Это изобретение относится в целом к способам выделения рекомбинантных протеинов, в частности к способу выделения рекомбинантных протеинов из растворов протеинов, содержащих высокомолекулярные загрязняющие протеины.
Основание изобретения
Способы продуцирования рекомбинантных протеинов хорошо известны специалистам; гетерологические сегменты ДНК, которые кодируют данный протеин, внедряются в микроорганизмы хозяина с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Путем выращивания трансформатных микроорганизмов при условиях, которые индуцируют экспрессию протеинов, могут быть продуцированы гетерологические протеины, так же как инсулин, соматотропины, интерлейкины, интерфероны, соматомедины и им подобные.
К сожалению, гетерологические протеины, полученные при помощи трансформантных микроорганизмов, часто не являются биологически активными, так как они не образуют наждлежащую третичную структуру при транскрибировании внутри микроорганизма. Гетерологичсекие протеины имеют тенденцию к образованию аггрегатов, которые узнаются внутри клетки как "тела включения". Эти тела включения могут быть также вызваны образованием ковалентных межмолекулярных дисульфидных связей, которые соединяют вместе несколько протеиновых молекул с образованием нерастворимых комплексов. Тела включения обычно содержат большой частью гетерологические протеины и небольшую фракцию загрязняющих протеинов микроорганизма хозяина.
Были разработаны несколько процессов для экстрагирования тел включения из микроорганизмов и превращения гетерологических протеинов, содержащихся в них, в протеины, имеющие нативную биоактивность, согласующуюся с природными исходными или нерекомбинантными протеинами. Эти процессы обычно включают разрушение клетки микроорганизма, отделение клеток включения от клеточных остатков, растворение протеинов тел включения в денатурирующем агенте/детергенте, который развертывает протеин, отделяя протеины гетерологических тел включения от нерастворимых контаминантов, удаление денатурирующего агента/детергента, что дает возможность гетерологическим протеинам сворачиваться в биоактивную третичную конформацию, и отделение протеина от загрязняющих протеинов, которые остаются в растворе.
Специалистам известно несколько схем очистки рекомбинантного протеина, следующих этой общей методике: патент США N 4511503 и N 4518526-Olsen et al и патент США N 4511502 и N 4620948 Builder et al раскрывают многоступенчатые способы, в которых (I) тела включения раскрывают многоступенчатые способы, в которых (I) тела включения растворяются в сильном денатурирующем агенте (2), нерастворимые загрязнители удаляются из раствора солюбилизированных протеинов, (3) сильный денатурирующий агент замещается на слабый денатурирующий агент, (4) протеин получает возможность сворачиваться путем окисления сульфгидрильных групп в дисульфидные связи, используя молекулярный кислород и катализатор, обычно катионы металлов или тетратионат натрия, и (5) протеин отделяется от других загрязняющих протеинов при помощи методик мембранного разделения или хроматографических методик.
Raush et al, патент США N 4,677,196, включенный здесь в качестве ссылки, раскрывает особый способ очистки и активации протеинов, который представляет собой вариант общей схемы, описанной выше. Способ включает в себя солюбилизацию тел в SDS, удаление избытка SDS из раствора, используя диализ или другую подходящую методику, хроматографирование SDS-протеинового раствора на ионообменной смоле для выделения протеина.
Все эти известные методики имеют общую проблему. Полученный протеиновый раствор, когда удается детергент/денатурирующий агент, содержит рекомбинантный протеин, загрязняющие протеины с низким молекулярным весом, непротеиновые загрязнители, и загрязняющие протеины с высоким молекулярным весом; загрязняющие протеины с высоким молекулярным весом большей частью представляют собой димеры, олигомеры и агрегаты рекомбинантного протеина, но также включают нерекомбинантные протеины клеточной жизнедеятельности. Часто трудно, требует больших затрат времени и дорого отделять рекомбинантный протеин от этих загрязнителей, особенно рекомбинантных протеиновых димеров, олигомеров и агрегатов. Методики хроматографического и мембранного разделения могут быть эффективными для отделения рекомбинантных протеинов, но являются громоздкими, длинными, дорогими и часто дают низкие процентные выхода выделения протеина.
