3' И/ИЛИ 2'-АМИНО- ИЛИ ТИОЛМОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ, НУКЛЕОТИДЫ ИЛИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 1997 года по МПК C07H19/20 A61K31/70 

Настоящее изобретение относится к новым 3'-(2')-амино- или тиолмодифицированным и связанным с флуоресцентными красителями нуклеозидам, нуклеотидам, олигонуклеотидам, способу их получения и их применению.

Маркированные олигонуклеотиды в генотехнологии имеют чрезвычайно широкий спектр применения, так как использовать их легче, чем ДНА-зонды, применяемыми обычно в качестве проб гибридизирования, которые получают в результате рестрикционного расщепления переваривания природного генного материала.

Маркированные олигонуклеиды, которые используют в форме так называемых "антисенсов" ДНА-оликонуклеидов, могут регулировать происходящее в клетке и приобретать все большее значение, таким образом, например, для исследования in vivo экспрессии протеинов. Механизм протекает по сегодняшним представлениям через ДНА-ДНА, ДНА-РНА и РНА-РНА взаимодействия, но в частности еще не выяснен.

In vitro маркированные олигонуклеотиды служат, например, идентификации генфрагментов внутри генного банка тем, что с помощью маркированного олигонуклеотида зондируют и идентифицируют генные пробы генбанка.

Чтобы можно было провести такие опыты In vitro или in vivo олигонуклеотиды, нужно маркировать. Наряду с радиоактивной маркировкой с помощью подходящих изотопов применяют как форму нерадиоактивной маркировки производными флуоресцентными красителями, с которыми легче и безопасней работать.

До настоящего времени такая техника также уже успешно использовалась для нерадиоактивного получения последовательности ДНА. Здесь были проведены вставки, базирующиеся в основном на методе Сангера (F.Sanger, S.Nicklen, S. Coulson, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)).

Флуоресцентную метку помещают либо у 5'-конца олигонуклеотида (L.E.Hood, L. M.Smith and al. Природа 321, 674 (1986)), либо у нуклеоснования (J.M.Prober, V.L.Fraenor and R.J.Dam, Sciense, 238, 336 (1987), Anal. Chem. 62, 418 (1990)). Существенный недостаток последнего приведенного способа основан на том, что флуоресцентная метка вводится во время синтеза, т.е. во время полимеризации, а здесь специально во время ферментной полимеризации. Эта стадия способа позволяет сделать вывод, что только лишь некоторые полимеразы могут быть использованы для синтеза, что восприятие трифосфата с помощью полимеразы снижается и, кроме того, необходим больший избыток субстрата.

Введение флуоресцентной метки не ограничено однако определением последовательности по Сенгеру. Известно также химическое определение последовательности по Максам-Гилберту с флуоресцентной меткой (H.Voss, C.Schwager, U. Wirkner, B.Sproat, J.Zimmermann, A.Rosenthal, H.Erfle, J.Stegemann, W.Ansorge, Nucl, Acids Res.17, 2517 (1989)).

Аналогично описано также картирование рестрикционных фрагментов флуоресцентными детекторами (A.V.Carrano, J.Lamerdin, L.K.Ashworth, B.Watkins, E. Branscomb, T. Slegak, M.Raff, P.J. de Jong, D.Keith, L.Mc Bride, S.Meister, M. Kronick, Jenomics. 4, 129 (1989); S.Brenner, K.J.Livak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8902 (1989)).

Было обнаружено, что флуоресцентный краситель через амино- или тиоловую группу сочетается в 3'-(2')-позиции (в α- или b- положении) нуклеозида, нуклеотида или олигонуклеотида и это соединение можно применять преимущественно для синтеза последовательности в присутствии матрицы или олигонуклеотидов, а также для детекции генетического материала in vivo и in vitro.

Предметом настоящего изобретения является во-первых, вещество формулы I.

в которой R¹ означает пурин- или пиримидиновое основание, причем по меньшей мере один из остатков R² и R³ означает связанный через амино- или тиоловую группу флуоресцентный краситель в α- или b- положении и другой остаток означает при необходимости водород, гидроксильную группу, защищенную гидроксильную или метоксигруппу в a- или b- положении.

n является числом ≥0,
R⁴ 5' защитная группа или фосфат, пирофосфат, трифосфат,
R⁵ кислород, фторметилен, дифторметилен или метилен,
R⁶ гидрокси- или метоксигруппа или водород в a- или b-положении, при этом R¹, R⁵ и R⁶ могут иметь соответственно одинаковые или различные значения,
Y и Х означают кислород, серу, NH или метилен, причем Х и Y могут быть соответственно одинаковыми или различными. А также способ получения соединения 1, путем превращения находящейся в 3' и/или 2' положении ОН группы нуклеозида, нуклеотида или олигонуклеотида в амино- или тиол-группу и непосредственного после этого присоединения флуоресцентного красителя. Заявляется также применение соединений 1:
a) при синтезе последовательности в присутствии матрицы;
б) при синтезе определенных олигонуклеотидов;
в) при их детекции in vivo и in vitro;
г) при детекции нуклеиновых кислот in vivo и in vitro.

В дальнейшем изобретение описано более детально, в частности его предпочтительные формы осуществления. Кроме того, изобретение определяет содержание пунктов формулы изобретения.

