Способ получения кладрибина методом ферментативного трансгликозилирования 2-хлор-6-азидопурина с последовательной двухстадийной конверсией азидогруппы Российский патент 2025 года по МПК C12P19/40 C07H19/173 C12N9/10 C07D473/40 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии (применение ферментов для получения природных нуклеозидов и их аналогов) и фармацевтической химии (применение ферментов для получения лекарственных веществ на основе нуклеозидов) и представляет собой новый способ получения кладрибина ((2R,3S,5R)-5-(6-амино-2-хлор-9H-пурин-9-ил)-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ола), первая (ключевая) стадия которого является ферментативным трансгликозилированием посредством пуриннуклеозидфосфорилазы Е. Coli.

Уровень техники

В настоящее время опубликован ряд работ и патентов, в которых описан синтез кладрибина различными методами, которые можно разделить на химические, ферментативные и химико-ферментативные. Получение кладрибина с помощью химического синтеза имеет ряд существенных ограничений, поскольку такие процессы часто состоят из многостадийных реакций, включающих реакции постановки защит на реакционноспособные группы с последующим их удалением. Наряду с использованием дорогостоящих и/или труднодоступных на рынке стартовых соединений, химические процессы зачастую представляет собой нестереоспецифические реакции, приводящие к получению смеси α- и β-конформаций конечного продукта.

Химические методы синтеза можно условно разделить следующим образом:

1) создание N-гликозидной связи (реакция гликозилирования гетероциклического основания углеводным остатком [Zhong, М.; Nowak, I.; Robins, M.J. Regiospecific and highly stereoselective coupling of 6-(substituted-imidazol-l-yl)purines with 2-deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-α-D-erythro-pentofuranosyl chloride. Sodium-salt glycosylation in binary solvent mixtures: Improved synthesis of cladribine. J. Org. Chem. 2006, 71, 7773-7779; Henschke, J.R; Zhang, X.; Huang, X.; Mei, L.; Chu, G.; Hu, K.; Wang, Q.; Zhu, G.; Wu, M.; Kuo, C; Chen, Y. A stereoselective process for the manufacture of a 2'-deoxy-β-D-ribonucleoside using the Vorbrüggen glycosylation. Org. Process Res. Dev. 2013, 17, 1419-1429];

2) дезоксигенация (удаление, восстановление) гидроксильной группы в С2'-положении соответствующего производного нуклеозида [Xu, S.; Yao, R; Chen, G.; Wang, H. A new synthesis of 2-chloro-2'-deoxyadenosine (cladribine), CdA). Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2011, 30, 353-359; Sakakibara, N.; Kakoh, A.; Maruyama, T. First synthesis of [6-15N]-cladribine using ribonucleoside as a starting material. Heterocycles 2012, 85, 171-182].

Каждый из этих представленных химических методов обладает как определенными преимуществами, так и недостатками. Среди преимуществ можно отметить удобное селективное замещение на аминогруппу уходящей группы из С6-положения соответствующего предшественника пуринового нуклеозида (хлорид- или арилсульфонат). Недостатком же может являться многостадийность и относительно невысокие выходы. Так, общий выход синтеза кладрибина, исходя из 2'-дезоксигуанозина (2'-dGuo), находится в диапазоне от 21% [Satishkumar, S., Vuram, Р.K., Relangi, S. S., Gurram, V., Zhou, H., Kreitman, R. J., … & Lakshman, M. K. (2015). Cladribine analogues via O⁶-(benzotriazolyl) derivatives of guanine nucleosides. Molecules, 20(10), 18437-18463. DOI: 10.3390/molecules201018437] до 64-75% [Janeba Z., Francom P., Robins M.J. Efficient Syntheses of 2-Chloro-2'-deoxyadenosine (Cladribine) from 2'-Deoxyguanosine. J. Org. Chem. 2003, 68, 3, 989-992. DOI: 10.1021/jo020644k]. В случае же использования в качестве исходного соединения 2'-дезоксиаденозина (2'-dAdo), выход кладрибина составляет 44,8% [Peng, Y. A practical synthesis of 2-chloro-2'-deoxyadenosine (Cladribine) from 2'-deoxyadenosine. Journal of Chemical Research, 37(4), 213-215.]

Ферментативные методы синтеза существенно дополняют химические и, в ряде случаев, имеют несомненные преимущества [I.A. Mikhailopulo, A.I. Miroshnikov, Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 2011, 21, 57-68]. В последние годы в промышленно развитых странах получило активное развитие так называемой «зеленой» химии, целью которой является замена традиционного химического синтеза различными каталитическими методами без использования токсичных органических растворителей, что может являться показателем важности экологического подхода современной биотехнологической промышленности. Поэтому применение ферментов в качестве биокатализаторов и проведение химических процессов в соответствии с концепцией и принципами «зеленой» химии имеет большой экологический и промышленный потенциал. В качестве биокатализаторов могут выступать очищенные ферменты, ферментные препараты или целые клетки. Реакции, катализируемые ферментами, имеют множество преимуществ, таких как сокращение стадий реакций, возможность избежать использования токсичных реагентов и проведение реакции в мягких условиях, а также высокая хемо-, регио- и энантиоселективность. В результате в последние десятилетия химические способы синтеза нуклеозидов и их аналогов были частично или полностью заменены ферментными методологиями [Mendez М.В., Trelles J.A., Rivero С. W. Decitabine bioproduction using a biocatalyst with improved stability by adding nanocomposites // AMB Express. - 2020. - T. 10. - C. 1-8].

В качестве биокатализаторов используют в основном ферменты класса гликозилтранфераз (пентозилтрансферазы (КФ 2.4.2)): нуклеозидфосфорилазы (НФ) и нуклеозид-2'-дезоксирибозилтранферазы (НДТ), которые играют важную роль в метаболизме нуклеозидов, причем использование НДТ для синтеза терапевтически важных нуклеозидов получило развитие в последнее десятилетие.

НФ, в ходе запасного пути синтеза нуклеозидов в клетке, катализируют обратимый фосфоролиз нуклеозидов с образованием α-D-пентафуранозо-1-фосфата и гетероциклического основания: нуклеозид+Pi↔основание+α-D-пентафуранозо-1-фосфат. Отличия первичной структуры НФ сравнительно невелики, и эти ферменты обнаружены почти у всех организмов. Наиболее специфичным ферментом ряда НФ является тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), субстратами которого являются тимидин и 2'-дезоксиуридин. Уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) осуществляет фосфоролиз как рибо-, так и 2'-дезоксиуридина, а также тимидина. Пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) (КФ 2.4.2.1) используют в качестве субстратов пуриновые как рибо-, так и 2'-дезоксинуклеозиды [M.J. Pugmire, S.E. Ealick, Structural analyses reveal two distinct families of nucleoside phosphorylases. Biochemical Journal, 361, 1-25, 2002]. Равновесие реакций фосфоролиза сдвинуто в сторону образования нуклеозидов, причем в случае пуриновых более значительно [Goldberg RN, Tewari YB, Bhat TN, "Thermodynamics of Enzyme-Catalyzed Reactions -a Database for Quantitative Biochemistry", Bioinformatics 2004, 20, 2874-2877]. Ha этой особенности и основана эффективность ферментативной реакции трансгликозилирования, в ходе которой происходит перенос углеводного остатка от пиримидинового нуклеозида-донора (B-Nuc) на пуриновое гетероциклическое основание-акцептор (В') [А. Михайлопуло, А.И. Миропшиков. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 21, 57-68, 2012; L.E. Iglesias, E.S. Lewkowicz, R. Medici, P. Bianchi, A.M. Iribarren. Biocatalytic approaches applied to the synthesis of nucleoside prodrugs. Biotechnology Advances 33, 412-434, 2015]. Широкая специфичность НФ (а именно ПНФ, УФ и ПиНФ) в отношении наличия гидроксильных групп в углеводном остатке, позволяет осуществить синтез широкого спектра как рибо-, так и 2'-дезоксирибонуклеозидных аналогов.

