БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ТРАВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОСТНОЙ ТКАНИ ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ОБЛАСТИ Российский патент 2010 года по МПК A61K35/28 A61P19/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточным трансплантатам для регенерации костной ткани при хирургическом лечении деструктивных, дегенеративно-дистрофических, травматических или врожденных поражений костной ткани челюстно-лицевой области.

В ряде случаев заболевания или пороки развития приводят к стойкой потере костной ткани в связи с развитием различных в патофизиологическом отношении патологических процессов [1].

Хирургическое лечение дефицита и дефектов костной ткани направлено на восстановление утраченных тканей в их оригинальной гистоархитектонике и функции. В настоящее время в широкой клинической практике распространены имплантационные материалы для направленной костной регенерации. Эффективность восстановления костной ткани в таком случае при хирургическом лечении главным образом зависит от свойств имплантационных материалов, которыми замещается дефект.

Известны материалы для имплантации в ткани на основе резорбируемых и нерезорбируемых остеоиндуктивных веществ, которые могут быть минерального или биологического происхождения. Так, известна имплантация в поднадкостничную область материалов на основе коллагена, содержащих костный порошок гидроксиаппатитов, трикальций-фосфатов с применением лекарственных средств - гликозамингликанов [2].

Известен биосовместимый материал для стоматологии, включающий неорганические соли, коллаген, сульфатированные гликозамингликаны и воду [3].

Также широко используются различные виды костных ауто-, алло- и ксенотрансплантатов.

Так, известно использование различного вида культур клеток, чаще фибробластов, в качестве оптимизаторов раневого заживления в хирургической пародонтологии [4]. Так, например, известно имплантирование культуры постнатальных фибробластов, доставляемых в область костного дефекта на носителе - синтетическом гидроксиапатите или на твердой мозговой оболочке эмбриона человека [5].

Известно применение биологического протеза на основе коллагена для устранения дефекта костной ткани, причем в качестве основы используют гемостатическую коллагеновую губку, на которую наносят аутогенный костный мозг и пропитывают ее эстрогеном в дозе 0,5 мг/кг [6].

Недостатки у указанных выше имплантатов обусловлены низкой эффективностью (ограниченные показания к применению), возможными побочными эффектами. Отмечается прямая зависимость эффективности таких имплантатов от типа дефекта, например костей свода черепа или длинных трубчатых костей, поскольку первые не способны к самостоятельной регенерации вообще, а стимуляция регенерации в последних возможна только при небольших дефектах, имеющих хотя бы 3 опорные стенки [7].

Использование аутотрансплантатов всегда сопровождается дополнительным операционным полем для его забора и не гарантирует приживаемость в трансплантационном ложе.

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является материал на основе композиции, включающей фибробласты в составе гидроксиаппатита [8]. Использование фибробластов позволяет повысить лечебный эффект за счет стимулирующей активности клеточного компонента, способствующего сокращению сроков заживления раневой поверхности, снижению выраженности постоперационной рецессии десны и обеспечению увеличения сроков ремиссии хронического заболевания. Однако использование гидроксиаппатита в качестве носителя имеет недостатки, указанные выше, что обуславливает рецидив заболевания в значительном проценте случаев, а также сопровождается снижением прочности вновь образованной кости к механическим нагрузкам. Кроме того, клеточный компонент конструкции материала используется с недостаточной эффективностью, что обусловлено короткими сроками хранения данной композиции (3-4 суток) [9]. Таким образом, такая конструкция материала не является оптимальной для поддержания клеток в жизнеспособном состоянии в течение длительного времени, что ограничивает ее широкое применение в клинической практике.

Задачей настоящего изобретения является создание биологического трансплантата для замещения костных дефектов вне зависимости от их объема и протяженности путем закрытия полости различной конфигурации и размера искусственно созданным биодеградируемым трансплантатом с клеточным компонентом.

При этом это достигается за счет способности материала временно встраиваться в новообразуемые ткани, стимулировать регенерацию тканей, являться источником образования молодой кости, что в конечном итоге приводит к органотипической регенерации костной ткани в месте дефекта и полной деградации материала в заданные сроки.

Заявленный биотрансплантат на основе коллаген-минерального комплекса, идентичного натуральному костному материалу, или биосовместимого полимера (например, полилакдиды, полигликолиды, полигидроксиалканаты и им подобные, а также их сочетания) содержит клеточную культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) из различных источников. В готовом виде материал для имплантации имеет макромолекулярную трехмерную структуру, толщина и длина которого может варьироваться в зависимости от клинической задачи.