Соединения общей формулы I синтезируют в основном известными из литературы методами (M.Gait, Oligonucleotide Synthesis JRL-Press, Oxford, 1984).

Для присоединения красителя к 3'- и/или 2'-позиции исходят из соединения формулы II, предпочтительно из нуклеозида.

Для присоединения используют соединение формулы II, в которой R¹ - R⁶, Х, Y и n имеют вышеуказанные значения, при этом заместители могут быть одинаковыми или различными и R⁷ или R⁸ означают водород, гидроксильную или защищенную гидроксильную или метоксильную группу. Присоединение красителя происходит 3'- и/или 2'-гидроксильную группу с помощью введения амина или тиола.

Для введения азида в положение 3' (2') вводят группы Левинга. В качестве группы Левинга предпочтительны трифлат или мезилат или тозилат. В результате нуклеофильного воздействия азидом, предпочтительно азидом лития, происходит введение азида. Нуклеофильное воздействие тиолатом или S-защищенным тиолатом дает тиол или защищенный тиол.

Целевая стереохимия в сахарной части нуклеозида может быть лучше всего достигнута с помощью SN² замещения.

Аминогруппу получают через азид и последующее восстановление до амина (W. S. Mungall, R. L. Letsinger, J. Org, Chem. vol.40, N 11, 1659 (1975)). Предпочтительна на этой стадии реакция Штаудингера с трифенилфосфином и водой (M.May, J.W.Engels, Nucl. Acids, Res, 17, 15, 5973 (1989)).

Все соединения были охарактеризованы с помощью ЯМР-спектроскопии, элементного анализа, УФ-, ИК- и пр.

По окончании поликонденсации свободная 3'-(2')-амино- или тиоловая группа сахарной части у 3'-конца ДНА может взаимодействовать с реакционноспособным флуоресцентным красителем, по способу, известному из литературы (Hunkapeller, Nucl. Acids, Res. 13, 2399, 1985; Hodges R.R. et al. Biochemistry Vol. 28, 261 (1989)).

Альтернативной является получение аминогруппы по реакции Мицуноби (Synthesis, том. 1, 1981, стр. 1), и соответственно по реакции, описанной Ямамото и др. (J.Chem, Soc. Perk, Trans. 1, 306, 1980)).

Сочетание флуоресцентного красителя через тиоловую группу осуществляют аналогичным способом. Однако вместо азидной вводят тиоловую группу в защищенной или незащищенной форме.

Присоединение флоуресцентного красителя к свободной амино- или тиоловой группе нуклеозида, нуклеотида и олигонуклеотида можно альтернативно осуществлять также лишь после их применения. Например, можно проводить реакцию флюоресцентного красителя после стадии терминации ДНА- или РНА-реакции определения последовательности тем, что маркируют общую вставку флуоресцентным красителем.

В качестве флуоресцентного красителя можно применять в принципе все доступные торговые красители, которые реагируют с амино- или тиоловыми группами, предпочтительны флуоресценты, родамины, тексасрот, NBD (4-фтор-7-нитробензофуразан, фирмы Сигма), кумарины, флурескамины, сукцинилфлуоресцины и данзилы.

Реакционную смесь производных можно разделить с помощью хроматографии и детектировать с помощью фотометрии или лазерной спектроскопии (Н.S.Swerdlav, R. Yesterland, Nucl, Acids, Res. 18, 1415 (1990)). Оказалось очень эффективным использование капиллярной электроскопии (A.S.Coben et al. P.N.A.S. US. 85, 9660 (1988), например, с акриламидным гелем. Детекцию осуществляют тогда предпочтительно на выходе из капилляра (H.Swerdlow, S.Wu et al. Chromatography, 516, 61 (1990)).

Исходя из соединения формулы I, которое имеет в положении 5' трифосфат, можно с помощью любого праймера и матрицы с помощью полимеразы, т.е. энзима, который синтезирует в присутствии подходящего субстрата верную, комплементарную копию последовательности, проводить в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов синтез ДНА-двойных последовательностей, предпочтительно с помощью Т7- или Тао полимеразы, ДНА-полимеразы 1 и обратимой транскриптазы. В качестве 5'-защитной группы пригодны тритил, метокси- или диметокситритил (Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL-Press, Oxford 1984).

Терминацию синтеза можно специфически определять соответственно путем исследования 3'- (2')-аминомодифицированного А, СG, T-нуклеотида формулы I. Для синтеза ДНА-последовательности в присутствии матрицы и следовательно также для последовательности ДНА это имеет особое значение, так как использование модифицированного нуклеотида обеспечивает специфическую терминацию реакции.

Синтезы РНА-нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов осуществляют таким же образом.

Кроме того, возможен синтез производных олигонуклеотидов с помощью исходного нуклеотида, который у 3'- (2') конца амино- или тио- изменен и зафиксирован на полимерном носителе.

В качестве олигонуклеотидов пригодны все употребительные ДНА- и РНА-нуклеотиды, однако предпочтительны с длиной 2-100, и особенно предпочтительны 12 50 нуклеотиды (химический синтез) или с длиной около 3000 нуклеотиды (ферментативный синтез), в зависимости от эффективности применяемой полимеразы.

Синтез олигонуклеотидов протекает, исходя из комплекса исходного нуклеотид-носителя, в обычном смысле, т.е. в 3'- и 5'-направлении и делает возможным синтез олигонуклеотида оределенной последовательности.