НДТ встречаются в различных видах Lactobacilli, присутствуют в паразитических одноклеточных эукариотических организмах и бактериях-экстремофилах. НДТ осуществляют прямой перенос 2-дезоксирибозного остатка между пуриновыми или пиримидиновыми основаниями, а также принимают участие в повторном использовании гетероциклических оснований и 2'-дезоксирибонуклеозидов в запасном пути синтеза ДНК в этих микроорганизмах [Cardinaud R., Holguin J. Nucleoside deoxyribosyltransferase-II from Lactobacillus helveticus. Substrate specificity studies. Pyrimidine bases as acceptors //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology. - 1979. - T. 568. - №. 2. - C. 339-347; Short S. A. et al. Active Site Amino Acids That Participate in the Catalytic Mechanism of Nucleoside 2'-Deoxyribosyltransferase (*) //Journal of Biological Chemistry. - 1996. - T. 271. - №. 9. - C. 4978-4987; Fernández-Lucas, J., Fresco-Taboada, A., de la Mata, I., & Arroyo, M. One-step enzymatic synthesis of nucleosides from low water-soluble purine bases in non-conventional media // Bioresource Technology. - 2012. - T. 115. - C. 63-69].

В зависимости от субстратной специфичности, НДТ подразделяются на два типа: НДТ I типа (ПДТ) - катализируют реакцию трансгликозилирования только с пуриновыми нуклеозидами и гетероциклическими основаниями и НДТ II типа (НДТ II) - осуществляют перенос между пуриновыми и/или пиримидиновыми основаниями [Kaminski Р. А. Functional Cloning, Heterologous Expression, and Purification of Two Different N-Deoxyribosyltransferases from Lactobacillus helveticus //Journal of Biological Chemistry. - 2002. - T. 277. - №. 17. - C. 14400-14407]. НДТ узкоспецифичны в отношении 2'-гидроксильной группы углеводного остатка нуклеозида, в то время как субстратная специфичность сайта связывания в отношении гетероциклического основания достаточно широка и НДТ может использовать в качестве субстратов природные и модифицированные азотистые основания различной структуры. В отличие от НФ, НДТ осуществляют одномоментный синтез, что позволяет отказаться от использования ферментной системы с двумя ферментами как в случае использования НФ, поскольку НДТ типа II распознают как пуриновые, так и пиримидиновые 2'- дезоксирибонуклеозиды.

Основываясь на литературных данных, ферментативные методы получения кладрибина можно условно разделить следующим образом:

1) Синтез с использованием НФ.

В настоящее время опубликован рад работ, где описывается получение кладрибина с хорошими выходами с использованием мезофильных и термофильных НФ в качестве биокатализатора, исходя из 2-хлораденина (2-ClAde). Так, в работе [Zhou X., Szeker K., Jiao L.-Y., Oestreich M., Mikhailopulo I.A., Neubauer P. Synthesis of 2,6-Dihalogenated Purine Nucleosides by Thermostable Nucleoside Phosphorylases. Adv. Synth. Catal., 357: 1237-1244. DOI: 10.1002/adsc.201400966] удалось добиться 80% конверсии основания при совместном использовании термофильных пиримидиннуклеозидфосфорилазы Thermus thermophilus (ПиНФ Т. thermophilus) и ПНФ Geobacillus thermoglucosidasius (ПНФ G. thermoglucosidasius) при температуре 70°С, исходя их тимидина в качестве донора. В работе [Zuffi G., Monciardini S. Method for the Production of Cladribine. US Patent US 8,012,717 B2, Sep.6, 2011] были использованы иммобилизованные клетки E.coli с УФазной и ПНФазной активностью, которые катализировали реакцию смеси 2-дезоксиуридина (2'-dUrd), выступающего в качестве донора и 2-ClAde в калий-фосфатном буфере при 60°С. Вследствие очень плохой растворимости 2-ClAde в водной среде, в работе использовалось добавление органического растворителя (ДМФ и/или ДМСО) в реакционную смесь. Конверсия основания составила 80%. Также, используя добавление ДМСО в реакционную смесь, удалось добиться 56% конверсии 2-ClAde в кладрибин в работе [Rabuffetti, М.; Bavaro, Т.; Semproli, R.; Cattaneo, G.; Massone, M.; Morelli, C.F.; Speranza, G.; Ubiali, D. Synthesis of ribavirin, tecadenoson, and cladribine by enzymatic transglycosylation. Catalysts 2019, 9, 355. DOI:/10.3390/catal9040355]. которые использовали в качестве катализатора ПНФ Aeromonas hydrophila (ПНФ A. Hydrophila) и 7-метил-2'-дезоксигуанозин (7-MedGuo) в качестве донора и проводили ферментативное трансгликозилирование при комнатной температуре. Ранее в лаборатории Дизайна и синтеза биологически активных соединений ИМБ РАН удалось добиться высокого выхода кладрибина, исходя из 7-MedGuo и 2-ClAde в соотношении донор основание: фосфат 1,5:1,0,5. Реакция проводилась при комнатной температуре, в качестве катализатора использовалась ПНФ E.coli, выход кладрибина составил 80% [Drenichev, M.S.; Alexeev, C.S.; Kurochkin, N.N.; Mikhailov, S.N. Use of nucleoside phosphorylases for the preparation of purine and pyrimidine 2'-deoxynucleosides. Adv. Synth. Catal. 2018, 360, 305-312. DOI: 10.1002/adsc.201701005; Алексеев К.C., Дреничев M.C., Михайлов C.H. "Гидройодная соль 7-метил-2'-дезоксигуанозина в качестве субстрата для получения 2'-дезоксинуклеозидов методом ферментативного трансгликозилирования", Патент РФ №RU 2 664 472 С1, дата публикации 17.08.2018.].

2. Синтез, с использованием НДТ II.

В последнее время появился рад исследований, направленных на получение кладрибина с высокими выходами с использованием НДТ П. В работе [Rivero C.W., Garcia N.S., Fernández-Lucas J., Betancor L., Romanelli G.P., Trelles J.A. Green Production of Cladribine by Using Immobilized 2'-Deoxyribosyltransferase from Lactobacillus delbrueckii Stabilized through a Double Covalent/Entrapment Technology. Biomolecules 2021, 11, 657. https://doi.org/10.3390/biom11050657], исходя из тимидина и используя в качестве катализатора иммобилизованную НДТ II Lactobacillus delbrueckii (НДТ II Lac. delbrueckii) при 30°С, авторы получили кладрибин с выходом 90% по ВЭЖХ (препаративный метод в работе не описан).

3. Каскадный синтез с использованием нескольких ферментов.