Новые и улучшенные способы для легкого, быстрого и недорогого выделения рекомбинантных протеинов с высокими выходами из растворов, содержащих протеиновые загрязнители с высоким молекулярным весом, являются поэтому необходимыми.
Фиг. 1-4 являются графическим представлением, показывающим влияние концентрации на выделение свиного соматотропина и отношение полимер/мономер (P/M), определенное методом гель-проникающей хроматографии (GPC).
Таким образом, предметом настоящего изобретения является обеспечение нового способа для легкого, быстрого и недорогого выделения с высоким выходом рекомбинантных протеинов из протеиновых растворов, содержащих загрязняющие протеины с высоким молекулярным весом.
Другим предметом настоящего изобретения является обеспечение удаления высокомолекулярных загрязняющих протеинов из раствора рекомбинантного протеина, тем самым позволяя легко, быстро и недорого выделить рекомбинантных протеин.
Эти и другие цели достигаются путем прямого добавления амина или четверичных аммониевых соединений к растворам, содержащим высокомолекулярные загрязняющие протеины и рекомбинантный протеин в количествах, достаточных для селективного осаждения высокомолекулярных загрязняющих протеинов. Соединения вызывают предпочтительное осаждение протеинов, имеющих молекулярный вес, больший примерно в полтора раза, чем молекулярный вес рекомбинантного протеина, особенно димеров рекомбинантного протеина, олигомеров и агрегатов, имеющих молекулярный вес, больший примерно в 1,5 раза, чем молекулярный вес рекомбинантного протеина. Осадки отделяются от раствора, причем остаются рекомбинантный протеин, низкомолекулярные загрязняющие протеины и другие непротеиновые загрязнители в растворе. Рекомбинантный протеин выделяется из раствора с использованием известных методик и обрабатывается для получения желаемого протеинового продукта.
В предпочтительном воплощении амин или четвертичное аммониевое соединение добавляется непосредственно к раствору в количествах, достаточных для получения раствора с концентрацией 0,01-2 объемных процента. Загрязняющие высокомолекулярные протеины осаждают и удаляют из раствора при помощи обычных методик, таких как фильтрование, центрифугирование и тому подобные. Полученный в результате протеиновый раствор, содержащий рекомбинантный протеин, загрязняющие протеины с низким молекулярным весом и другие непротеиновые загрязнители обрабатываются далее с использованием обычных методик, таких как хроматография, для выделения рекомбинантного протеина.
Другие цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения станут ясными из нижеследующего детального описания изобретения.
Термин "рекомбинантный протеин", используемый здесь, определяет протеин, который желают выделить в относительно чистом виде и включает протеины, имеющие аминокислотную последовательность нативных протеинов и их аналоги и "muteins", имеющие замещенные, удаленные, перемещенные или другим образом модифицированные последовательности.
Термин "рекомбинантный соматотропин" (rST), используемый здесь, включает рекомбинантные протеины, имеющие аминокислотную последовательность нативного соматотропина, аминокислотные последовательности в основном аналогичные ему, или их аббривиатированный вид последовательности, и их аналоги и "muteins", имеющие замещенные, удаленные, перемещенные или другим образом модифицированные последовательности. В частности, rST, используемый здесь, включает протеин той же самой последовательности, что pST, но имеющий аминокислоты, удаленные из его аминотерминального конца. Примеры таких протеинов включают, но не ограничиваются, дельта-7 рекомбинантный свиной соматотропин, дельта-4 рекомбинантный бычий соматотропин и тому подобное.
Термин "загрязняющий протеин с высоким молекулярным весом" или "протеиновый загрязнитель с высоким молекулярным весом", используемый здесь, относится к протеинам, имеющим молекулярный вес, больший примерно в 1,5 раза, чем молекулярный вес рекомбинантного протеина.
Термин "загрязняющие протеины с низким молекулярным весом" или "протеиновые загрязнители с низким молекулярным весом", используемый здесь, относится к протеинам, имеющим молекулярный вес меньше примерно в 1,5 раза, чем молекулярный вес рекомбинантного протеина.
Термин "непротеиновые загрязнители", используемый здесь, относится здесь к относительно низкомолекулярным веществам, таким как осаждающие агенты, солюбилизирующие агенты, окислительные агенты, восстанавливающие агенты и тому подобные, которые обычно находятся в протеиновом растворе.