Фиксирование исходного нуклеозида на носителе осуществляют через спейсер, который отщепляется после синтеза, например, через известное из литературы соединение янтарной кислоты или через сочетание с уретаном (Efimow, Nuch. Acids, Res. 11, 8369, 1983).

По окончании синтеза олигонуклеотид с подходящими реагентами отщепляют от носителя. Дериватизацию любым флуоресцентным красителем можно осуществлять непосредственно после этого.

Синтезированные таким образом и модифицированные у 3'-(2')- конца олигонуклеотиды можно затем применять для детекции, например, комплементарных олигонуклеотидов.

Изобретение имеет следующие преимущества.

1) При получении маркированной последовательности осуществляют одновременно разрыв последовательности с помощью оканчивающегося 3'-(2')-амино- или тиолмодифицированного нуклеотида.

С помощью маркировки флуоресцентного красителя его в положении 3'-(2') возможна, кроме того, безопасная детекция.

2) При получении точно определенных олигонуклеотидов с помощью маркировки связанного с носителем и также 3'-(2')-амино- или тиолмодифицированного исходного нуклеотида связан точный синтез олигонуклеотида с возможностью флуоресцентной маркировки и таким образом с детекцией.

В нижеприведенных примерах изобретение поясняется подробнее.

Примеры.

1. Аномеры 3'- или 2'-амино- или азидо-нуклеозид-5'-трифосфатов.

Пример 1.

Синтез 5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-тимидина.

Схема

5'-монофосфат-3'-азидо-3'-дезоксирибозид-тимидин.

3'-Азидотомидин (Сигма) (160 мг, 0,6 ммол) при перемешивании растворяют в 10 мл триэтилфосфата. Через капельную воронку добавляют раствор при 4^oC 0,2 мл РОСl₂ в 6 мл триэтилфосфата. Через 24 часа нейтрализуют 50 мл насыщенного раствора NaHCO₃ и дважды встряхивают с 60 мл толуола и 100 мл эфира. Водную фазу разбавляют дистиллированной водой до объема 500 мл и подают на колонку с анионообменной смолой (сефадекс А-25; 50х2,5 см), которую заполняют 200 мл 0,2 М ТБК-буфера (буфер-триэтиламмонийбикарбонат) pH устанавливается самостоятельно 7,5) с НСО₃ в качестве противоположного иона. Затем очищают пропусканием 300 мл дистиллированной воды и элюируют сначала 200 мл 0,1 М буфером ТБК и затем линейным градиентом 0,1-0,2 М буфера ТБК (общий объемный градиент 1350 мл). В хроматограмме имеется один пик, который является пиком продукта. Продукт элюируют при концентрации буфера от 0,12 до 0,15 М. Положительные 20 мл фракции тонкослойной хроматографии соединяют и испаряют при сушке вымораживанием. Триэтиламмонийбикарбонат удаляют путем многократного добавления этанола. Продукт получают в виде белой кристаллической соли триэтиламмония.

Выход: 220 мг /56,2/, М.в. 651,81; R₁ /аммиак: изопропанол:вода 10:70: 20/; 0,40; 300 МГц-¹Н-ЯМР /D₂O/:1,36/т, 3Н, СН₃/; 1,90 /с, 3Н/CH₃/, 2,50 /м, 4Н, 2', 2''-H/; 3,18-3,50 /дд, 2Н, СН₂/; /4,10/ м, 1Н, 4'-H/; 4,3 /м, 1Н, 3'-H/; 6,31 /т, 1Н, 1'-H/; 7,7 /с, 1Н, 6-Н/; 11,50 /с, 1Н, NH/; 300 МГц-³¹P-ЯМР /85%-ная Н₃PO₄, наружн, D₂O/: 1,23 /с, 1Р/.

5'-Трифосфат-3'-азидо-3'-дезоксирибозид-тимидин
5'-Монофосфат-3'-азидо-3: 2'-дезоксирибозид-тимин в виде триэтиламмониевой соли (130 мг, 0,2 ммол) растворяют в 6 мл абс диметилформамида и добавляют при 25^oC раствор N',N'-карбонилдиимидазола (162, 15 мг, 1 ммол) в 3 мл абс. диметил-формамида при перемешивании. Через 2 часа добавляют 1 мл абс метанола, перемешивают еще 15 минут и метанол отгоняют. Остаток смешивают с 5 мл 0,2 ммол раствора три-н-бутиламмоний-пирофосфата в диметилформамиде и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Отфильтровывают осадок, состоящий из имидазолпирофосфата, промывают 20 мл диметилформамида и фильтрат испаряют на роторном испарителе. Остаток растворяют в 250 мл 0,1 М ТБК-буфера и подают раствор на колонку с анионообменным сефадексом А-25, заполненным НСО₃-. Продукт очищают пропусканием 200 мл дистиллированной воды и элюируют ТБК-буфером с линейным градиентом от 0 до 0,5 М (общий объемный градиент 200 мл). В хроматограмме оказалось два пика, из которых первый дает монофосфат, а второй продукт. Продукт элюируют при концентрации буфера от 0,30 до 0,36 М. Положительные 20 мл фракции соединяют и испаряют при вымораживании. Триэтиламмонийбикарбонат удаляют многократным добавлением этанола. Продукт представляет собой белую кристаллическую соль триэтиламмония.

