБ ПЕРЕСАДКИ КОСТНОГО МОЗГА В ОБЛАСТЬ КОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 1996 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии и хирургии.

Известен способ трансплантации кроветворных тканей, заключающийся во введении донорских клеток в кровоток. Введение клеток может осуществляться внутривенно, внутриартериально и внутрисердечно. Внутривенный способ введения клеток наиболее безопасен, менее травматичен и способный быстрому расселению кроветворных клеток в организме реципиента, поэтому в клинической практике наиболее часто применяется этот способ.

Однако при внутривенном введении донорских клеток костного мозга (трансплантата) происходит быстрое "расселение" их, что не позволяет создать очаг размножения пересаженных клеток в организме реципиента.

Прототипом заявляемого предложения является внутрикостный способ введения трансплантатов донорских клеток костного мозга в грудину, трубчатые кости, подвздошную кость, лодыжки, пяточную кость, бугристость большеберцовой кости.

Особенностью этого способа является то, что донорские клетки попадают в естественную для себя среду обитания, кроме того, перенос донорского стремального микроокружения кроветворной ткани способствует восстановлению и регенерации собственной кости и кроветворной ткани.

При непосредственных пересадках костного мозга, по приведенному выше способу, донора и больного укладывают на два стоящих рядом стола. К операции пересадки костного мозга подготавливаются для врача и операционная сестра. Один из врачей берет костный мозг у донора, а другой вводит его больному. Для производства операции пересадки костного мозга необходимо иметь 8-10 шприцев емкостью 20 мл. При непосредственной внутрикостной трансплантации костного мозга для каждой операции аспирируемой костномозговой взвеси используется новый шприц. Операция проводится под местной анестезией 2% раствором новокаина.

Преимуществом данного способа введения клеток костного мозга (км) по сравнению с внутривенным является также то, что часть клеток донорского костного мозга задерживается в месте введения, что теоретически позволяет осуществить целенаправленную доставку препарата к клеткам-мишеням и, следовательно, реализовать идею обработки костного мозга in vivo после его трансплантации с помощью депонирования пролангированных форм различных препаратов в области пересадки.

Недостатком прототипа является то, что введение клеток костного мозга без микросфер не позволяет получить значительного депонирования донорских клеток и препаратов в области пересадки костного мозга (кости).

Сущностью изобретения является то, что способ пересадки костного мозга заключается в том, что вместе с донорскими клетками трансплантата вводятся магниточувствительные микросферы, которые депонируются в области пересадки кости.

Используются микросферы диаметром 3-6 мкм, состоящие из биополимеров медицинского назначения (желатин, гуммиарабик) включающих в свой состав магнетит.

Совокупность этих признаков позволяет депонировать в области пересадки костного мозга магниточувствительные микросферы, которые могут служить магниточувствительной пролонгированной лекарственной формой для водо- и маслорастворимых и нерастворимых лекарственных препаратов, что позволит создать условия для обработки in vivo донорского костного мозга препаратами, регулирующими гемопоэз (эритропоэтин) или иммунологический статус организма (иммунодепрессанты, цитостатики) и препаратами другого действия (антитела, антигены и т.д.).

Новым в заявляемом способе является то, что вместе с донорскими клетками трансплантата вводятся магниточувствительные микросферы, которые депонируются в области пересадки кости.

Пример 1. Операция внутрикостной пересадки костного мозга с депонированием магниточувствительных микросфер на мышах.

Под внутрибpюшинным нембуталовым наркозом, из расчета 35 мг/кг веса животного, после обработки операционного поля в области коленного сустава облученного реципиента (мыши) кобальтом (Со60) производят чрезкожную пункцию канала бедренной кости (первый этап ) и осуществляют аспирацию костного мозга из полости бедра реципиента. После чего бедро реципиента помещают на плоский источник постоянного магнитного поля индукцией 0,18 Тл и вводят микрошприцем фирмы Hamylton (Нидерланды) суспензии донорского костного мозга в смеси с микросферами в объеме 10 мкл (второй этап). Конечная концентрация микросфер в водимом объеме составляла 3% по их сухому весу. Выбор объема суспензии обусловлен малым объемом канала бедренной кости мыши, так как общая масса ее составляет в среднем 50-55 мг. Микросферы применяют диаметром 3-6 мкм, состоящие из биополимеров медицинского назначения (желатин, гуммиарабик), включающий в свой состав магнетит. Затем реципиента помещают в камеру установки 2 для намагничивания, где производится омагничивание реципиента мощным импульсным магнитным полем (третий этап). На четвертом этапе иглу микрошприца извлекают из полости бедренной кости и производят заклеивание раны мягких тканей клеем МК-2. После операции реципиента помещают в клетки с подогревом до момента отмены наркотического действия нембутала.