Использование мультаферментных систем для проведения ферментативного каскадного синтеза позволяет реализовать сложные синтетические схемы, а также дает ряд дополнительных преимуществ, включая превращение обратимых реакций в необратимые, частичное или полное устранение проблемы ингибирования ферментного катализатора продуктом реакции, и минимизацию появления побочных продуктов. Так, в работе [Frisch J., Marsic Т., Loderer С.A Novel One-Pot Enzyme Cascade for the Biosynthesis of Cladribine Triphosphate. Biomolecules 2021, 11, 346, https://doi.org/10.3390/biom11030346] для получения активной формы кладрибина в виде трифосфата 2-Cl-dATP, была использована мультиферментная система, в которой катализаторами являлись: аденинфосфорибозилтрансфераза Escherichia coli (APT Е. coli), полифосфаткиназа Meiothermus ruber (PPK М. ruber) и рибонуклеотидредуктаза Thermus virus (RNR TV). Исходными субстратами были 2-ClAde и фосфорибозил пирофосфат (PRPP), реакция проводилась при температуре 40°С. Выход целевого нуклеотида составил 80%, при этом основным побочным продуктом была дифосфатная форма 2-Cl-dADP. Другая мультиферментная система, состоящая из иммобилизованных на магнитные частицы пурин-2'-дезоксирибозилтранферазы Leishmania mexicana (НДТ L. mexicana) и гипоксантин -гуанин фосфорибозилтрансферазы Escherichia coli (HGPRT Е. coli) [Cruz G., Saiz L.P., Bilal M., Eltoukhy L., Loderer C., and Fernández-Lucas J. Magnetic Multi-Enzymatic System for Cladribine Manufacturing. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 13634. https://doi.org/10.3390/ijms232U3634] использует в качестве начальных субстратов 2'-дезоксиинозин (2'-dIno) и 2-ClAde, а для удаления образующегося в процесс реакции трансгликозилирования гипоксантина авторы используют добавление PRPP и HGPRT Е. coli, получая в результате инозин монофосфат (IMP). Так как стадия рибозилирования гипоксантина, катализируемая HGPRT Е. coli является необратимой, удается значительно сместить равновесие реакции трансгликозилирования в сторону целевого продукта и достичь конверсии 2-ClAde 52% по данным ВЭЖХ (препаративный метод в работе не описан).

Описанные подходы с использованием ферментов, помимо несомненных достоинств, также обладают и некоторыми недостатками. Так, коммерчески доступные PRPP и 2'-dIno имеют высокую стоимость, что, безусловно, повышает себестоимость целевого продукта.

Проведение ферментативного трансгликозилирования с использованием термофильных ферментов в качестве биокатализаторов позволяет повысить температуру реакционной среды до 60-80°С градусов, что благоприятно может повлиять на растворимость плохо растворимого в водной среде 2-ClAde, но вместе с тем может негативно воздействовать на устойчивость N-гликозидной связи в 2'-дезоксинуклеозидах (продукте и донорах углеводного остатка) и на интермедиат реакции ферментативного трансгликозилирования - лабильный α-D-2-дезоксирибофуранозо-1-фосфат.Также в описанных работах уделено недостаточное внимание соотношению начальных молярных концентраций субстратов в реакциях, катализируемых НФ, что может отрицательно повлиять на величину выхода целевого нуклеозида [Alexeev С.S. et al. Quantitative prediction of yield in transglycosylation reaction catalyzed by nucleoside phosphorylases //Advanced Synthesis & Catalysis. - 2018. - T. 360. - №. 16. - C. 3090-3096].

Таким образом можно заключить, что разработка новых химико-ферментативных методов получения кладрибина остается актуальной задачей, так как использование ферментов в качестве катализаторов обеспечивает высокую селективность протекания реакций и позволяет сократить число стадий синтеза, что делает химико-ферментативные методы экономически рентабельными и безопасными для окружающей среды. С другой стороны, существует проблема очистки лекарственного препарата от примесей рекомбинантных ферментов, которая может быть решена введением в структуру субстратов временных защитных групп, стабильных к действию ферментов и позволяющих отделять продукта от примесей ферментов (экстракция, хроматография и т.п.) с последующим селективным удалением этих защитных групп.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом изобретения предлагается новый технологический способ получения кладрибина ((2R,3S,5R)-5-(6-амино-2-хлор-9H-пурин-9-ил)-2-(гидроксиметил)тетрагидрофуран-3-ола).

В заявленном способе предложено использовать трехстадийный синтез, представляющий собой комбинацию ферментативных и химических реакций.

В своем первом воплощении данное изобретение обеспечивает получение 6-азидо-2-хлор-2'-дезоксирибозида из 6-азидо-2-хлорпурина, 7-метил-2'-дезоксигуанозина гидройодида и фосфат-аниона в результате ферментативного трансгликозилирования, катализируемое пуриннуклеозидфосфорилазой Е. Coli.

Во втором воплощении изобретение представляет собой химическое получение триазольного производного 6-азидо-2-хлор-2'-дезоксирибозида с последующей экстракцией небольшим количеством низкотоксичного (нетоксичного) органического растворителя. Данный этап является также стадией очистки полученного интермедиата от возможных белковых примесей.

В своем третьем, последнем, воплощении изобретение представляет собой непосредственное получение кладрибина путем деблокирования триазольной защитной группы в мягких условиях.

Краткое описание фигур и таблиц Фигура 1. Химико-ферментативный способ получения кладрибина с постадийной конверсией азидогруппы. Экстракцию после проведения второй стадии проводят органическими растворителями (этилацетат, метиленхлорид, хлороформ). Достоинствами предлагаемой схемы получения кладрибина являются: лучшая растворимость 6-азидо-2-хлорпурина по сравнению с 6-амино-2-хлорпроизводным, возможность проведения one-pot ферментативной стадии и получение триазольного производного, простое отделение промежуточного липофильного триазольного производного от водорастворимых примесей (фосфат-аниона, непрореагировавшего нуклеозида-донора углеводного остатка, фермента-катализатора) с помощью экстракции и отсутствие белковой примеси в целевом продукте. Проведение экстракции на стадии II и хроматографии на конечной стадии III позволяет добиться высокой степени очистки целевого продукта от примесей белка (содержание фермента менее 1 мкг/мл методом Брэдфорда).

Фигура 2. Компьютерное моделирование связывания 2-хлор-6-азидопурина с активным центром ПНФ E.coli. в программе AutoDockTools.

Фигура 3. ВЭЖХ-анализ препаративного синтеза 2-хлор-6-азидо-2'-дезоксиаденозина (3) с помощью реакции ферментативного трансгликозилирования. Условия ВЭЖХ анализа: Cosmosil 5C18-MS-II, 4.6*150 mm, 5um, 120 A, (Nacalai Tesque, Inc. (Киото, Япония)), 37°C, анализ проводили в линейном градиенте ацетонитрила 2-70% в 0,06% TFA/деионизированная вода за 15 минут, при скорости потока 1 мл/мин, УФ -детектирование при λ=283 нм, объем инъекции 60 мкл.

Фигура 4. А - ¹Н-ЯМР спектр (300 МГц) 2-хлор-6-азидопурина в DMSO-d₆ при 298 К. Б -фрагмент ¹Н-ЯМР спектра (300 МГц) аликвоты реакционной смеси, содержащей 2-хлор-6-азидо-2'-дезоксиаденозин (3) и его основную таутомерную форму в CD₃OD с добавлением D₂O при 298 К. В области слабого поля (10.0-8.0 м.д.) видны сигналы протонов нуклеозидных продуктов и непрореагировавших оснований. В области 6.5-6.0 м.д. видны сигналы аномерных протонов дезоксирибозного остатка двух таутомерных форм нуклеозидов.

Фигура 5. Агрегатное состояние триазолзамещенных продуктов «click»-реакции 2-Cl-6-N₃-dAdo с фторфенилацетиленом (А) и 4-фторфенилацетиленом (Б). Слева представлены ТСХ после обработки триазолзамещенных продуктов. Замещение остатка фенилтриазола на аминогруппу (А) протекает с образованием меньшего количества побочных продуктов по сравнению с аналогичной реакцией замещения остатка 4-фторфенилтриазола (Б). Фигура 6. А - УФ-анализ методом Брэдфорда содержания остаточного белка в конечном продукте кладрибине. Концентрации белка указаны на диаграмме. Б - Полный УФ-спектр полученного кладрибина в растворе с реактивом Брэдфорда в диапазоне 220 - 800 нм. Концентрация кладрибина 8,33 мг/мл.