Выход: 92 мг /50,4%-ный); М.в. 911,95; R₁ /аммиак: изопропанол: вода 10: 70: 20/; 0,14; 300 МГц-³¹P-ЯМР /85%-ная Н₃PO₄, наружн. D₂O/, 10,74 /д, ²Jpp= 22,1 Гц, 1Р, альфа-Р-атом/; 11,45 /д, ²Jpp= 21,9 Гц, 1Р, гамма-Р-атом/; 22,99 /т, ²Jpp=30,3 Гц, 1Р, бета-Р-атом/.

5'-Трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-тимидин
5'-Трифосфат-3'-азидо-3', 2'-дезоксирибозид-тимин (68 мг, 0,075 ммол) растворяют в 5 мл смеси диоксана и дистиллированной воды (2:1) и при перемешивании при комнатной температуре смешивают с трифенилфосфином (200 мг, 0,75 ммол). Реакционную смесь перемешивают при 25^oC в течение 30 часов и после этого растворитель отгоняют. Остаток растворяют в 30 мл дистиллированной воды и трижды экстрагируют порциями по 30 мл эфира. Водную фазу разбавляют до 150 мл и подают раствор в колонку с анионными ионообменником сефадексом А-25, заполненным HCO-3

. Продукт очищают пропусканием 200 мл дистиллированной воды и элюируют ТБК-буфером с линейным градиентом от 0 до 0,5 М (объемный градиент 2000). Хроматограмма имеет три пика, из которых первый соответствует соединению монофосфата 6, второй продукту и третий пик аддукту 7. Продукт элюируют при концентрации буфера от 0,40 до 0,42 М. Положительные 25 мл-фракции соединяют и испаряют путем высушивания замораживанием. Триэтиламмонийбикарбонат удаляют добавлением этанола. Продукт представляет собой белую аморфную соль триэтиламмония.

Выход: 57 мг /85,7%-ный/; М.в. 885,90; R₁ /аммиак: изопропанол вода 10: 70: 20/, 0,08; 300 МГц-¹H-ПМР /D₂O/: 1,30 /т, 3Н, СН₃/, 1,92 /с, 3Н, СН₃/, 2,64 /м, 4Н, 2, 2''-H/; 3,19-3,21 дд, 2Н, СН₂/ 4,26 /м, 1Н, 4'-Н/, 4,41 /м, 1Н, 3'-H/, 6,34 /т, ³Jнн 6,74 Гц, 1Н 1'-Н/, 7,69 /с, 1Н, 6-Н/, 11,50 /с, 1Н, ПН/, 300 МГц-³¹P-ПМР/ 85%-ная Н₃PO₄ наружн. I₂O/, -10,75 /д, ²Jpp=22 Гц, 1Р, альфа-Р-атом, -11,45 /д, ²Jpp=21,9 Гц, 1Р, гамма-Р-атом/, -22,05 /т, ³Jpp= 20,4 Гц, 1Р, бета-Р-атом/.

Пример 2.

Синтез 1-(3'-амино-2', 3'-дидезокси-5'-трифосфат-1-треопентофуранозид)-тимина.

Схема

1-(3'-Азидо-2', 3'-дидезокси-5'-0-диметокситритил-β-D-треоппентофуразин) -тимин.

К раствору 5'-диметокситритилтимидина (получение описано в M.Gait, Oligonucleofide Syuthesis, IRL, Press 27 (1984)) (5,98 г, 11 ммол), трифенилфосфина (3,076 г, 11,73 ммол) и азида лития (3,1 г, 55 ммол) в 37 мл сухого диметилформамида добавляют при перемешивании четырехбромистый углерод (11,91 ммол, 4,10 г). Реакционную смесь перемешивают 56 часов при комнатной температуре и добавляют затем 15 мл метанола. Продукт непосредственно после этого выливают в 800 мл охлажденной льдом дистиллированной воды. Осадок вносят в хлороформ и очищают тонкослойной хроматографией (этилацетат:н-гексан 3: 1). Значение R₁ хлороформ: метанол 9:1 0,52. ИК (см^-1): 2100 азид, выход 80% 4,95 г.

1-(3'-Амино-2'-3'-дидезокси-5'-0-диметокситритил-b-D -треопентофураноксид)-тимин.

К перемешиваемому раствору 1-(3'-азидо-2',3'-дидезокси-5'0-диметокситритил-b-D -треопентофуранозил)-тимина (0,5 г, 0,8 ммол) добавляют 0,15 г трифенилфосфина (1,3 г, 4,94 ммол) и оставляют для взаимодействия на 4 часа. Для гидролиза фосфинимина смешивают с 3 мл дистиллированной воды и перемешивают еще 3 часа. После отгонки растворителя на роторном испарителе оставшееся масло очищают тонкослойной хроматографией (хлороформ:метанол=99:1+1% триэтиламина). Значение R₁ в таком же элюенте=0,27. Амин в результате обработки нингидрином в тонкослойной хроматографии окрашивается в фиолетовый цвет. Выход 87,5% 0,42 г. Продукт дает соответствующий ¹Н-ПМР-спектр.

Взаимодействие до 1-(3'-амино-2',3'-дидезокси-5'-трифосфат-b-D-трепентофуранозил)-тимина.