Согласно настоящему изобретению обеспечивается способ для выделения рекомбинантного протеина из протеинового раствора, содержащего протеиновые загрязнители с высоким молекулярным весом. Способ включает в себя добавление амина или четвертичных аммониевых соединений непосредственно к раствору, содержащему загрязняющие протеины с высоким молекулярным весом и рекомбинантный протеин в количествах, достаточных для селективного осаждения высокомолекулярных протеиновых загрязнителей. Амины или четвертичные аммониевые соединения предпочтительно вызывают осаждения протеинов, имеющих молекулярный вес, больше примерно в 1,5 раза,чем молекулярный вес рекомбинантного протеина, особенно димеры рекомбинантного протеина, олигомеры и агрегаты, имеющие молекулярный вес примерно в 2 раза выше, чем молекулярный вес рекомбинантного протеина. Способ обеспечивает улучшенный метод легкого, быстрого и недорогого выделения с высокими выходами рекомбинантных протеинов из раствора, содержащих протеиновые загрязнители с высоким молекулярным весом. В предпочтительном воплощении, способ обеспечивает выделение рекомбинантных соматотропинов (молекулярный вес примерно 20,000) путем непосредственного добавления амина или четвертичных аммониевых соединений к растворам, содержащим загрязняющие протеины с высоким молекулярным весом и рекомбинантные соматотропины в количествах, достаточных для селективного осаждения протеиновых загрязнителей с высоким молекулярным весом. Амин или четвертичные аммониевые соединения вызывают осаждение протеинов, имеющих молекулярный вес больше примерно в 1,5 раза, чем молекулярный вес рекомбинантного соматотропина (молекулярный вес, больший чем примерно 30,000), особенно димеров рекомбинантного соматотропина, олигомеров и агрегатов, имеющих молекулярный вес, больший примерно в 2 раза, чем молекулярный вес рекомбинантного соматотропина (молекулярный вес примерно 40,000 и выше). Представленный способ поэтому обеспечивает метод для отделения рекомбинантного соматотропина от его бионеактивных димеров, олигомеров и агрегатов.
Растворы, содержащие рекомбинантный протеин, непротеиновые загрязнители, протеиновые загрязнители, протеиновые загрязнители с высоким молекулярным весом, и протеиновые загрязнители с низким молекулярным весом, полезные в настоящем изобретении, получаются при помощи методик, известных специалистам. Обычно протеиновые тела включения, которые были продуцированы рекомбинантными микроорганизмами, обрабатываются для удаления липидов, и клеточные остатки и получаемые в результате относительно чистые тела включения, содержащие рекомбинантный протеин и загрязняющие протеины, особенно рекомбинантные протеиновые димеры с высоким молекулярным весом, олигомеры и агрегаты, солюбилизируются в сильном денатурирующем агенте или детергенте, таком как гуанидин гидрохлорид, додецилсульфат натрия (SDS), тритон и тому подобные.
Получаемый в результате протеиновый раствор отделяется от любых нерастворимых материалов и сильный денатурирующий агент или детергент удаляется для получения протеинового раствора, содержащего рекомбинантный протеин, имеющий его нативную биоактивную конфигурацию, протеиновые загрязнители с высоким молекулярным весом, инзкомолекулярные загрязняющие протеины и другие непротеиновые загрязнители. Такие растворы обычно содержат всего от примерно 1 50 мг/мл протеина и от примерно 0,05 4 мг/мл рекомбинантного протеина.
Амин или четвертичные аммониевые соединения добавляются к этому раствору согласно настоящему изобретению для осаждения загрязненных протеинов с высоким молекулярным весом.
Высокомолекулярные загрязняющие протеины, которые осаждают добавлением амина или четвертичных аммониевых соединений, удаляются из раствора общеизвестными способами, такими как фильтрация, центрифугирование и тому подобные. Получаемый в результате протеиновый раствор, содержащий рекомбинантный протеин, загрязняющие протеины с низким молекулярным весом, и другие непротеиновые загрязнители, если вообще имеются, далее обрабатываются, как необходимо, для удаления низкомолекулярных загрязняющих протеинов и других непротеиновых загрязнителей, таких как осаждающие агенты, солюбилизирующие агенты, окисляющие агенты, восстанавливающие агенты и тому подобные. Обычно такие непротеиновые загрязнители удаляются путем диализа, хроматографии или других подходящих способов, тогда как низкомолекулярные загрязняющие протеины отделяются от протеина путем ионообменной или других видов хроматографии.