При введении микросфер в смеси с донорскими клетками разработанным способом (опытная группа N 4), удается депонировать в области трансплантации до 54,2%±1,5 магниточувствительных микросфер в течение 1 ч после операции, тогда как при введении микросфер без донорских клеток, эффект депонирования составляет всего 11,4±1,1.

Результаты дисперсионного анализа этих двух групп говорят о сильном влиянии (h2A

= 0,83; Р 0,01) фактора введения донорских клеток в суспензию микросфер на эффект депонирования последних в области пересадки, где h2A показатель силы влияния факторов на результативный признак; Р вероятность события.

Результаты статистического анализа групп N 3 и N 4 не выявили достоверного влияния применения постоянного магнитного поля (ПМП) на эффективность депонирования радиоизотопно-меченных микросфер (Fe59) в области пересадки костного мозга через 1 ч после их введения. Однако, изучение динамики выведения микросфер из созданного депо показано, что через сутки после операции с применением постоянного магнитного поля (ПМП) группа N4, в области трансплантации сохраняется достоверно большее количество микросфер 28,1±0,7 (Р 0,01) по сравнению с группой N3, где операция производилась без применения ПМП.

Данное влияние ПМП на динамику выхода микросфер из бедренной кости вероятно объясняется индуцированием ПМП магнитного момента у микросфер и ориентацией их по силовым линиям магнитного поля, приводящей к адгезии микросфер между собой, что затрудняет попадание образовавшихся конгломератов в капилляры, а, следовательно, и рециркуляцию их из созданного депо. Изучение внутривенного введения меченных микросфер (группа N1) показало, что лишь незначительная их часть попадает в область кроветворения бедренную кость 1,0% ±0,1, тогда как основная часть вводимой аликвоты задерживается в таких мощных гемоциркуляторных барьерах, как легкие и печень 86,8%±1,7. В опытной группе N4 этот показатель через 1 ч после операции был всего лишь 29,6%±1,0 и 65,1% ±1,1 через 24 ч. Это говорит о невозможности целенаправленного транспорта синтезированных микросфер, при внутривенном способе введения.

Таким образом, из полученных результатов можно сделать заключение, что разработанная операция пересадки костного мозга позволяет создать депо пролонгированной магниточувствительной лекарственной формы препаратов в области трансплантации, причем использование ПМП позволяет пролонгировать эффект депонирования микросфер.

Следующим этапом исследования пересадки костного мозга, описанной выше операции, явилась серия экспериментов по излучению распределения трансплантированных донорских клеток (меченных Fe59) в организме облученного реципиента.

Исследование эффекта депонирования клеток костного мозга в месте трансплантации через 1 ч после внутрикостного введения суспензии клеток с микросферами (группа N3) в области пересадки депонируется 49,2%±1,3 трансплантированных донорских клеток (меченных Fe59), причем воздействие ПМП в данном опыте (группа N4) не влияло на этот показатель, так как сравнение групп N3 и N4 в разные сроки наблюдений не выявило достоверной разницы между ними (P>0,05).

Дисперсионный анализ групп N3 и N4 с контрольной группой N2, в которой клетки вводились внутрикостно без микросфер, выявило выраженное влияние фактора введения микросфер в трансплантат (h2A

= 0,80-0,88; Р < 0,01) на эффект депонирования донорских клеток в области пересадки. Сравнение внутривенного, внутрикостного и разработанного нами способа пересадки костного мозга, выявило, что наибольший процент удержания донорских клеток в области пересадки 44,2 49,2% наблюдает при предложенном способе введения трансплантата в смеси с микросферами, достоверно меньший эффект наблюдался при внутрикостной пересадки 21,3%±0,6 (P < 0,01), и совсем незначительная часть вводимой аликвоты донорских клеток попадает в бедренную кость реципиента при традиционной внутривенной инфузии 3,9% Коррелируют эти результаты (обратная связь) и с данными по рециркуляции клеток в легкие и печень при различных способах пересадки костного мозга (h_xy 0,66; P < 0,01), где корреляционное отношение, так как чем больше процент депонирования клеток в области пересадки, тем меньше количество импульсов в единицу времени от меченных клеток (СРМ) и, следовательно, процент их депонирования в этих органах.

Результаты по изучению длительности удержания клеток донорского костного мозга в области пересадки указывают на то, что через 24 ч в общий кровоток рециркулирует около 50% депонированных в течение первого часа донорских клеток, причем применение ПМП не оказывает влияния на этот процесс (группы N3 и N4 P>0,05). Однако, и в данный срок наблюдений процентное содержание клеток донорского мозга в бедренной кости (22,5-26,7%) было достоверно выше в этих группах N3 и N4 по сравнению с обычным внутрикостным (12,3%±0,8; P < 0,01) и тем более внутривенным введением (6,4%±0,3; P < 0,01).

Таким образом, разработанный способ позволяет удерживать донорские клетки в области депонирования микросфер, что создает благоприятные условия для пролонгированной обработки in vivo, включенными в микросферы препаратами клеток донорского костного мозга.