Осуществление изобретения

Подход, основой которого является разработка новых способов получения лекарственных веществ, структурно схожих с природными нуклеозидами и гетероциклическими основаниями, является одним из наиболее плодотворных в медицинской и фармацевтической химии. В современной клинической практике используется ряд препаратов, созданных на основе модифицированных нуклеозидов и обладающих широким спектром биологической активности: противовирусной (гепатит С, герпес, ВИЧ и др.- Рибавирин, Видарабин, Зидовудин, Ламивудин и др), противоопухолевой (Кладрибин, Флударабин, Пентостатин, Неларабин, Видаза, Децитабин и др.), (Е De Clercq, G. Li. Clinical Microbiology Reviews, Approved antiviral drugs over the past 50 years, 29, 695-747, 2016; W.B. Parker. Enzymology of Purine and Pyrimidine Antimetabolites Used in the Treatment of Cancer. Chem. Rev. 109, 2880-2893, 2009). В 2019 году препарат Mavenclad® был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для клинической терапии рецидивирующих форм рассеянного склероза [Giovannoni, G.; Comi, G.; Cook, S.; Rammohan, K.; Rieckmann, P.; Sørensen, P.S.; Vermersch, P.; Chang, P.; Hamlett, A.; Musch, В.; et al. A placebo-controlled trial of oral cladribine for relapsing multiple sclerosis. N Engl. J. Med. 2010, 362, 416-426. DOI: 10.1056/NEJMoa0902533; Leist, T.P.; Weissert, R. Cladribine: Mode of action and implications for treatment of multiple sclerosis. Clin. Neuropharmacol. 2011, 34, 28-35. DOI: 10.1097/WNF.0b013e318204cd90]. Изначально кладрибин был разработан в 1980-х годах как средство для лечения различных форм лейкемии [Carson, D.A.; Wasson, D.B.; Beutler, Е. Antileukemic and immunosuppressive activity of 2-chloro-2'-deoxyadenosine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 2232-2236. DOI: 10.1073/pnas.81.7.223] и спустя 30 лет его потенциальная эффективность в отношении рассеянного склероза была обнаружена и подробно изучена.

Кладрибин (2-хлор-2'-дезоксиаденозин, Leustatin, Litak® (код ATX: L01BB04), Mavenclad® (код ATX: L04AA40)) является структурным аналогом природного пуринового 2'-дезоксиаденозина, и его активная форма действует в клетке в качестве антиметаболита последнего. Введение атома хлора во второе положение 2'-дезоксиаденозина делает молекулу 2-хлор-2'-дезоксиаденозина устойчивой к дезаминированию клеточной аденозиндезаминазой. После последовательного фосфорилирования клеточной дезоксицитидинкиназой (dCK), кладрибин превращается в свою активную форму, 2-хлор-2'-дезоксиаденозин-5'-трифосфат (2-Cl-dATP). Накопление активной формы зависит главным образом от соотношения ферментативной активности dCK и 5'-дезоксинуклеотидазы (5'-NT) в клетке. Лимфоциты и другие гематопоэтические клетки, где наблюдается высокая активность dCK и низкая активность 5'-NT являются преимущественными мишенями для накопления 2-Cl-dATP до достижения токсичной концентрации. В результате, имеющие более низкое значение соотношения dCK/5'-NT, другие клетки костного мозга подвергаются токсическому воздействию кладрибина в меньшей степени, чем лимфоциты. Скорость превращения пролекарства кладрибина в его активную трифосфатную форму лимитируется dCK, что приводит к избирательному истощению делящихся и неделящихся Т- и В-клеток. Различия в уровнях экспрессии dCK и 5'-NT между подтипами иммунных клеток могут объяснить различия в чувствительности иммунных клеток к кладрибину, вследствие чего клетки врожденной иммунной системы подвержены меньшему воздействию, чем клетки адаптивной иммунной системы. В отличие от других нуклеозидных аналогов, кладрибин токсичен как в отношении быстро пролиферирующих клеток, так и в отношении покоящихся клеток, тем не менее, цитотоксический эффект кладрибина не наблюдается в клеточных линиях твердых опухолей. Кладрибин обладает дозозависимой цитотоксичностью.

Основной механизм действия 2-Cl-dATP, вызывающий апоптоз, заключается в прямом и косвенном воздействии на синтез ДНК и функционирование митохондрий в клетке. В пролиферирующих клетках 2-Cl-dATP ингибирует рибонуклеотидредуктазу, таким образом вмешиваясь в синтез ДНК, а также конкурирует с дезоксиаденозинтрифосфатом (dATP) в отношении ДНК-полимераз за включение в растущую цепь ДНК. В покоящихся клетках кладрибин вызывает однонитевые разрывы ДНК и ингибирует механизм репарации последней, что приводит к быстрому потреблению никотинамид-аденин-динуклеотидов (НАД⁺), истощению АТР и гибели клеток.

Патология рассеянного склероза включает в себя сложную цепь событий, в которой ключевую роль играют различные типы иммунных клеток, включая аутореактивные Т- и В-лимфоциты. Механизм, посредством которого кладрибин оказывает терапевтическое действие при рецидивирующих формах рассеянного склероза, до конца не выяснен, но считается, что его преимущественное воздействие на В- и Т-лимфоциты прерывает каскад иммунных событий, критичных для возникновения рассеянного склероза.

Применение модифицированных природных нуклеозидов в качестве лекарственных препаратов в терапевтической практике и поиск новых биологически активных веществ в ряду аналогов природных нуклеозидов тесно связаны с разработкой новых методов синтеза нуклеозидов. В последние годы в развитых странах активно развивается так называемая "зеленая" химия, целью которой является замена традиционного химического синтеза различными каталитическими методами, по возможности с ограничением использования токсичных органических растворителей. Ферментативный синтез является хорошей альтернативой химическому синтезу. Так, ферментативный синтез позволяет получать как природные нуклеозиды, так и лекарственные препараты нуклеозидной природы (кладрибин, 5-фтордезоксиуридин, флударабин, неларабин, видарабин и др.) и имеет промышленное значение. Для получения практически важных нуклеозидов активно разрабатываются и применяются технологии, основанные на ферментативных реакциях трансгликозилирования - переноса углеводного остатка с одного гетероциклического основания на другое. Однако, в фармацевтической промышленности наличие в полученном продукте примеси остатка белка - катализатора зачастую является неприемлемым. Чтобы избежать подобного, можно использовать иммобилизацию ферментов на различных носителях [Taran, S.A.; Verevkina, K.N.; Feofanov, S.A.; Miroshnikov, A.I. Enzymatic transglycosylation of natural and modified nucleosides by immobilized thermostable nucleoside phosphorylases from Geobacillus stearothermophilus. Russ. J. Bioorganic Chem. 2009, 35, 739-745; Rivero C.W., Garcia N.S., Fernandez-Lucas J., Betancor L., Romanelli G.R, Trelles J.A. Green Production of Cladribine by Using Immobilized 2'-Deoxyribosyltransferase from Lactobacillus delbrueckii Stabilized through a Double Covalent/Entrapment Technology. Biomolecules 2021, 11, 657, DOI: 10.3390/biom11050657; Cruz G., Saiz L.P., Bilal M., Eltoukhy L., Loderer C., Fernandez-Lucas J. Magnetic Multi-Enzymatic System for Cladribine Manufacturing. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 13634. DOI:10.3390/iims2321136341. и в настоящее время осуществляются попытки использования иммобилизованных на различных носителях ферментов в биотехнологической промышленности.