Протеиновый раствор далее обрабатывается для получения протеина или протеиновой композиции, пригодной для ее предполагаемого использования, обычно путем лиофилизации. Эти методы хорошо известны специалистам.
Амин или четвертичное аммониевое соединение, полезное в настоящем изобретении, выбираются из соединений, имеющих структуру:
(1) (R1R2R3R4)+ NX-
в которой R1, R2, R3 и R4, которые могут быть одинаковыми или различными, выбираются из группы, состоящей из линейного или разветвленного C8-C20-алкила, линейного или разветвленного C8-C20 замещенного алкила и водорода при условии, что по крайней мере один среди R1, R2, R3 и R4 не является водородом; и X представляет собой анион, такой как хлорид, бромид, иодид, сульфат, сульфонат, нитрат, ацетат и тому подобное или
где R1 выбирается из группы, состоящей из линейного или разветвленного C8-C20 алкила; R2-R6 выбираются из группы, состоящей из линейного или разветвленного C8-C20-алкила, линейного или разветвленного C8-C20 замещенного алкила и водорода; R' представляет собой алкиленовую или ареновую группу; и X является анионом, таким как хлорид, бромид, иодиод, сульфат, сульфонат, нитрат, ацетат и тому подобное; или
где R1, R2, R3 и R4, которые могут быть одинаковыми или различными, выбираются из группы, состоящей из линейного или разветвленного C8-C20 алкила, линейного или разветвленного C8-C20 замещенного алкила или водорода при условии, что по крайней мере один среди R1, R2, R3 и R4 не является водородом; R' представляет собой алкиленовую или ареновую группу, и X представляет собой анион, такой как хлорид, бромид, иодид, сульфат, сульфонат, нитрат, ацетат и тому подобное; или
где R1, R2, R3, R4 и R5, которые могут быть одинаковыми или различными, выбираются из группы, состоящей из линейного или разветвленного C8-C20 алкила, линейного или разветвленного замещенного алкила или водорода при условии, что по крайней мере один среди R1, R2, R3 и R4 не является водородом; R' представляет собой алкиленовую или ареновую группу и X является анионом, таким как хлорид, бромид, иодид, сульфат, сульфонат, нитрат, ацетат и тому подобное; или
где представляет собой группу, полученную из Tallow R2, R3, R4 и R5, которые могут быть одинаковыми или различными, выбираются из группы, состоящей из линейного или разветвленного C8-C20 замещенного алкила или водорода; R' является алкиленовой или ареновой группой; и X-анион, такой как хлорид, бромид, иодид, сульфат, сульфонат, нитрат, ацетат и т.п.
Предпочтительные соединяют включают додециламин гидрохлорид, триметилоктадециламмоний хлорид, триметилгексадециламмоний хлорид, триметилдодециламмоний хлорид, диметилдиаммоний хлорид и DUOMAC-T (N-tallow - 1,3-диамминопропан диацетат). Наиболее предпочтительные соединения включают DUOMAC-T (N-tallow 1,3-диаминопропан диацетат) и триметилдодециламмоний хлорид.
Хотя количество амина или четвертичного аммониевого соединения, необходимого для того, чтобы вызвать осаждение, различается в зависимости от концентрации протеина, протеиновых характеристик, добавленного соединения и тому подобного; амин или четвертичные аммониевые соединения обычно добавляются к раствору в количестве, достаточном для получения концентрации раствора от примерно 0,01 объемных процентов соединения, предпочтительно раствора от примерно 0,01 0,5 объемных процентов.
Рекомбинатными протеинами, выделяемыми при использовании способа настоящего их обретения, может быть любой протеин, имеющий молекулярный вес более, чем примерно 5000, которые продуцируются рекомбинатными микроорганизмами обычно в телах включения. Эти протеины включают соматотропины, инсулины, соматомедины, соматостатины, пролактины, плацентарные лактогены и т.п.