Пример 2. Операции внутрикостной пересадки костного мозга с депонированием магниточувствительных микросфер на кроликах.

Под внутривенным нембуталовым наркозом из расчета 35 мг/кг веса животного, после обработки операционного поля в области грудины и фиксации реципиента (кролика) на операционном столе, производят пункцию грудины иглой диаметром 1,5 мм с мандреном через верхний край ее рукоятки так, чтобы игла находилась в сагиттальной плоскости срезом кпереди первый этап. Затем иглу с мандреном с небольшим усилием проводят в тело грудины, извлекают мандрен и производят аспирацию костного мозга реципиента с помощью шприца. После аспирации к игле присоединяют систему 3 для инфузии суспензии костного мозга с микросферами, которую помещают на входе системы в шприц второй этап. Объем вводимой смеси донорских клеток с микросферами составлял 1 мл. Количество донорских ядросодержащих клеток составляло 25,0 х 10⁶ на 1 мл суспензии, а конечная концентрация по их сухому весу 2,5% Клеточная взвесь с микросферами вводится в грудину дозирование, с помощью роликового насоса, применяющегося в клинике при проведении экстракорпоральных методов очистки крови. Скорость введения составляла 0,5 мл/мин, так как предварительные расчеты магнитных характеристик микросфер показали, что при такой скорости подачи микросфер, указанной концентрации, создаются оптимальные условия для их магнитного захвата, при радиусе расстояния от среза иглы до источника ПМП не более 0,5 см и напряженности магнитного поля не менее 1,5 Тл. Кроме того, конусообразный источник постоянного магнитного поля (ПМП)4 подводят непосредственно к срезу иглы и по мере введения донорского костного мозга и радиоизотопомеченных микросфер производят постепенную тракцию иглы из кости с одновременным поступательным движением источника ПМП за ней. На третьем этапе заклеивают операционную рану клеем МК-2. После заклеивания раны и дополнительного омагничивания в течение 15 мин, реципиента помещают в термостатируемое помещение до отмены действия нембуталового наркоза.

В серии опытов по изучению эффекта депонирования меченых Fe59 микросфер с помощью ПМП, проведенной на 20 кроликах, было выделено две группы результатов.

Применение магнитного поля достоверно (P < 0,05) повышает процент депонирования микросфер в области трансплантации (группа N1) в различные сроки наблюдений по сравнению с группой N2, где ПМП не применялось. Таким образом следует, что выведение микросфер в этом случае происходит достоверно (P < 0,01) медленнее (≈ 40%), чем в контрольной группе N1 (≈ 60%).

Из приведенных результатов можно сделать заключение, что разработанная операция по пересадке аллогенного костного мозга позволяет увеличить время выхода микросфер из области трансплантации (грудины).

Из результатов по исследованию эффекта депонирования донорских клеток (меченных Fe59) в области пересадки костного мозга, наибольший процент (54,1±1,75) удержания донорских клеток в грудине реципиента наблюдается при введении клеток в смеси с микросферами (группа N2). Достоверная разница (P < 0,01) по сравнению с контрольным внутрикостным введением (группа N1) наблюдалась и в случае применения ПМП (группа N3), несмотря на меньшую выраженность эффекта депонирования (P < 0,01) в этой группе с опытом, где магнитное поле не применялось (группа N2). Последнее вероятно обусловлено стимулирующим действием ПМП, примененных параметров на рециркуляцию ретикулоцитов костного мозга.

Изучение динамики выхода донорских клеток из области трансплантации показало, что, несмотря на достоверно (P < 0,01) большой уровень его в опытных группах N2 и N3 по сравнению с контролем (группа N1), через 36 ч после операции в этих группах, однако, остается достоверно большее количество донорских клеток в оперированной кости (Р < 0,05).

Таким образом, разработанный способ пересадки костного мозга с депонированием микросфер позволяет существенно повысить процент депонирования донорских клеток в области пересадки по сравнению с традиционной внутрикостной инфузией, и, следовательно, с учетом выраженного эффекта депонирования магниточувствительных микросфер, которые могут служить депо-формой для различных препаратов, данный способ позволяет осуществлять направленный транспорт препаратов к донорским клеткам костного мозга.

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии и хирургии. Сущностью изобретения является то, что способ пересадки костного мозга заключается в том, что вместе с донорскими клетками трансплантата вводятся магниточувствительные микросферы, которые депонируются в области пересадки кости. Способ позволяет удерживать донорские клетки в области депонирования микросфер, что создает благоприятные условия для пролангированной обработки in vivo, включенными в микросферы препаратами клеток донорского костного мозга.

Способ пересадки костного мозга в область кости в эксперименте, включающий внутрикостное введение трансплантатов донорских клеток, отличающийся тем, что одновременно с трансплантатом вводят магниточувствительные микросферы из биополимеров медицинского назначения.