Изобретение решает задачу получения кладрибина без белковых примесей (возможных остатков биокатализатора), исходя из 6-азидо-2-хлорпурина, гидройодной формы 7-метил-2'-дезоксигуанозина (7-MedGuo) и фосфат-аниона в три стадии, первая и основная из которых - ферментативная (Фигура 1). В качестве гетероциклического основания-акцептора был выбран 6-азидо-2-хлорпурин (6-N₃-2-Cl-pur), который обладает более высокой растворимостью в водной среде по сравнению с 6-амино-2-хлорпурином (2-ClAde), что позволяет провести реакцию в гомогенной среде в мягких условиях без добавления органических растворителей (ДМСО, спирты) или нагревания реакционной смеси. При выборе 6-N₃-2-Cl-pur в качестве гликозил-акцептора учитывались данные молекулярного докинга, согласно которым 6-N₃-2-Cl-pur и его основная таутомерная форма хорошо связывались с активным центром фермента (Фигура 2).

Оптимизация условий синтеза проводилась в серии аналитических экспериментов с различными соотношениями нуклеозид-донор: основание-акцептор: фосфат-анион. Ранее нами было показано, что увеличение концентрации фосфата смещает равновесие реакции в сторону продуктов фосфоролиза и уменьшает выход продукта. Поэтому для проведения реакции трасгликозилирования использовали недостаток фосфата [Alexeev С.S. et al. Quantitative prediction of yield in transglycosylation reaction catalyzed by nucleoside phosphorylases //Advanced Synthesis & Catalysis. - 2018. - T. 360. - №. 16. - C. 3090-3096]. Применение 7-MedGuo в качестве субстрата-донора ПНФ Е. coli в реакции трансгликозилирования позволяет получать 6-азидо-2-хлор-2'-дезоксирибозид с высоким выходом (около 80%), используя небольшой избыток гидройодной формы 7-MedGuo (2.0 эквивалента к гетероциклическому основанию) и недостаток фосфата (0.5 эквивалентов к гетероциклическому основанию). Тем не менее, учитывая наличие таутомерных форм основания-акцептора, при масштабировании синтеза мы использовали соотношение 5:1:0,5 (7-MedGuo: 6-N₃-2-Cl-.pur: KH₂PO₄), чтобы добиться количественной конверсии 6-N₃-2-Cl-pur в реакции ферментативного трансгликозилирования в соответствующий рибозид. Высокий выход ферментативной стадии связан с необратимостью стадии фосфоролиза 7-MedGuo и смещением равновесия в сторону образования пуринового нуклеозида для реакции, катализируемой ПНФ Е. coli [I.A. Mikhailopulo, A.I. Miroshnikov, Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application. Mendeleev Commun., 2011, 21, 57-68]. Использование небольших избытков упрощает выделение и очистку целевых продуктов хроматографией на силикагеле, также снижает их стоимость, что может обеспечить рентабельность предлагаемого метода. Свойства 7-MedGuo определяют выбор условий проведения ферментативных реакций. Раствор гидройодной соли 7-MedGuo в 50 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,5) хорошо хранится при +8°С в течение недели (гидролиз - 5% через неделю по данным ВЭЖХ). Согласно данным УФ-спектроскопии и ВЭЖХ-анализа, раствор гидройодной соли 7-MedGuo в 50 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,5) достаточно устойчив при 20°С (по данным ВЭЖХ гидролиз незначителен через час, меньше 10% через сутки и 30% через двое суток). Гидройодная соль 7-MedGuo неустойчива в водных растворах при рН 4,1 и 20°С [Drenichev et al. Use of Nucleoside Phosphorylases for the Preparation of Purine and Pyrimidine 2'-Deoxynucleosides. // Advanced Synthesis & Catalysis. - 2018. - T.360. №2. C. 305 - 312.]. Контроль за протеканием ферментативных реакций проводится с помощью ВЭЖХ на обращенно-фазном сорбенте Cosmosil С₁₈ и Luna® C₁₈ в линейном градиенте концентраций ацетонитрила 2-70% в 0,06% растворе трифторуксусной кислоты в деионизированной воде за 15 минут, при скорости потока 1 мл/мин.

В момент времени t₀ (Фигура 3А) на хроматограмме были идентифицированы пики 7-MedGuo (3), небольшой пик 7-метилгуанина (7-MeGua, 2), образовавшегося в результате частичного гидролиза 7-MedGuo, и сигналы таутомерных форм основания 2-Cl-6-N₃-pur в виде двух пиков (6) и (7). В ходе реакции концентрация 7-MedGuo значительно уменьшалась, что можно видеть по уменьшению площади пика соответствующего сигнала поглощения (Фигура 3Б). Пики 5, 6 и 7 соответствуют таутомерным формам 6-N₃-2-Cl- -dAdo. Так как в выбранных условиях значения времен удержания целевого нуклеозида и основания-акцептора одинаковы, определить выход целевого нуклеозида с помощью ВЭЖХ не удается. Протекание трансгликозилирования, поэтому, удобнее контролировать методом ¹H-ЯМР спектроскопии: в спектре ¹Н-ЯМР реакционной смеси наблюдается образование двух основных продуктов гликозилирования в соотношении 8:1 (Фигура 4), что соответствует двум таутомерным формам 6-азидо-2-хлорпурина, среди которых преобладает форма со свободной азидогруппой [Lakshman М. K. et al. Azide- Tetrazole equilibrium of c-6 azidopurine nucleosides and their ligation reactions with alkynes // The Journal of organic chemistry. - 2010. - T. 75. - №. 8. - C. 2461-2473.]. Конверсия таутомерных форм основания в соответствующие нуклеозиды связана, по-видимому, с низкой чувствительностью ПНФ к образованию нескольких аннелированных циклов в молекуле субстрата, что согласуется с литературными данными для других азидосодержащих производных пуринов [Stachelska-Wierzchowska A., Wierzchowski J. Analyt. Chim. Acta. 2020, 1139, 119-128; Stachelska-Wierzchowska et al. Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids, 2018, 37(2), 89-101; Wierzchowski et al. Biochim. Biophys. Acta, 1996, 1290, 9-17].

Полученный в ходе первой стадии продукт 6-азидо-2-хлорпурин-2'-дезоксирибозид (6-N₃-2-Cl-Pur-2'-dRib) далее без выделения вводится в реакцию [2+3]-циклоприсоединения с фенилацетиленом (n(о,м)-фторфенилацетиленом) в присутствии солей меди (CuCl, CuBr, CuI, CuSO₄/аскорбат натрия, CuCl₂/аскорбат натрия). Реакция [2+3]-циклоприсоединения 6-N₃-2-Cl-Pur-2'-dRib к фторфенилацетилену, наряду с основным продуктом, приводит к образованию 2-хлордезоксиинозина (10-15% по ТСХ) в качестве побочного продукта гидролиза 6-(4-фторфенилтриазол-1-ил)-2-хлор-2'-дезоксирибозида. Новизной предлагаемого подхода является использование 4-фторфенилацетиленов для активации 6-го положения 6-азидо-2-хлорпурина, при этом 4-фторфенилтриазол является легко уходящей группой, быстро замещающейся на аминогруппу при обработке аммиаком. Анализ реакционной смеси по ТСХ показывает количественную конверсию 6-N₃-2-Cl-Pur-2'-dRib в 6-(4-фенилтриазол-1-ил)-2-хлор-2'-дезоксирибозид (4), экстракция из водной реакционной смеси, содержащей белок (фермент), позволяет избавиться от остатков фермента в продукте. Экстракцию желательно проводить органическим растворителем, обладающим меньшей плотностью, чем вода (этилацетат и др. эфиры карбоновых кислот), что является технологически целесообразным для проведения дополнительной отмывки продукта от примесей солей меди 0.5 М водным раствором натриевой соли ЭДТА (в ходе отмывки органический слой не сливается из воронки, что экономит время на переливание его обратно в экстракционный резервуар). Экстракт после сушки и фильтрования от механических примесей подвергают упариванию, в ходе которого получают фенилтриазолзамещенное производное (4, Х=Н) в виде желтого порошка (Фигура 5А).