Наиболее предпочтительно рекомбинатные соматотропины (молекулярный вес примерно 20,000) выделяются с использованием способа настоящего изобретения. Рекомбинатный соматотропин может быть рекомбинатным соматотропином из любых видов, но предпочтительными являются свиной, бычий, птичий, овечий или человеческий рекомбинатный соматотропины, наиболее предпочтительно свиной или бычий рекомбинатный соматотропин.
Способы продуцирования этих рекомбинатных протеинов хорошо известны специалистам, например: патенты США N 4604359 и N 4332717 описывают методы для получения человеческого рекомбинатного соматотропина; патент США N 4431739 раскрывает способ получения рекомбинатных соматотропинов; публикация заявка на Европейский патент N 104920 раскрывает способ продуцирования рекомбинатного свиного соматотропина; патент США N 4443359 описывает метод подуцирования рекомбинатного бычьего соматотропина; Schoner, Biotechnology, 3/2/: 151-54, описывает метод получения рекомбинатного соматотропина, и Buell, Nucleic Asid Res. 13,1923 38 (1985) раскрывает способ получения рекомбинатного соматотропина C.
Также, публикация заявки на Европейский патент N 0103395 описывает конструкцию трансформантного штамма E.coli, содержащего первую плазму, которая кодирует дельта 9 (Ser) бычий соматотропин (соматотропин без его 9 N-терминальных аминоксилот и имеющий дополнительный сериновый остаток при N-конце) при контроле лямбда PL промотор-оператор и который имеет Shine-Dalgamo область, полученную из бактериофага mu. Трансформант также содержит вторую плазмиду, рс1857, которая кодирует продуцирование рс1857 чувствительного к температуре репрессорного протеина. Репрессорный протеин может быть инактивирован путем повышения температуры до примерно 42oC, индуцируя тем самым экспрессию дельта 9 (Ser) бычьего соматотропина. Трансформаторный штамм этого типа, E.coli HB101 (PL-mu-дельта 9 (Ser) бычий соматотропин и рс1857) был депонирован American Type Culture Collection (АТСС), Rocxuille, MD и определен N 53030.
Конструкция аналогичного трансформаторного штамма, который кодирует продуцирование дельта 7 свиного соматотропина (свиной соматотропин без его первых 7N-терминальных аминокислот) описывается в публикации заявки на Европейский патент N 0104920. Трансформаторный штамм этого типа, E.coli HB101 (Pl-mu-дельта 7 свиной соматотропии и рс1857) задепонирован АТТСС и присвоен номер N 53031.
Штаммы 53030 и 53031 являются "profilic" продуцентами дельта 9 (Ser) бычьего соматотропина и дельта 7 свиного соматотропина соответственно. В обоих случаях экспрессированный протеин изолируется в клетках в виде нерастворимых неактивных тел включения, которые видны под микроскопом. Другие способы для многих аналогичных протеинов известны специалистам.
В предпочтительном воплощении раствор рекомбинатного соматотропина, содержащий примерно 1 50 мг/мл всего протеина и примерно 0,05 2 мг/мл рекомбинатного соматотропина обрабатывается примерно 0,08 0,12% Duomac-T для осаждения протеиновых загрязнителей с высоким молекулярным весом. Осадок удаляется путем центрифугирования и рекомбинатный соматотропин выделяется из полученного раствора, причем используется общепринятые средства, как описано выше.
Хотя описанный выше способ выделения направлен на выделение рекомбинатных протеинов, способ равно приложим и к отделению и выделению нерекомбинатных протеинов. Например раствор, содержащий смесь (1) и "полезного или необходимого" протеина", (2) высокомолекулярных протеинов (молекулярный вес больше примерно в 1,5 раза, чем молекулярный вес полезного протеина) и (3) протеины с низким молекулярным весом (молекулярный вес меньше примерно в 1,5 раза, чем молекулярный вес полезного протеина), обрабатывается согласно настоящему изобретению для осаждения протеинов с высоким молекулярным весом и таким образом отделения протеинов с высоким молекулярным весом от протеинов с низким молекулярным весом и полезного протеина. Протеины с высоким молекулярным весом отделяются от раствора и отбрасываются или по желанию обрабатываются далее; протеины с высоким молекулярным весом могут быть выделены из осадка путем повторного растворения осадка и выделения протеинов из раствора.