Для взаимодействия до 5'-трифосфата удаляют диметокситритильную группу по аналогии с описанным M. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL, Press, 49 (1984) и проводят присоединение трифосфата в 5'-положение, как описано в примере 1.

Пример 3.

Получение 2'-амино-2'-дезокси-5'-трифосфат-уридина.

Схема

(2,2'-ангидро-1-β-арабинофуранозид)-урацил.

К раствору 19 г (77,8 ммол) уридина и 22,2 г (103,6 ммол) дифенилкарбоната в 75 мл абсолютного диметилформамида добавляют 0,5 г (5,93 ммол) гидрокарбоната натрия. После полного растворения нагревают бесцветную прозрачную жидкость до температуры 150^oC за 30 минут. После охлаждения прозрачный раствор вливают в абсолютный эфир. Эфир отделяют от выпавшего осадка и сырой продукт перекристаллизовывают из 1650 мл метанола. После высушивания получают белый, кристаллический порошок.

Т. пл. 239^oC; Масс-спектр 227, R₁-значение 0,31 метиленхлорид/метанол 8: 2. Выход 9,22 г (52,3%). ¹Н-ЯМР 60 МГц соответствует литературным данным.

2'-Азидо-2'-дезокси-уридин.

1,16 г (10 ммол) (2,2'-ангидро-1-b-арабинофуранозил)-урацила и 3,5 (71,7 ммол) соли лития при перемешивании помещают в 25 мл абсолютного 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2-(1Н)-пиримидинола. Суспензию нагревают до 120^oC, при этом реакционная смесь окрашивается в черный цвет. Через 3 дня черный раствор разбавляют 80 мл воды и экстрагируют 2 раза 100 мл метиленхлорида. Соединенные органические фазы промывают еще четыре раза водой и испаряют на роторном испарителе. Твердый чаеобразный остаток очищают с помощью колоночной хроматографии с силикагелем (метиленхлорид/метанол 8:2). После испарения черный маслянистый остаток очищают еще дважды через силикагель (ацетон:метанол 8:3 и ацетон:этилацетат 1:1). Получают с помощью тонкослойной хроматографии однородное бесцветное стекло (значение R₁ метиленхлорид/метанол 8:1= 0,61). Выход 2,035 г (30%). ИК (пленка хлороформа) 2120 см^-1. Масс-спектр (FAB-:270. Продукт имеет ожидаемый спектр ¹-ЯМР.

Получение 2'-амино-2'-дезокси-5'-трифосфат-уридина осуществляют путем селективного 3'-ацилирования гидроксильной функции. Введение 5'-трифосфатной группы проводят непосредственно после этого по аналогии с примером 1. После деацилирования в положении 3'-азид восстанавливают в результате взаимодействия с трифенилфосфатом (как в примере 2) до амина.

Пример 4. Синтез 3'-амино-2',3'-дидезокси-5'-трифосфат-аденозина.

Схема

N⁶-Бензоил-9-(5-0-бензоил-2-дезокси-β-D-трео -пентофуранозил)аденин.

Суспензию 920 мг (2 ммол) N⁶, 5'-0-дибензоил-2'-деоксиаденозина (был получен методом, описанным Nishino, Nucleosides and Nucleotides 1986, 5, 159) в 30 мл абсолютного дихлорметана (содержит 2 мл пиридина) охлаждают до -30^oC и медленно по каплям добавляют в 5 мл раствора ангидрида трифторметансульфокислоты в дихлорметане (10 об.). После удаления охлаждающей бани раствор нагревается и в него добавляют 1 мл воды. Через 3 часа добавляют еще 5 мл воды и органическую фазу промывают. После удаления растворителя оставшийся остаток растворяют в 50 мл метанола и добавляют 100 мг бикарбоната натрия. Перемешивают еще 2 часа при комнатной температуре, нейтрализуют 10% -ной уксусной кислотой, отгоняют растворитель и очищают колоночной хроматографией через силикагель смесью хлороформ:метанол 97:3. Выход 710 мг (1,48 ммол) 75% Значение R₁ хлороформ:метанол 97:3=0,49. Масс-спектр 459.

3'-Азидо-2',3'-дидезоксиаденозин.

Раствор 920 мг (2 ммол) N⁶-бензоил-9-(5-0-бензоил-2-деокси-b-D-треопентофуранозил)-адеина в 20 мл абсолютного дихлорметана (и 2 мл пиридина) охлаждают до -30^oC. Затем прикапывают 5 мл (3 ммол) раствора ангидрида трифторметансульфокислоты в абсолютном дихлорметане. Удаляют охлаждающую баню, перемешивают еще 20 минут и добавляют к реакционной смеси 980 мг (20 ммол) азида лития в 20 мл диметилформамида. Через дополнительных 2 часов перемешивания при комнатной температуре добавляют 50 мл воды и 150 мл хлороформа, органическую фазу встряхивают и промывают дистиллированной водой. Удаляют растворитель на ротаторе и обрабатывают для удаления основной защитной группы в течение ночи аммиачным раствором метанола. После нового удаления растворителя очищают с помощью колоночной хроматографии (хлороформ:метанол 95:5) через силикагель. Выход 430 мг (1,6 ммол, 79%), белый кристаллический порошок. ИК 2100 см^-1 азидо-група.

3'-Амидо-2',3'-дидезокси-5'-трифосфат-аденозин.