Входящие в состав материала жизнеспособные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки из различных источников распределены в объеме обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. Они продуцируют факторы роста, стимулирующие быстрое восстановление костной ткани, способствуют привлечению собственных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в место дефекта и активируют их пролиферацию, дифференцировку, нормализуют воспалительную реакцию, участвуют в синтезе внеклеточного матрикса.

Использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из различных источников в составе фибринового сгустка, образовавшегося после полимеризации обогащенной тромбоцитами плазмы, соответствует естественному клеточному микроокружению в первичной мозоли in vivo и таким образом обеспечивает оптимальные условия для поддержания их в жизнеспособном состоянии при хранении, транспортировке и после трансплантации. Кроме того, фибриновый сгусток одновременно выполняет функцию носителя активных компонентов и обладает способностью временно встраиваться в новообразуемые ткани с последующим постепенным замещением собственной тканью.

Технический результат достигается благодаря оптимальным параметрам, присущим структуре сформированного таким образом фибринового сгустка, возникает возможность транспортировать живые клетки в клинику и, не травмируя, переносить их в составе трансплантата на раневую поверхность. Все это обеспечивает более выраженный и быстрый клинический эффект и увеличивает сроки хранения готового трансплантата до 3 недель.

Получение обогащенной тромбоцитами плазмы

Забор крови пациента проводится по стандартным методикам, возможно использование вакуумной системы типа Vacuette® с цитратом натрия. Кровь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, отбирают верхний слой (без эритроцитов) и снова центрифугируют при 3600 об/мин в течение 10 мин. Большую часть супернатанта удаляют, осевшие тромбоциты ресуспендируют в оставшейся плазме. В исходную аутоплазму могут быть дополнительно внесены другие матриксные белки, например фибронектин и ламинин, которые являются естественным компонентом околоклеточного матрикса для фибробластов in vivo. Указанные белки внеклеточного матрикса способствуют структурированию фибринового сгустка после полимеризации и ускорению процесса полноценной регенерации кости.

В состав аутоплазмы также дополнительно могут быть введены антисептики, например, такие как ионы серебра, меди или золота, и антибиотики широкого спектра действия, например гентамицин в концентрациях, не токсичных для клеток.

Количественный и качественный составы получаемого после полимеризации фибринового сгустка, как носителя биологически активных компонентов, позволяет полностью исключить иммунный ответ организма реципиента. Это является следствием принципа аутотрансплантации. Введение в состав аутоплазмы антисептиков и/или антибиотиков широкого спектра действия, таких как, например, гентамицин, ампициллин, пенициллин в концентрациях, не токсичных для клеток, позволяет значительно уменьшить вероятность возникновения бактериальной инфекции в пораженной ткани. Также для уменьшения возможной гипоксии клеточных культур в состав аутоплазмы возможно добавление перфторана от 3 до 10% общего объема.

Получение клеточной культуры

Одним из источников получения клеток человека является костномозговая взвесь (КМВ), полученная путем пункции заднего гребня подвздошной кости. Эксфузия КМВ выполняется в соответствии с утвержденной методикой - Инструкция по заготовке аутологичного костного мозга от больных для клинического применения - Минздрав, №14/2 от 08.01.1980 г, методическими рекомендациями «Трансплантация костного мозга при острой лучевой болезни человека». - Минздрав от 03.11.1986 г., приказ «О внедрении в практику здравоохранения трансплантации костного мозга». - Минздрав, №31 от 25.02.1991 г.

Доставка КМВ в лабораторию производится в стерильном полимерном контейнере, содержащем антикоагулянт (обычно гепарин) строго с соблюдением асептики и температурного режима: контейнер с костномозговой взвесью помещают в транспортный герметично закрывающийся изотермический контейнер (2-4°С); длительность транспортировки составляет не более 2 часов.

Процессинг КМВ в лаборатории осуществляется в соответствии с рекомендациями «Инструкции по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов». - Минздрав №И-42-4-85 от 01.01.1986 г.

Источником мультипотентных мезенхимальных клеток может служить костный мозг, полученный у взрослого донора, в том числе для аутологичной трансплантации.

Также для получения мультипотентных мезенхимальных клеток используют жировую ткань, полученную у взрослых доноров путем липоаспирации по стандартной методике [10].

Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей, например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500 × g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.

Описанные методики выращивания ММСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых является стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается. Глутамин является питательной добавкой для поддержания процесса жизнедеятельности клеток.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных ММСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Создание суспензии клеточной культуры и аутоплазмы. ММСК, предназначенные для приготовления трансплантата, предварительно ферментативно дезагригируют трипсином и вносят из расчета 5-7 млн клеток на 1 мл обогащенной тромбоцитами плазмы. Суспензию клеток в аутогенной плазме, обогащенной тромбоцитами, получают путем простого смешивания клеточной взвеси и собственно плазмы, а при необходимости с добавлением всех дополнительных компонентов при тщательном перемешивании.