Полезный протеин отделяется от протеинов с низким молекулярным весом при помощи общепринятых методик и далее при желании обрабатывается для получения протеинового продукта. Протеины с низким молекулярным весом, которые были отделены от полезного протеина или выбрасываются, или далее обрабатываются по желанию. Обычно протеины с низким молекулярным весом могут быть отделены от полезного протеина при помощи хроматографии или другими способами, подходящими для отделения протеинов, имеющих подобные молекулярные веса. Специалистам хорошо известно много способов отделения таких протеинов, которые одинаково приложимы в настоящем изобретении.
Изобретение описывается в общем, нижеследующие примеры даются как частные воплощения изобретения и для демонстрации практического применения и преимуществ. Понятно, что примеры даются для иллюстрации и не предполагают ограничить спецификацию или формулу изобретения. В частности, тела включения, используемые в экспериментах, были получены из трансформированных штаммов E.coli, которые продуцируют дельта-7 свиной соматотропин. Тела включения были выделены из E.Coli штамма хозяина HB101 трансформированные первой плазмидой (Pl-mu-дельта-7 рSТ), кодирующей дельта-7 rST, и второй плазмидой, (рс1857), кодирующей чувствительный к температуре протеин репрессии лямбда фага. Много других штаммов микроорганизмов продуцируют тела включения, содержащие много типов рекомбинатных протеинов, которые будут функционировать в настоящем изобретении. Аналогично, способы выращивания этих микроорганизмов для продуцирования тел включения хорошо известны специалистам.
Пример 1. Рекомбинатный свиной соматотропин (гр.ST) был выделен из тел включения микроорганизма путем (1) растворения тел включения в додецилсульфате натрия (SDS), (2) выделения нерастворимых загрязнителей из раствора, и (3) выделения SDS из раствора, чтобы позволить гр.ST принять биоактивную конфигурацию. Полученный в результате протеиновый раствор содержал гр. ST, высокомолекулярные протеиновые загрязнители; низкомолекулярные загрязняющие протеины и другие непротеиновые загрязнители. Этот раствор был подвержен процессу мембранного разделения для очистки. Мембранное разделение удаляло некоторые высокомолекулярные примеси, но значительное количество высокомолекулярных примесей оставалось; была необходима дальнейшая очистка.
20 миллилитров (мл) образцы раствора протеина, содержащие протеиновые загрязнители гр.ST с высоким молекулярным весом, загрязняющие протеины с низким молекулярным весом и другие непротеиновые загрязнители, были добавлены в 50 мл стаканы, которые были помещены в заполненную льдом емкость для поддержания температуры между 5 10oC. Предварительно определенное количество 0,1 1,0% раствора аминного реагента (гидрохлорида додециламина, и коммерчески доступные соединения аминов А-1 и А36А) было добавлено к образцу с использованием 1 мл или 3 мл шприца. Реагенты в каждом стакане были осторожно перемешаны, используя покрытие тефлоном мешалки в течение примерно 1 3 минут. Осадки образовывались почти немедленно; более медленная скорость добавления (по каплям) осадителя давала более чистый продукт (более низкое соотношение Р/М). Аналогично более высокая температура (25oC) давала более высокое выделение. (Однако в действительности на практике операции при более высокой температуре могут быть неосуществимыми из-за проблем, связанных с микробным растром). Содержимое каждого стакана было центрифугировано и сулернант был отфильтрован через 0,2 микронный фильтр, чтобы получить образец для гельпроникающей хроматографии (BPC).
Оставленные на ночь центрифугированный сулернант не показывал никакого осаждения, свидетельствуя о том, что реакция прошла полностью. Супернатант был проанализирован с использованием гель-проникающей хромотографии и данные были затем использованы для вычисления pST-выделения и отношения полимер/мономер (Р/М) в супернантном продукте.