Получение 5'-трифосфата осуществляют по аналогии с примером 1. Непосредственно после этого азид восстанавливают до амина по аналогии с примером 2.

Пример 5.

Синтез 3'-амино-2',3'-дидезокси-5'-трифосфат-гуанозина.

Схема

Получение 3'-амино-2', 3'-дидезокси-5'-трифосфат-гуанозина осуществляют исходя N²-изобутирил-5'-0-бензоил-2'-дезоксигуанозина (см. Nucleosides Nucleotides, 5, 159, 1986). Взаимодействие нуклеозида до 3'-азида происходит по аналогии с получением по примеру 4. Следует обратить внимание при этом на то, что обработку аммиачным раствором метанола не нужно проводить, так как удаление изобутирильной защитной группы имеет место лишь после введения трифосфатной группы и перед восстановлением азида до амина. Взаимодействие трифосфата в случае гуанозина происходит также по методу, описанному в примере 1. Восстановление до амина описано в примере 2.

2 Синтез 3'-амино-олигомеров и последующая маркировки 3'-флуоресценом.

Пример 6.

Синтез олигомера из 20 нуклеотидов.

3'-H₂N-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-5' осуществляют, исходя из 3'-амино-3'-дезокси-тимидина, защищенного 5'-диметокситритилом. Получение этого соединения проводят по описанию примера 1. При этом исходят из азидо-3'-дезоксирибозид-тимидина, защищенного 5'-диметокситритилом, который получают из азидо-3'-дезоксирибозид-тимидина и диметокситритилхлорида по методу Гайта (Oligonucleotide Synthesis, IRL, Press 1984, 27).

Непосредственно после этого, соединение восстанавливают трифенилфосфином, как описано в примере 1. Следующей стадией является получение материала-носителя. Для этого берут 200 мг 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-амино-3'-дезокси-тимидина в 700 мкл абсолютного пиридина. К этому раствору добавляют 45 мг диметиламинопиридина и непосредственно после этого 40 мг ангидрида янтарной кислоты. После стояния в течение ночи гидролизуют добавлением 10 мкл волы оставшегося непрореагировавшего ангидрида янтарной кислоты. Трижды экстрагируют толуолом и остаток вносят в 12 мл метиленхлорида, промывают 4 мл холодной лимонной кислоты (10%-ной) и дважды 4 мл воды. Органическую фазу высушивают над сульфатом натрия, испаряют растворитель и растворяют вещество в 1 мл метиленхлорида. Этот растворитель медленно при перемешивании прикапывают в 30 мл н-гексана. Выпавший осадок отсасывают и высушивают при 40^oC в вакууме масляного насоса.

Дальнейшее приготовление материала-носителя на СРG-основе проводят по стандартным методикам и для получения олигомера из 12 нуклеотидов и обрабатывают далее стандартным методом (АВ1 380А User Bulletin, Issue N 36, июль 1986) на АВ1 380 А ДНА-синтезаторе по способу фосфорамидита. После удаления защитной группы и отщепления 3'-аминоолигонуклеотида от носителя проводят очистку и охарактеризовывают в соответствии со стандартом. Лучшие результаты были получены при этом в результате неустойчивого в основаниях метода сочетания для связывания с носителем. Благоприятным является замещение подлежащего отщеплению амида кислоты с помощью уретановой функции, как это описано Ефимовым (Nucleic Acid Res 11, 8369, 1983).

Пример 7.

Синтез олигомера из 23 нуклеотидов с 3'-аминоконцами 3'-H₂N-ACACCCAATTCTGAAAATGGAT-5'осуществляют по описанию примера 6. Очистку и идентификацию проводят по стандартным методикам.

Пример 8.

Последующую дериватизацию олигомеров до 3'-амино-производного проводят с флуоресцентным изотиоцианатом (FITC). 50 ммол 3'-аминоолигонуклеотида в сосуде Еппендорфа растворяют в 25 мкл 500 ммол раствора гидрокарбоната натрия. Добавляют 20 мкл 300 ммол раствора флуоресцентного изотиоцианата в диметилсульфоксиде. Через 6 часов реакции при комнатной температуре реакционную смесь очищают путем пропускания в 20 ммол раствора ацетата аммония через сефадекс G 25 в колонке. 3'-FITC олигомер анализируют с помощью хроматографии под давлением с помощью флуоресцентного определения, так и с помощью УФ-определения. Результаты хроматографии были подтверждены также с помощью анализа на капиллярном гельэлектрофорезе (фирма Дионекс).

Формула флуоресцентного изотиоцианата

Пример 9.

Оба 3'-аминоолигомера из примера 6 и 7 по методу, описанному в примере 3, были подвергнуты взаимодействию с родамин- и тетраметилродамин-изотиоцианатом, 3'-флуоресценмаркированные олигомеры анализировали с помощью хроматографии под давлением флуоресцентным определением, так и через УФ-определением. Результаты хроматографии были подтверждены также с помощью анализов капиллярного гельэлектрофореза (фирма Дионекс).

Формула красителя родамин и тетраметилродаминизотиоцианата:

Пример 10.

Оба 3'-аминоолигомера из примера 6 и 7 по методу, описанному в примере 3, подвергали взаимодействию с изображенным ниже производным кумарина. 3'-флуоресценмаркированный олигомер анализировали с помощью хроматографии под давлением с флуоресцентным определением и УФ-определением. Результаты были подтверждены также анализом с помощью капиллярного гель-электрофореза (фирма Дионекс).