2. Подготовка матрицы-носителя. Матрикс в виде блоков, стружки или крошки материала на основе коллаген-минерального комплекса или биосовместимых полимеров (например, полилакдиды, полигликолиды, полигидроксиалканаты и им подобные, а также их сочетания) отмывают раствором Хэнкса с цефазолином (1 г/л). В емкости, предназначенной для изготовления трансплантата, размещают блок, крошку или стружку заданного размера и объема и еще не застывшую плазму, содержащую ММСК. Суспензию клеток в аутоплазме перемешивают с материалом. Затем по каплям добавляют раствор тромбина 50 Ед/мл на 10% растворе хлорида кальция до загустевания. Процесс полимеризации происходит при температуре 37°С в течение 30-40 минут. В дальнейшем полученную тканеинженерную конструкцию в виде биотрансплантата с застывшим фибриновым сгустком культивируют при 37°С в течение от 3 до 30 суток в остеогенной культуральной среде, которая может содержать преднизолон, витамин С, дексаметазон, витамин D (в виде различных изомеров) в зависимости от клинических задач.

Таким образом, продолжительность всего технологического процесса изготовления комплекса составляет от 3 до 30 суток. Полученный на этом этапе трансплантат может быть подвержен хранению при температуре 26-37°С в атмосфере воздуха, содержащего 2-7% СО₂, и насыщающей влажности в течение 3 недель.

Предложен способ лечения, характеризующийся тем, что, используя стандартные хирургические доступы, в дефект костной ткани вводят биотрансплантат, закрытие раневой поверхности также осуществляется по стандартным методикам. В зависимости от площади дефекта вводится на 1 см² пораженного участка от 1 до 5 мл полученного трансплантата.

Способ лечения подтверждается следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Пациентка Ю, 47 лет. Состояние после постэкстракционной иплантации в лунку остеогенного материала "BioOss", проведения через 6 месяцев после удаления зуба внутрикостной имплантации и удаления подвижного имплантата в области 47 через 1 месяц после имплантации. Имеется выраженное уменьшение ширины и высоты альвеолярного гребня. По данным КТ костная ткань в области удаленного имплантата имеет разрежения с включениями высокой плотности. В ноябре 2006 г. выполнена трансплантация биотрансплантата по изобретению, содержащего ММСК из жировой ткани в количестве 1 мл на 1 см² дефекта, в область альвеолярного гребня после удаления оставшегося материала "BioOss". При рентгенологическом исследовании через 1 и 3 месяца после трансплантации выявлено увеличение ширины и высоты альвеолярного гребня и равномерное увеличение плотности костной ткани. Швы сняты на 5 сутки, слизистая розового цвета, сохраняется незначительный послеоперационный отек. В феврале 2007 г.в области отсутствующего 47 был установлен имплантат NobielBioker.

ПРИМЕР 2

Пациент Э, 29 лет, в январе 2007 г. произведено удаление корней зубов 14 и 15, при ревизии раны обнаружена перфорация дна верхнечелюстной пазухи, отсутствие костных стенок с вестибулярной поверхности лунок удаленных зубов. Рана наглухо ушита с помощью перемещенного слизисто-надкостничного лоскута. Воспалительных явлений в верхнечелюстной пазухе у пациента не выявлено. Через месяц после удаления: высота и ширина альвеолярного гребня составляла 0,61 см и 0,59 см соответственно (по данным КТ), что недостаточно для установки внутрикостных имплантатов. В апреле 2007 г. пациенту была произведена операция по типу синус-лифтинга с трансплантацией биотрансплантата по изобретению в области дна пазухи, а также увеличение ширины альвеолярного гребня в месте удаленных зубов. Рана зажила первичным натяжением, швы сняты на 5 сутки. На КТ через 1 мес после проведения лечения: высота альвеолярного гребня составляла 2,44 см, а ширина 1,0 см. Через три месяца параметры артифициальной кости в области дна пазухи и альвеолярного гребня не изменились. В июле 2007 г. пациенту были установлены два имплантата Bicon. Костная стружка, полученная при формировании ложа имплантата, была направлена на гистологическое исследование. При гистологическом исследовании ткани, полученной из регенерата, обнаружена формирующаяся костная ткань.

ПРИМЕР 3

Пациентка П. 35 лет. Вторичная адентия 17, разрушение коронковой части 18. У пациентки хронический генерализованный пародонтит легкой степени в стадии ремиссии. Пациентке планировалось удаление 18 с одномоментным введением биотрансплантата по изобретению в лунку. В июне 2007 г.пациентке проведена трансплантация тканеинженерной конструкции в лунку удаленного в момент операции 18 зуба. На КТ, проведенной через три месяца после трансплантации: полностью восстановлена кортикальная пластинка в области удаленного 18 зуба. В сентябре 2007 г пациентке был установлены два имплантата Bicon в области 17 и 18 зубов. При гистологическом исследовании полученной из регенерата ткани обнаружена формирующаяся молодая костная ткань.