Присоединение фенилацетилена к 6-N₃-2-Cl-Pur-2'-dRib подтверждается данными ЯМР-спектроскопии: в ¹Н-ЯМР спектре присутствуют сигналы протонов фенильной группы в области 8.00-7.00 м.д.

На конечной стадии проводят удаление фенилтриазольной группы обработкой соединения водно-спиртовым раствором аммиака с последующей хроматографической очисткой полученного кладрибина с суммарным выходом 20-28%. Структура целевого продукта подтверждается данными ¹Н-ЯМР спектроскопии, УФ-спектроскопии (поглощение при λ_max=262 нм в воде, λ_max=273-276 нм в присутствии реагента Брэдфорда) и хроматомасс-спектрометрии (HRMS). При проведении клик-реакции с 4-фторфенилацетиленом промежуточный продукт (4, X=F) не характеризуют в виду лабильности последнего, а получившуюся после экстракции и упаривания сиропообразную массу сразу вводят в следующую стадию синтеза - обработка аммиаком, сожалению, целевой продукт образуется с меньшим выходом (20%).

Таким образом, предлагаемый нами метод описывает химико-ферментативное получение противоопухолевого препарата кладрибина и его очистку от примесей рекомбинантного фермента. Метод состоит из одной ферментативной стадии (гликозилирование 2-хлор-6-азидопурина) и двух химических стадий (получение 6-(4-(фтор)фенилтриазол-1-ил)-2-хлор-2'-дезоксирибозида с экстракцией продукта органическим растворителем и удаление (4-фторфенил)триазольной группы обработкой водно-спиртовым аммиаком). Для ферментативного синтеза нуклеозида в качестве оптимального донора - источника углеводного остатка используется 7-метил-2'-дезоксигуанозин (7-MedGuo), что может являться наиболее простым и экономически эффективным подходом.

В литературе описан ряд разнообразных и запатентованных способов получения кладрибина, одним из которых является ферментативное гликозилирование 2-хлор-6-аминопурина [Zuffi G., Monciardini S. Method for the Production of Cladribine. US Patent US 8,012,717B2, Sep.6,2011; Алексеев К.C., Дреничев M.C., Михайлов C.H. "Гидройодная соль 7-метил-2'-дезоксигуанозина в качестве субстрата для получения 2'-дезоксинуклеозидов методом ферментативного трансгликозилирования" Патент РФ №RU 2 664 472 С1, дата публикации 17.08.2018.]. Недостатком данного метода является низкая растворимость 2-хлор-6-аминопурина в воде, поэтому вместо него может быть использован 2,6-дихлорпурин, хорошо растворимый в воде [Zhou et al. Synthesis of 2,6-Dihalogenated Purine Nucleosides by Thermostable Nucleoside Phosphorylases. // Advanced Synthesis & Catalysis. - 2015. - T.357. C. 1237 - 1244.]. Предлагаемый в данном изобретении, 6-азидо-2-хлорпурин, так же хорошо растворим в воде и является хорошим субстратом ПНФ, что способствует практически полной его конверсии в дезоксинуклеозид. 6-Азидогруппа в составе дезокснуклеозида конвертируется в гидрофобный остаток 6-фенилтриазола или 6-фторфенилтриазола с количественным выходом, что позволяет изолировать полученные продукты из реакционной смеси экстракцией в органический растворитель. Процедура экстракции позволяет отделиться от рекомбинантного фермента, который остается в водной фазе. Остаток 6-фенилтриазола или 6-фторфенилтриазола является хорошо уходящей группой в составе нуклеозидов, способной замещаться на аминогруппу обработкой водно-спиртовым раствором аммиака в мягких условиях с образованием целевого продукта [Kovaļovs A. et al. 1, 2, 3-Triazoles as leaving groups in purine chemistry: a three-step synthesis of N6-substituted-2-triazolyl-adenine nucleosides and photophysical properties thereof //Tetrahedron Letters. -2013. - T. 54. - №. 8. - C. 850-853.]. Достоинствами данного метода является получение кладрибина экологичным методом гликозилирования водорастворимого пуринового основания и высокая степень очистки целевого продукта от примесей рекомбинантного фермента на стадиях экстракции и хроматографической очистки после проведения конечной химической стадии. Чистота образца целевого продукта подтверждается данными УФ-спектроскопии в присутствии реагента Брэдфорда (содержание фермента менее 1 мкг/мл по методу Брэдфорда, Фигура 6).

ВЭЖХ-анализ проводят с использованием ВЭЖХ-системы Akvilon (Москва, Россия). Анализ проводят на колонке 4,6 мм × 150 мм (5 мкм, Cosmosil 5C18-MS-II (Nacalai Tesque, Inc., Киото, Япония)), оснащенной предколонкой (4,0 мм × 3 мм, 5 мкм, С₁₈ (Phenomenex Inc., Торранс, Калифорния, США)). Элюция в линейном градиенте ацетонитрила 2-70% в 0,06% растворе трифторуксусной кислоты в деионизированной воде за 15 минут, при скорости потока 1 мл/мин. Обнаружение веществ на хроматограммах ведут в УФ при λ_max-283 нм. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляют на пластинках Alugram SIL G/UV254 (Macherey-Nagel), Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ (ЗАО Сорбполимер). Спектры ЯМР регистрируют на спектрометре Bruker АМХ 300 (Германия) при 298 К. Сдвиги 5 сигналов приведены в миллионных долях (м.д.) и откалиброваны по остаточному сигналу растворителя (CD₃OD, δ=3.31 м.д.; D₂O, δ=4.79 м.д., ацетон-d₆, δ=2.09 м.д.), константы спин-спинового взаимодействия (J) приведены в герцах (Гц). Для выделения и очистки веществ используют коммерчески доступные реактивы и растворители компаний «Компонент-реакив», «Sigma», «Merck», не требующие проведения дополнительной очистки. Обращенно-фазную препаративную хроматографию проводят на C₁₈-модифицированном силикагеле Polygosil (Macherey-Nagel), поглощение фракций детектировали на приборе TOY18DAD Н (ЕСОМ, Чехия, серийный номер 7031868), оборудованном двухканальным УФ-детектором. Пуриннуклеозидфосфорилаза Е. coli (#N2415, ЕС 2.4.2.1, Sigma-Aldrich, Burlington (MA), United States), реагент Брэдфорда для определения концентрации белка в диапазоне 1 - 1400 мкг/мл (#В6916, Sigma-Aldrich, Burlington (MA), United States).

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Оптимизация условий ферментативного трансгликозилирования.

Реакции проводят в пластиковых пробирках объемом 1,5 мл при температуре 37°С. Объем реакционной смеси 1 мл. Смешивают 2 мМ раствор 7-MedGuo, 1 мМ раствор 6-N₃-2-Cl-pur в 50 мМ Tris-HCl буфере (рН 7.5) и 5 мМ фосфатный буфер в разных соотношениях. Растворы термостатируют при 37°С. Реакции запускают добавлением 2 μL (0.2 U) ПНФ E.coli. Ход реакции контролируют с помощью ВЭЖХ. Условия ВЭЖХ анализа: Cosmosil 5C18-MS-II, 4.6*150 mm, 5 μm, 120 Å, (Nacalai Tesque, Inc. (Киото, Япония)), 37°C, анализ проводят в линейном градиенте ацетонитрила 2-70% в 0,06% TFA/деионизированная вода за 15 минут, при скорости потока 1 мл/мин, УФ -детектирование при λ=283 нм, объем инъекции 60 мкл.