Формула молекулы кумаринового красителя:

3. Встраивание модифицированного нуклеотида с помощью ДНА-полимеразы и анализ секвинирования.

Для испытания акцептации аминотрифосфата с помощью доступного энзима для секвенирования получали соответствующие конечные растворы и полимеразы испытывали (Кленов, Боерингер; Таg, Амершам; Т7, Фармация, секвуеназа. USB). При этом норму построения и терминационные свойства трифосфата анализировали как классическим способом, так и маркировкой флуоресцентными кpасителями.

Пример 11.

Полученный в соответствии с примером 1 5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-тимидин заменяют 2', 3'-дидезокси-5'-трифосфат-тимидином. Это осуществляли со всеми терминационными растворами всех выше указанных полимераз. Были апробированы соответственно эквимолярные, в десять раз больше и в десять раз меньше соотношения dNTP/терминатор. Изменение последовательности проводили по стандартным методикам. При этих исследованиях в результате встраивания альфа -³⁵-S-dATP определяли авторадиографически. Оказалось, что: а) 3'-амино-нуклеотид действует терминирующе на применяемый энзим, б) норма построения в случае Т7, Tag и секвеназы идентичны обычным дезокситерминаторам, в) наконец, можно проводить с аминонуклеотидом беспроблемно изменение последовательности.

Пример 12.

Соединение 5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-тимидин было подвергнуто взаимодействию с флуоресцентным изоцианатом до 5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-3'-N-флуоресцентный изоцианат-тимидина.

5'-Трифосфат-3'-амино-3', 2'-дезоксирибозид-тимидин (2,5 мг, 2,8 мкмоль) растворяют в сосуде Еппендорфа в 200 мкл дистиллированной воды и смешивают с 200 мкл 1 мол буфера Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH9). Реакционную смесь защищают от дневного света оберткой из алюминиевой пленки и добавляют 100 мкл-овой пипеткой 80 мкл раствора флуоресцентного изотиоцианата (10 мг в 1 мл диметилформамида). Через 10 минут времени реакции при комнатной температуре в тонкослойной хроматографии количественно взаимодействует продукт присоединения. Очистку проводят с помощью гельфильтрации. Колонку с сефадексом G-10 защищают оберткой из алюминиевой пленки от света, непосредственно после этого реакционный продукт наносят на материал колонки и элюируют водой со скоростью ее пропускания 1 мл/мин. Хроматограмма показывает два пика. Первый пик соответствует продукту, второй непрореагировавшему красителю. Величина фракции составляет 5 мл, всего было получено 24 фракции. По данным хроматограммы 4 фракции отказались положительными. Это было установлено с помощью тонкослойной хроматографии. Растворитель испаряют с помощью лиофилизации и хранят вещество при -80^oC. Выход 3,32 мг (93%). М.вес 1,274,32, R₁ /аммиак: изопропанол: вода 10:70:60); 0,62; флуоресцентный эмиссионный спектр: длина волны пропускаемого света составляет 420 нм. Эмиссионный максимум соединения лежит при 514,8 нм. Замерен был 2,5 ммол раствора в дистиллированной воде. Эмиссионный максимум 2,5 ммол раствора недериватизированного красителя в дистиллированной воде лежит при длине полны 519,4 нм.

Полученный 5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-3'-И-флуоресцентный изотиоцианата-тимидин был заменен 2', 3'-дидезокси-5'-трифосфат-тимидином. Это проводили со всеми терминационными растворами вышеуказанных полимераз. Были опробированы соответственно эквимолярные, на порядок большие и на порядок меньшие соотношения dNTP (терминатор. Изменение последовательности проводили по стандартным методикам. В случае этих исследований с помощью введения альфа -³⁵-S-dATP определяли авторадиографически. Оказалось, что: а) 3'-флуоресцентно маркированный нуклеотид действует терминирующе на применяемый энзим, б) порядок введения в случае Т7, Tag и секвеназы благодаря стерически затрудненному остатку красителя при в десять раз большей концентрации к обычным дидезокситерминаторам являются идентичными, в) могут быть проведены в 3'-флуоресцентно маркированным терминатором без изменения последовательности.

Пример 13.

Указанный 5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-3'-N-флуоресцентный изотиоцианат-тимидин был заменен 2', 3'-дидезокси-5'-тиофосфат-тимидином. Это происходит в терминационных растворах Т7 и Таg полимераз. Были использованы в десять раз большие соотношения dNTP/терминатор. Изменение последовательности было проведено по стандартным методикам. При этих исследованиях оказались от введения альфа -³⁵-S-dATP и анализ последовательности был успешно осуществлен с 3-флуоресцентно маркированным терминатором на коммерчески доступной ДНА-последовательности.

Пример 14.

Синтез 5'-трифосфат-3'-тио-3'-дезоксирибозид-тимидина.

Схема

5'-0-Диметокситритил-3'-S-бензоил-тиотимидин.

Введение серы в 3'-позицию осуществляют с помощью замещения отщепляемой группы (мезилат) натрийтиобензоатом.