Результаты показывают, что было выделено примерно 90% с почти нулевым отношением Р/М с примерно 0,05% (объемных жидкости) аминного реагента. Коммерческие аминные соединения Р-14В и 52-267 были также испытаны, но от них отказались и предпочли гидрохлорид додециламина и А-1 либо из-за более низкого выделения, более высокого соотношения Р/М, либо из-за требуемой дозировки. Испытание соединения представлены в таблице 1.
Пример 2. Отобранные аминные соединения А-1 и гидрохлорид додециламина их примера 1 и несколько других, включая триметил додецил -, гексадецил и октадецил аммонийхлориды, Duo-mac-T(N-tallow-1,3- диаминопропан диацетат), aR-QUaD-2c-75(диметилдикокоаммоний хлорид) и гексиламин были испытаны при различных концентрациях на нескольких "pilot"-растительных образцах, которые не подвергались мембранной очистке. За исключением гексиламина, каждый из перечисленных выше реагентов приводили к осаждению протеина. Однако отличались селективность и выделение pST. Среди додецил -, гексадецил -, и октадециламмоний хлоридов, концентрация реагента, требуемого для селективного осаждения pST-полимера была функцией длины углеводородной цепи, при которой при 18 атомах углерода октадецильного соединения требовалось только 0,02% (по объему раствора), тогда как для 16 углеродных атомов требуется 0,03% и примерно 0,04-0,06% для 12 углеродных атомов додецильного соединения. При том же самом соотношении P/M в продукте, pST-выделение было наивысшим с триметилдодециламмоний хлоридом (ТДАС).
Из всех испытаний аминных соединений, ДИОМАС-Т в концентрационной области между 0,08-0,12% оказался наиболее многообещающим для показателей селективности и выделения.
Таблица 2 представляет сумму данных по испытанию осаждения, полученных при использовании ДИОМАС-Т и ТДАС с различными группами рекомбинантного протеина. Выделение (75-82%) является более эффективным, чем эффективность выделений при использовании методик мембранной очистки. Кроме того, процесс преципитации настоящего изобретения много проще и свободен от трудностей. Так как продукты обычно очень ценные, небольшие улучшения в эффективности выделения дают большую экономическую выгоду. Влияние концентрации ДИОМАС-Т на pST-выделение и соотношение Р/М было детально исследовано для нескольких других типов неочищенного рекомбинантного протеина. Как показывают некоторые типичные результаты, представленные на рисунке 1, имеется связь между pST-выделением и соотношением Р/М, то есть более эффективное выделение связывается с более высоким соотношением Р/М. Тогда как желаемое соотношение Р/М в предварительно очищенном продукте составляет примерно 0,5 или меньше, концентрация ДИОМАС-Т должна быть выбрана, чтобы удовлетворить этому условию с наиболее высокой возможной эффективностью выделения.
pST супернатант, полученный после осаждения ДИОМАС-Т был проанализирован при помощи анализа тканевого связывания, изоэлектрического фокусирования (IEF) и жидкостной хроматографии с высоким давлением (HPLC). Анализ тканевого связывания показал, что 98% pST по отношению к стандартному образцу pST было активным, причем предлагается, что pST не был денатурирован. Аналогично испытания IEF и HPLC не показали никакой разницы между обработанными ДИОМАС-Т и неотработанными образцами, что свидетельствует о неизменной структуре pST.
Очевидно возможны много модификаций и вариантов настоящего изобретения в свете описанных выше методик. Поэтому следует понять, что внутри сферы прилагаемых пунктов формулы изобретения, изобретение может быть использовано на практике иначе, чем описано в настоящей спецификации.
Использование: биотехнология, биохимия. Сущность изобретения: рекомбинантный соматотропин выделяют из раствора, содержащего примесные белки и другие примеси, путем непосредственного добавления амина или соединений четвертичного аммония к раствору в количестве, достаточном для селективного осаждения примесных белков с высоким молекулярным весом. Осадок белков с высоким молекулярным весом удаляют, а затем раствор обрабатывают для удаления протеинов с низким молекулярным весом и других непротеиновых примесей. 5 з. п. ф-лы. 2 табл. 4ил.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный соматотропин представляет собой соматотропин быка, свиньи, птиц, овцы или человека.
| Патент США N 4620948, кл | |||
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| Патент США N 4511502, кл | |||
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