Пример 2. Получение 6-азидо-2-хлоропурина

Смесь 0.605 г (3.201 ммоль) 2,6-дихлоропурина и 0.356 г (5.476 ммоль) азида натрия нагревают при перемешивании на масляной бане при 105°С в смеси растворителей ДМСО (10 мл) - Н₂О (0.6 мл) в течение 6 ч. Далее охлаждают до комнатной температуры и высаживают продукт 4-х кратным объемом воды, охлаждают до 0°С, осадок отфильтровывают и промывают ледяной водой, высушивают над пентаоксидом фосфора (Р₂О₅) в вакуум-эксикаторе. Продукт перекристаллизовывают из метанола (62.0%). Получают 0.517 г (82.6%) 6-азидо-2-хлоропурин в виде порошка.

¹H-ЯМР (300 МГц, CD₃OD), δ, м.д.: 13.59 (с, 1Н, N9-H, таутомер I+II), 8.70 (с, 0.20Н, Н-8 Pur, таутомер I), 8.43 (с, 0.91Н, Н-8 Pur, таутомер II).

Пример 3. Получение 2-Хлор-6-азидо-9-(β-D-2-дезоксирибофуранозил)пурина.

Смесь 7Me-dGuo (202 мг, 0,492 ммоль), 6-N₃-2-Cl-pur (48 мг, 0,246 ммоль) и KH₂PO₄(16,7 мг, 0,123 ммоль) растворяют в 50 мМ буферном растворе Tris-HCl рН 7,5 (98,4 мл). Добавляют ПНФ Е. coli (10 мкл, 1 U), оставляют на 72 часа при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Выпавший осадок 7-Me-Gua отфильтровывают с помощью нейлоновой мембраны Phenomenex (диаметр пор 0,2 μ), а маточный раствор используют в дальнейшем синтезе.

Для контроля протекания реакции из фильтрата отбирают аликвоту объемом 4.9 мл, упаривают досуха и характеризуют методом ¹Н-ЯМР. Выход продукта составил 61 мг (80%) в виде белого затвердевающего сиропа после очистки методом обращенно-фазной хроматографии на сорбенте Polygosyl C₁₈ (100 мл, элюирование в системе вода:этанол с градиентом этанола от 0 до 35%). R_f: 0.80 (метиленхлорид:этанол - 97:3, v/v).

¹Н-ЯМР (300 МГц, D₂O), δ, м.д., 8.03 (с, 1Н, Н-8 2-Cl-Ade), 7.92 (уш.с.2Н, NH₂), 6.36 (дд, 1H, J_1'-2'a=7.7, J_1'-2'b=6.2 Н-1'), 4.20 (ддд, 1Н, J_4'-3'=3.5, J_5'a-4'=2.9, J_5'b-4'=4.1, Н-4'), 3.88 (дд, 1Н, J_5'a-5'b=12.1, J_5'a-4'=2.9, H-5'a), 3.74 (дд, 1H, J_5'b-5'а=12.1, J_5'b-4'=4.1, Н-5'b), 2.83

(ДД, 1Н, J_2'а-2'b=14.2, J_2'a-1'=7.7, J_2'а-3'=6.2, H-2'a), 2.46 (ДДД, 1Н, J_2'b-2'a=14.0, J_2'а-1'=6.2, J₂'_b-3'=3.2, Н-2'b).

Пример 4. Получение 2-хлор-6-(4-фенилтриазол-1-ил)-9-(β-D-2-дезоксирибофуранозил)пурина.

К маточному раствору, полученному в Примере 3, добавляют 10 мл MeCN и при перемешивании добавляют последовательно фенилацетилен (27 мкл, 0,246 ммоль), хлорид меди (II) (41,9 мг, 0,246 ммоль) и аскорбат натрия (97,5 мг, 0,246 ммоль). Образующуюся суспензию светло-желтого цвета перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь переносят в делительную воронку на 200 мл и экстрагируют этилацетатом (50 мл). Водный слой отделяют, органический слой промывают последовательно 0.5 М водным раствором натриевой соли ЭДТА (2×50 мл), сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме до образования желтого порошка. Выход количественный. R_f: 0.80 (метиленхлорид:этанол - 95:5, v/v).

¹Н-ЯМР (300 МГц, CD₃OD), δ, м.д.: 8.26 (с, 1Н, Н-8 Pur), 8.02-7.94 (м, 2Н, 5-Н, триазол), 7.43 (дд, 2Н, ³J=8.4, 4J=1.0, о-Н, Ph), 7.31 (дд, 2Н, ³J₁=8.4,³J₂=7.4, м-Н, Ph), 7.21 (тт, 2Н, ³J=7.4, ⁴J=1.0 n-Н, Ph), 6.43 (т,1H, J_1'-2'a=6.7, J_1'-2'b=6.7, Н-1'), 4.32 (ддд, 1H, J_3'-2'а=6.5, J_3'-2'b=3.7, J_3'-4'=2.7, Н-3'), 4.15 (ддд, 1Н, J_4'-3'=2.7, J_5'a-4'=3.6, J_5'b-4'=4.2, Н-4'), 3.95-3-85 (м, 2Н, H-5'a, Н-5'b), 2.37-2.27 (м, 1H, H-2'a), 2.27-2.19 (м, 1H, Н-2'b).

¹Н-ЯМР (300 МГц, ацетон-d₆): 9.14 (с, 1H, 5H-триазол), 8.45 (с, 1Н, Н-8 Pur), 8.00 (дд, 2Н, ³J=7.1, ⁴J=1.4, o-Ph), 7.50 (дд, 2Н, ³J₁=7.3,³J₂=7.1, м-H, Ph), 7.39 (тт, 2Н, ³J=7.3, ⁴J=1.4, п-H, Ph), 6.55 (дд, 1H, J_1'-2'a=6.5, J_1'-2'b=7.3, Н-1'), 4.69 (ддд, 1H, J_3'-2'a=6.0, J_3'-2'b=4.3, J_3'-4'=1.9, Н-3'), 4.11 (ддд, 1Н, J_4'-3'=3.0, J_5'a-4'=4.0, J_5'b-4'=4.1, Н-4'), 3.84 (дд, 1Н, J_5'a-5'b=12.0, J_5'a-4'=4.0, H-5'a), 3.78 (дд, 1Н, J_5'а-5'b=12.0, J_5'b-4'=4.1, Н-5'b) 2.88 (ддд, 1H, J_2'a-2'b=13.5, J_2'a-1'=7.5, J_2'a-3'=6.0, H-2'a), 2.55 (ддд, 1Н, J_2'b-2'a=13.5, J_2'b-1'=6.5, J_2'b-3'=4.3, Н-2'b).

Масс-спектр (HRMS): рассчитано для [C₁₈H₁₆ClN₇O₃+H⁺] 414.1076 (100%), 415.1109 (19.5%), 416.1048 (32%), найдено 414.1317,415.2102,416.2182. Пример 5. Получение 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (кладрибина).

2-Хлор-6-(4-фенилтриазол-1-ил)-9-(β-D-2-дезоксирибофуранозил)пурин (24 мг, 0.058 ммоль), полученный в Примере 4, растворяют в этаноле (1,1 мл) и к полученному раствору добавляют 25% водный раствор аммиака (1,1 мл). Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 30 часов и упаривают. Остаток наносят на колонку с силикагелем (2 мл) методом сухого нанесения. Колонку промывают в системе метиленхлорид:этанол - 95:5, i/v). Продукт элюируют в системе метиленхлорид.этанол -80:20, (v/v). Фракции, содержащие продукт, упаривают досуха. Остаток растворяют в метаноле, отфильтровывают от механических примесей, упаривают досуха и сушат в вакуумном эксикаторе над пентаоксидом фосфора в течение суток. Выход 6 мг (35%) в виде желтоватого порошка.