Синтез натрийтиобензоата осуществляют добавлением 10 мол NaOH к охлажденному раствору тиобензойной кислоты (10 г) в 15 мл воды до тех пор, пока раствор не станет щелочным. Непосредственно после этого рН раствора доводят до 7 добавлением водным раствором тиобензойной кислоты, охлаждают до -5^oC и раствор фильтруют для удаления твердого остатка. После удаления воды на роторном испарителе с этанолом желтую соль высушивают в вакууме над пентаоксидом фосфора. Раствор 5'-0-диметокситритил-3'-0-метансульфонил-2'-деоксиксило-тимидина (8,45 ммол) (синтез мезилата: Мюллер, Фокс (1964), J.Org. Сhem. 29, 1772) и тиобензоата натрия (33 ммол) в диметилформамиде (30 мл) перемешивают 4 часа при 100^oC. Реакционный раствор встряхивают с дихлорметаном и органическую фазу промывают насыщенным раствором NaHCO₃ и насыщенным раствором NaCl. После высушивания органической фазы маслянистый сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии (силикагель 60Н, хлороформ/метанол 0-10%).

Выход 60% продукт имеет ожидаемый ¹Н-ЯМР/спектр.

5'-Диметокситритильную защитную группу для фосфитилирования в положении 5' отщепляют известными из литературы методами (M.Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL, Press, 1984). Непосредственно после этого 5'-трифосфат получают по методу Экштайна и Людвига (J.Org. Chem. 1989, том. 54, N 3, 631) с салицилфосфорхлоридом (Олдридж) и обработкой пирофосфатом. Тиол выделяют в результате реакции с 10 мол NaOH в аргоне насыщенным этанолом (R.Cosstick, Nucleic Acids Research, 18. 4, 829).

3'-Тио-5'-трифосфат-тимидин по методу примера 8 сочетают с иодацетамидфлуоресцеином и получают на этой стадии 80%-ный выход флуоресцентно маркированного тионуклеотида.

Пример 15.

Синтез 1-(3'-тио-2', 3'-дидеокси-5'-трифосфат-β-D-треопентофуранозил)-тимидина.

Схема

Исход из 5'-ДМТ-0,3'-0-мезил-тимидина, как описано в примере 14, замещают тиобензоатом натрия, Непосредственно после этого осуществляют отщепление 5'-защитной группы, введение 5'-трифосфата, выделение тиола и присоединение иодацетамидфлуоресцена по аналогии с описанным в примере 14.

Пример 16.

Синтез олигомера из 10 нуклеотидов 3'-β-H₂N-TTTTTTTTTT-5'.

Синтез олигомера 3'-b-Н₂N-TTTTTTTTTT-5' осуществляют исходя из 1-(3'-амино-2', 3'-дидезокси-5'-ДМТр-5-1-треопентофуранозил)-тимина, который подвергают взаимодействию по аналогии с описанным в примере 6 до материала носителя для фосфорамидитного способа. Последующую флуоресцентную маркировку осуществляют 3'-b-амино -олигонуклеотида с флуоресцентным изотиоцианатом по примеру 8.

Использование: для синтеза противожгутов или для определения генетического материала. Сущность: продукт 3' и/или 2'-амино- или тиолмодифицированные нуклеозиды, нуклеотиды или олигонуклеотиды общей формулы 1

где R¹ - пуриновое или пиримидиновое основание, один из R² и R³ - связанный через амино- или тиоловую группу флуоресцентный краситель в α- или b- положении, а другой - водород, гидроксигруппа, защищенная гидрокси- или метоксигруппа в a- или b- положении, n - число от 0 до 10, R⁴ - 5'-защитная группа, фосфат, R⁵ - гидрокси- или метоксигруппа или водород в a- или b- положении Y и Х - кислород или сера. Продукт получают превращением в соответствующий азид или тиол и восстановлением азида в амин с последующим присоединением к амино- или тиоловой группе флуоресцентного красителя (родамина, кумарина).

1. 3' и/или 2'-амино или тиолмодифицированные нуклеозиды, нуклеотиды или олигонуклеотиды общей формулы I

где R₁ пуриновое или пиримидиновое основание;
по крайней мере один из R₂ и R₃ связанный через амино- или тиоловую группу флуоресцентный краситель в α- или β- положении, а другой водород, гидроксигруппа, защищенная гидрокси- или метоксигруппа в α- или β- положении;
n число от 0 до 10;
R₄ -5'-защитная группа, фосфат;
R₅ гидрокси- или метоксигруппа или водород в α- или β- положении;
Y и Х кислород или сера. 2. Способ получения соединений общей формулы I по п.1, отличающийся тем, что в соединении общей формулы II

где R₁ R₅, X, Y и n имеют указанные значения;
R₆ и R₇ водород, гидрокси- или защищенная гидрокси- или метоксигруппа,
ОН-группу в положении 3' и/или 2' нуклеозида, нуклеотида или олигонуклеотида превращают путем нуклеофильной атаки в соответствующий азид или тиол в защищенной или незащищенной форме и в соответствующем случае азид восстанавливают до амина с последующим присоединением к амино- или тиоловой группе флуоресцентного красителя. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцены, родамины, кумарины. 4. Соединения общей формулы I по п.1 для синтеза ДНА, РНА-нуклеозидов, нуклеотидов или олигонуклеотидов, для их флуоресцентно-микроскопической или макроскопической детекции. 5. Соединения общей формулы I по п.1 для синтеза последовательности олигонуклеотидов в присутствии матрицы и для синтеза олигонуклеотидов.