Вывод: изобретение позволяет получать биотрансплантат, использование которого ускоряет регенерацию костной ткани, уменьшает нежелательные побочные эффекты.

Список литературы

1. Григорьян А.С., Топоркова А.В. Проблемы интеграции имплантатов в костную ткань (теоретические аспекты). Техносфера. 2007 г. 130 с.

2. Патент РФ 2159101 от 25.03.99.

3. Патент РФ 2155024.

4. Fang В, Song Y, Lin Q, Zhang Y,Cao Y, Zhao RC, Ma Y. Human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as salvage therapy for treatment of severe refractory acute graft-vs.-host disease in two children. Pediatr Transplant. 2007 Nov; 11(7):814-7.

5. Патент РФ 2210352.

6. Патент РФ 2055535.

7. Stosich MS, Mao JJ. Adipose tissue engineering from human adult stem cells: clinical implications in plastic and reconstructive surgery. Plast Reconstr Surg. 2007 Jan; 119(1):71-83.

8. Пат.РФ 2210352.

9. Lendeckel S, Jödicke A, Christophis P, Heidinger K, Wolff J, Fraser JK, Hedrick MH, Berthold L, Howaldt HP. Autologous stem cells (adipose) and fibrin glue used to treat widespread traumatic calvarial defects: case report. J Craniomaxillofac Surg. 2004 Dec; 32(6):370-3.

10. Lipoabdominoplasty. Clin Plast Surg. 2008 Jan; 35(1):95-104.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани, характеризующийся тем, что содержит аутологичные или донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга или жировой ткани взрослых доноров, которые распределены в фибриновом сгустке в концентрации 5-7 млн клеток в 1 мл, представляющем собой полимеризованную обогащенную тромбоцитами плазму крови пациента, и матрицу-носитель, имеющую в основе своей структуры коллаген-минеральный комплекс, идентичный по составу натуральному костному материалу, или биосовместимый полимер. Изобретение обеспечивает создание биологического трансплантата для замещения костных дефектов, который способен встраиваться в новообразуемые ткани, стимулировать регенерацию тканей, являться источником молодости кости, что приводит к органотипической регенерации костной ткани в месте дефекта и полной деградации материала в заданные сроки с уменьшением побочных эффектов. 3 н. и 3 з.п. ф-лы.

1. Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани, характеризующийся тем, что содержит аутологичные или донорские мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из костного мозга или жировой ткани взрослых доноров, которые распределены в фибриновом сгустке в концентрации 5-7 млн клеток в 1 мл, представляющем собой полимеризованную обогащенную тромбоцитами плазму крови пациента, и матрицу-носитель, имеющую в основе своей структуры коллаген-минеральный комплекс идентичный по составу натуральному костному материалу, или биосовместимый полимер.

2. Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что в качестве биосовместимого полимера содержит полилактиды, полигликолиды, полигидроксиалканаты или их сочетания

3. Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что содержит ММСК из костного мозга или жировой ткани взрослого донора.

4. Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что в состав фибринового сгустка могут быть дополнительно внесены такие матриксные белки, такие как фибронектин, ламинин; ионы серебра, меди или золота; антибиотики широкого спектра действия, в концентрациях не токсичных для клеток; перфторан от 3 до 10% объема аутоплазмы.

5. Способ получения биотрансплантата для лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани по п.1, характеризующийся тем, что выделенные из костного мозга или жировой ткани ММСК, ферментативно дезагригируют трипсином и вносят из расчета 5-7 млн клеток на 1 мл аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы, перемешивают, при необходимости с добавлением дополнительных компонентов, полученную суспензию смешивают с материалом матрицы- носителя, представляющей собой коллаген-минеральный комплекс в виде блоков, стружки или крошки, отмытым раствором Хэнкса с цефазолином (1 г/Л), затем по каплям добавляют раствор тромбина 50 Ед/мл на 10% растворе хлорида кальция до загустевания и полимеризуют при температуре 37°С в течение 30-40 мин, полученный трансплантат культивируют при 37°С в течение от 3 до 30 сут в остеогенной культуральной среде.

6. Способ лечения, характеризующийся тем, что, используя стандартные хирургические доступы, в дефект костной ткани вводят биотрансплантат по п.1 в объеме, соответствующем дефекту, то есть 1 мл биотрансплантата на 1 см³ дефекта, после чего закрытие раневой поверхности также осуществляется по стандартным методикам.