¹Н-ЯМР (300 МГц, D₂O), δ, м.д.: 8.38 (с, 1H, Н-82-Cl-Ade), 8.03 (уш.с.2Н, NH₂), 6.36 (дд, 1Н, J_1'-2'a=7.7, J_1'-2'b=6.2 Н-1'), 4.20 (ддд, 1H, J_4'-3'=3.5, J_5'a-4'=2.9, J_5'b-4'=4.1, Н-4'), 3.88 (дд, 1Н, J_5'a-5'b=12.1, J_5'a-4'=2.9, H-5'a), 3.74 (дд, 1Н, J_5'b-5'а=12.1, J_5'b-4'=4.1, Н-5'b), 2.83 (дд, 1Н, J_2'a-2'b=14.2, J_2'a-1'=7.7, J_2'a-3'=6.2, H-2'a), 2.46 (ДДД, 1Н, J_2'b-2'а=14.0, J_2'a-1'=6.2, J_2'b-3'=3.2, Н-2'b).

Масс-спектр (HRMS): рассчитано для [C₁₀H₁₂ClN₅O₃-H+K⁺] 323.0260, найдено 323.0480.

Пример 6. Получение 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (кладрибина).

Реакционную смесь после аммонолиза, описанного в Примере 5, упаривают. Остаток наносят на колонку с обращенно-фазным сорбентом (Polygosyl C₁₈, 100 мл). Вещество элюируют в системе вода:этанол с градиентом этанола от 0 до 35%. Контроль за протеканием хроматографии проводят с помощью УФ-детекции на приборе TOY18DAD Н (ЕСОМ) при длинах волн 260 и 283 нм. Фракции, содержащие продукт, упаривают. Остаток растворяют в метаноле, упаривают и лиофилизуют. Выход 4 мг (25%) в виде желтоватого порошка.

Пример 7. Получение кладрибина из 2-хлор-6-[4-(n-фторфенил)триазол-1-ил]-9-(β-D-2-дезоксирибофуранозил)пурина.

К маточному раствору, полученному в Примере 3, добавляют 10 мл MeCN и при перемешивании добавляют последовательно 4-фторфенилацетилен (29 мг, 0,246 ммоль), хлорид меди (II) (41,9 мг, 0,246 ммоль) и аскорбат натрия (97,5 мг, 0,246 ммоль). Образующуюся суспензию светло-желтого цвета интенсивно перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь переносят в делительную воронку на 200 мл и экстрагируют этилацетатом (50 мл). Водный слой отделяют, органический слой промывают последовательно 0.5 М водным раствором натриевой соли ЭДТА (2×50 мл), сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме до образования коричневого сиропа. Полученный сироп растворяют в смеси вода:8М NH₃/МеОН - 1:4 (2 мл) и реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 48 часов и упаривают. Остаток наносят на колонку с силикагелем (2 мл) методом сухого нанесения. Колонку промывают в системе метиленхлорид:этанол - 95:5, (v/v). Продукт элюируют в системе метиленхлорид:этанол - 80:20, (v/v). Фракции, содержащие продукт, упаривают досуха. Остаток растворяют в метаноле, отфильтровывают, упаривают досуха и сушат в вакуумном эксикаторе над пентаоксидом фосфора в течение суток. Выход 7 мг (20%) в расчете на 2-хлор-6-азидопурин.

Пример 8. Определение содержания белка методом Брэдфорда

Реагент Брэдфорда (готов к работе и хранится при температуре 2-8°С) используют для определения наличия белка и его концентрации в растворе. Процедура основана на образовании комплекса между красителем, Brilliant Blue G, и белком (фермент ПНФ E.coli) в растворе. Комплекс белок-краситель вызывает сдвиг максимума в поглощении красителя от 465 до 595 нм. Величина поглощения пропорциональна содержанию белка.

Было проведено исследование, направленное на определение остаточного количества белка (фермента - катализатора) в водном растворе готового продукта кладрибина с концентрацией 8,33 мг/мл. Для этого готовят несколько образцов, объемом 1 мл, содержащих ПНФ Е. coli в водном растворе с концентрацией 1 мкг, 5 мкг и 10 мкг/мл. Далее в образцы добавляют реагент Бредфорда объемом 1 мл. С полученной смеси регистрируют УФ-спектры, данные которых представлены на Фигуре 6. Для дополнительного контроля также регистрируют УФ-спектр смеси 1 мл реагента Брэдфорда с 1 мл деионизированной воды (milli-Q).

Пример 9. Молекулярное моделирование Подготовка белка к докингу:

1) На сайте Protein Data Bank (https://www.rcsb.org, www.wwpdb.org) находят структуру ПНФ с необходимыми параметрами (организм: Е. coli; метод: дифракция рентгеновских лучей 2,1 Å);

2) С помощью программы AutoDockTools-1.5.6 проводят подготовку белка к докингу. Для этого добавляют полярные водородные связи, заряды Коллмана и сохраняют файл в формате pdbqt.

Подготовка лиганда к докингу:

1) В программе Chem3D Pro 12.0 строят структуру соединения, при этом используют команды ММ2 Minimize и ММ2 Dynamics и сохраняют файл в формате pdb;

2) В AutoDockTools-1.5.6 используют команду «ligand», которая характеризует соединение на образование различных типов связи с белком, и сохраняют файл в формате pdbqt.

Процесс докинга:

1) Для проведения докинга выбирают пространство, которое соответствует каталитическому сайту белка, используя для этого команду «Grid Вох», и сохраняют файл в формате txt;

2) В текстовом файле «configurations» заполняют все необходимые данные (energy range=4; exhaustiveness=100; координаты и размеры «Grid Вох»);

3) Запускают процесс докинга с помощью AutoDockVina через командную строку, указав путь на папку со всеми сохраненными тестовыми файлами и файлами формата pdbqt.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии. Предложен способ химико-ферментативного получения кладрибина и его очистки от примесей рекомбинантного фермента. Получение кладрибина осуществляют методом ферментативного трансгликозилирования 2-хлор-6-азидопурина с последовательной двухстадийной конверсией азидогруппы, позволяющей извлечь целевой продукт экстракцией из водной фазы. Изобретение обеспечивает проведение ферментативной реакции в гомогенной среде и высокую степень очистки конечного продукта от примесей рекомбинантного фермента. 1 з.п. ф-лы, 6 ил., 9 пр.

1. Способ получения кладрибина: 2-хлор-2'-дезоксиаденозина посредством ферментативного трансгликозилирования с последующей постадийной химической конверсией азидогруппы включающий:

а) ферментативное трансгликозилирование 2-хлор-6-азидопурина в присутствии пуриннуклеозидфосфорилазы E.coli при комнатной температуре, где в качестве гликозид-донора используют 7-метил-2'-дезоксигуанозин;

б) реакцию циклоприсоединения фенилацетилена, или 4-фторфенилацетилена, или 3-фторфенилацетилена, или 2-фторфенилацетилена к азидогруппе продукта, полученного на стадии (а), катализируемую солями меди Cu (II): хлоридом меди (II), или сульфатом меди (II), или хлоридом меди (I), или бромидом меди (I), или йодидом меди (I), в присутствии аскорбата натрия в качестве восстановителя солей меди (II);

в) выделение продукта реакции, полученного на стадии (б) экстракцией органическим растворителем: этилацетатом, хлороформом, метиленхлоридом;

г) реакцию аммонолиза продукта, выделенного на стадии (в), концентрированным водным раствором аммиака с добавлением этанола или смесью вода: 8М NH₃/MeOH с последующим упариванием реакционной смеси и очисткой кладрибина прямой хроматографией на силикагеле или обращённо-фазовой хроматографией на силикагеле C₁₈.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что экстракция, проводимая на стадии (в), является также очисткой от белковых примесей, а именно от пуриннуклеозидфосфорилазы E.coli.